PRT-712.02-004 V9 NMP Colif y E.coli_

NMP PARA LA DETERMINACION DE
COLIFORMES Y ESCHERICHIA COLI EN
ALIMENTOS
Sección Microbiología
de Alimentos
1.
PRT-712.02-004
Fecha emisión:
23-08-2002
Revisión: 9
Fecha revisión:
20-01-2012
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OBJETIVO
Estimar la densidad de bacterias del grupo coliformes, como indicador sanitario.
2.
CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE
Aplicar este procedimiento a todas las muestras de alimentos en las cuales se presume que tienen
baja contaminación microbiana y a las cuales según reglamento sanitario o a petición del
interesado se requiere este análisis.
3.
FUNDAMENTO
Los métodos utilizados en la determinación de E. coli, coliformes totales y coliformes fecales
como microorganismos indicadores de la calidad sanitaria de agua o como indicador de las
condiciones sanitarias en el procesamiento de alimentos, se basan en la fermentación de la
lactosa. El método de número más probable NMP, es un método estadístico, compuesto por una
etapa presuntiva y una confirmativa. El ensayo consiste en sembrar diluciones seriadas de la
muestra en medios líquidos, basándose en la combinación de tubos positivos se puede estimar el
número de microorganismos presentes por gramo de alimento, con el uso de la tabla estadística
aportada por la referencia.
4.
REFERENCIAS
4.1
Bacteriological Analytical Manual online. September 2002. Capítulo 4 puntos C, D, E y F
4.2
Bacteriological Analytical Manual online, apéndice 2 “Most Probable Number from Serial
Dilutions”, Tabla Nº1, Robert Blodgett, Octubre 2010.
5.
TERMINOLOGÍA
5.1
Grupo coliformes: El grupo coliformes incluye bacilos gram negativos, aeróbios y
anaeróbios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa formando ácido y gas
dentro de 48 hrs. a 35ºC. Este grupo incluye a los géneros: Escherichia, Citrobacter,
Klebsiella y Enterobacter.
5.2
Grupo coliformes fecales: Coliformes fecales se definen como bacilos gram negativos
aeróbios y anaeróbios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa formando
ácido y gas dentro de 24 hrs. a 45,5 ± 0,2ºC para análisis de alimentos.
5.3
Escherichia coli: E. coli es una bacteria cuyo hábitat es el intestino del hombre y animales
y debido a esto se ha usado como índice de contaminación fecal. Dentro del grupo
coliformes, es el microorganismo de mayor significado sanitario. Su recuperación se hace
de acuerdo a la metodología establecida para la enumeración de coliformes.
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6.
MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS
6.1
Equipos
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Incubadora a 35º ± 1ºC
Baño de agua termorregulado a 45,5º ± 0,2º C con agitación y con cubierta
6.2
Materiales
Sensor de temperatura calibrado a 35 ± 0,5ºC
Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 mL
Placas Petri de 100 mm de diámetro
Botellas de dilución con capacidad para 100 mL, de vidrio borosilicato con tapas
herméticas
Tubos de fermentación de 18 x 180 mm y 16 x 160 mm
Asa de 3 mm de diámetro
Propipeta
6.3
Medios de cultivo y reactivos
Caldo Lauril Sulfato Triptosa (LST)
Caldo Bilis Verde Brillante 2% (BVB)
Caldo EC
Agar Rojo Neutro Cristal Violeta (RNCV)
Agar Levine Eosina Azul de Metileno (LEAM)
Caldo Triptona
Caldo RM-VP
Caldo citrato Koser
Agua de Dilución Buffer Fosfato
Agua Peptonada 0,1%
Reactivo Kovacs
Rectivos solución de α Naftol y solución KOH al 40 %
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Reactivos Tinción de Gram
Indicador Rojo de Metilo
Agar TSI
Agar LIA
Agar MIO
6.4
Cepas Control
Control positivo: cepa de Escherichia coli ATCC 25922
Control negativo: cepa de Staphylococcus aureus. ATCC 6538
Control negativo (coliformes fecales): cepa de Enterobacter aerogenes ATCC 13048
7.
DESARROLLO
7.1
TEST PRESUNTIVO PARA COLIFORMES
7.1.1 Preparar la muestra y diluciones, según PRT-712.02-002 “Procedimiento Procesamiento
de las muestras de alimentos y agua para análisis microbiológico”, ítem 7.4.2.1. Derivar
al laboratorio según PRT -712.02-001 “Procedimiento Recepción de las muestras para
análisis microbiológico”.
7.1.2 Una vez recibida la dilución 1:10 en el laboratorio, agitar en Vortex por 7 segundos,
pipetear 10 mL de la dilución inicial y agregar 90 mL de diluyente y así sucesivamente
para realizar las diluciones 1:100 y 1:1000. Inocular 9 tubos de caldo LST (3 diluciones
y 3 tubos por dilución). Dejar descansar el borde de la pipeta contra el tubo y drenar por 2
a 3 segundos.
3 tubos con 1 mL de la dilución 1:10, preparada en 7.1.1.
3 tubos con 1 mL de la dilución 1:100
3 tubos con 1 mL de la dilución 1:1000
7.1.3 Agitar suavemente la gradilla para mezclar la muestra con el medio de cultivo. El tiempo
entre la preparación de la muestra y su inoculación en un medio no debe ser superior a 15
minutos.
7.1.4 Incubar a 35º ± 1ºC por 24 horas y observar la formación de gas, si existen tubos que no
presentan formación de gas, incubar nuevamente hasta completar 48 h. y observar la
formación de gas, en los tubos de fermentación. Si se detecta que el equipo no ha
funcionado dentro del rango de temperatura indicado, el análisis debe ser invalidado y se
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debe iniciar procedimiento de gestión control de trabajo no conforme, según el PRG700.00-006.
7.1.5 Se deben incluir cultivos control en la incubadora, se usa Escherichia coli como control
positivo y Staphylococcus aureus como control negativo. Se debe inocular siempre el
control negativo antes del positivo. Incluir tubos sin inocular para realizar control de
esterilidad de medios de cultivo y placas Petri abiertas y cerradas para control de
ambiente.
7.1.6
En la eventualidad de que los controles no se comportasen de manera normal, es decir, si
la cepa de E. coli no se presenta con formación de gas, la cepa de S. aureus presentase
formación de gas o el control de esterilidad presentase desarrollo, se debe invalidar el
resultado e iniciar procedimiento de control de trabajo no conforme, según el PRG700.00-006.
7.1.7 La presencia de gas o efervescencia significa un Test Presuntivo positivo para coliformes
y se registra como positivo, cualquiera sea la cantidad de gas producido. Ausencia de gas
a las 48 horas significa un Test Presuntivo negativo para coliformes.
7.1.8 Anotar los resultados del test presuntivo en el registro RG-712.00-072, de los cultivos
control en el registro RG-712.00-004, de la esterilidad de los medios en el registro RG712.00-006 y los controles ambiente en el registro RG-712.00-009.
7.2
TEST CONFIRMATIVO PARA COLIFORMES
7.2.1 Todos los tubos que resulten positivos a las 24 o 48 horas en el Test Presuntivo se
transfieren a caldo BVB para confirmar coliformes.
7.2.2 Mezclar por agitación el tubo del test presuntivo y transferir un inóculo con un asa de 3
mm. de diámetro, si se ha formado una película en la superficie del medio se debe evitar
tomar ésta en el inoculo, a tubos de fermentación conteniendo caldo BVB. Se debe tener
la precaución de enfriar el asa para asegurar que se transfiere un inóculo de cultivo viable.
7.2.3 Incubar los tubos con caldo BVB a 35ºC por 48 +/- 2 hrs.
7.2.4 Se deben incluir cultivos control en la incubadora, se usa Escherichia coli como control
positivo y Staphylococcus aureus como control negativo. Se debe inocular siempre el
control negativo antes del positivo.
7.2.5 Al término del período de incubación se observa la formación de gas o efervescencia en
los tubos de fermentación de caldo BVB. Si los controles positivo y negativo no se
comportasen como tal o si se detecta que el equipo no ha funcionado dentro del rango de
temperatura indicado repetir el análisis desde el punto 7.2.2.
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7.2.6 La presencia de gas en los tubos de fermentación de caldo BVB significa test
confirmativo positivo para coliformes, ausencia de gas constituye un test negativo para
coliformes.
7.2.7 Anotar los resultados del test confirmativo en el registro RG 712.00-072 y de los cultivos
control en el registro RG-712.00-004 y RG-712.00-006.
7.3
METODO CALDO EC PARA COLIFORMES FECALES Y CONFIRMACIÓN
PARA Escherichia coli
7.3.1 Todos los tubos que resulten positivos a las 24 o 48 horas en el Test Presuntivo se
transfieren a caldo EC para confirmar coliformes fecales. y consecutivamente E. coli.
7.3.2 Mezclar por agitación el tubo del test presuntivo y transferir un inóculo con un asa de 3
mm. de diámetro o con aplicador de madera, a tubos de fermentación conteniendo caldo
EC. Se debe tener la precaución de enfriar el asa para asegurar que se transfiere un
inóculo de cultivo viable.
7.3.3 Los tubos con caldo EC se incuban en un baño de agua con cubierta a 45.5 º ± 0,2º C por
24 horas +/- 2 horas, examinar si se produce producción de gas, si la producción de gas es
negativa incubar nuevamente hasta completar 48 +/- 2 horas. El nivel de agua del baño
debe sobrepasar el nivel de caldo dentro de los tubos.
7.3.4 Se deben incluir cultivos control en el baño de agua, se usa como control positivo una
cepa de Escherichia coli y como control negativo una cepa de Enterobacter aerogenes.
Se debe inocular siempre el control negativo antes del positivo. Incubar también medios
de cultivo sin inocular para controlar la esterilidad de los medios empleados.
7.3.5 Al término del período de incubación se observa la formación de gas o efervescencia en
los tubos de fermentación de caldo EC. Si los controles positivo y negativo no se
comportasen como tal o si se detecta que el equipo no ha funcionado dentro del rango de
temperatura indicado, repetir el análisis desde el punto 7.2.2.
7.3.6 La presencia de gas o efervescencia en los tubos de fermentación de caldo EC significa
un test confirmativo positivo para coliformes fecales; la no formación de gas significa test
negativo para coliformes fecales.
7.3.7 Anotar los resultados del test confirmativo en el registro RG-712.00-072, de los cultivos
control en el registro RG-712.00-005 y de la esterilidad de los medios en el registro RG712.00-006.
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CONFIRMATIVO PARA E.coli
7.4.1 De cada tubo de caldo E.C. que presente formación de gas, transferir un inóculo a una
placa de agar LEAM para obtener colonias aisladas.
7.4.2 Incubar las placas invertidas 18 a 24 horas a 35ºC.
7.4.3 Al término del período de incubación observar las colonias sospechosas, con centro
oscuro con o sin brillo metálico en el caso de usar Agar LEAM.
7.4.4 Anotar los resultados en el registro RG-712.00-072.
7.4.5 De cada placa de agar transferir 5 colonias aisladas a un tubo de agar nutritivo o agar
standard, incubar por 18 a 24 horas a 35ºC para realizar pruebas: morfológicas mediante
Tinción de Gram según IT-712.00-066 y bioquímica utilizando las reacciones IMViC
(Indol, Rojo Metilo, Vogues Prokauer y Citrato). Repetir la inoculación en caldo LST
para confirmar la producción de gas. Alternativamente se puede realizar un API 20 E o
VITEK. Agregar TSI, LIA y MIO. Si una de las 5 colonias es identificada como positiva
para E. coli, se considera el tubo EC como positivo y no es necesario realizar pruebas a la
demás colonias.
7.5
INTERPRETACIÓN
Todos los cultivos que fermenten la lactosa con producción de gas dentro de 48 hrs. a
35ºC, aparezcan como bacilos Gram negativos no esporulados y cuyo test IMVIC sea + +
- - (biotipo 1) o - + - - (biotipo 2), son considerados E. coli.
7.6
CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS COLIFORMES TOTALES
7.6.1 La combinación de tubos positivos y/o negativos en los tests confirmativos de caldo
BVB, es referida a la Tabla Nº 2 (BAM on line, apéndice 2, tabla Nº1) y se expresa
como: NMP de coliformes/g o ml. De muestra
7.6.2. Si en vez de las porciones de muestra 0,1-0,01-0,001, se utiliza 0,01-0,001-0,0001, se lee
el resultado de la tabla y se multiplica por 10.
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7.6.3. Cuando se utilizan más de 3 series de diluciones decimales, se considera el resultado de 3
series, eligiendo la dilución más alta que da resultados positivos en los 3 tubos ensayados
y las dos diluciones siguientes. Utilizando el resultado de estas 3 series, leer en la Tabla
de N.M.P. y multiplicar por 10, 100, 1000, etc. Según las porciones de muestra
consideradas.
7.7
CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS Escherichia coli
7.7.1 Calcular el NMP de E. coli, basándose en el número de tubos de caldo EC, en que se
confirmó la presencia de E. coli en 3 diluciones sucesivas y anotar los resultados en el
registro RG-712.00-072.
Tabla Nº 1: Ejemplos de determinación de NMP en series de 3 tubos
Ejemplo
Cantidad muestra
(g. o mL. )
0,1
0,01
0,001
0,0001
0,00001
a
b
c
d
e
3/3
3/3
0/3
3/3
3/3
3/3
3/3
0/3
3/3
3/3
2/3
3/3
1/3
2/3
3/3
0/3
2/3
0/3
1/3
3/3
Número de tubos positivos / Número de tubos inoculados
0/3
0/3
0/3
1/3
3/3
Lectura
NMP
3
3
0
3
3
930
9300
30
2100
>110000
2
2
1
2
3
0
0
0
2
3
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Tabla Nº 2. Para serie de 3 tubos con 0.1, 0.01, y 0.001 g. NMP por gramo con un
95% de confianza. ((BAM on line, apéndice 2, tabla Nº1)
Tubos
NMP/g Lim. Conf.
Tubos Positivos NMP/g Lim. Conf.
Positivos
0.10 0.01
0.001
Bajo
Alto 0.10 0.01 0.001
Bajo Alto
0
0
0
<3.0
-9.5
2
2
0
21
4.5
42
0
0
1
3.0
0.15
9.6
2
2
1
28
8.7
94
0
1
0
3.0
0.15
11
2
2
2
35
8.7
94
0
1
1
6.1
1.2
18
2
3
0
29
8.7
94
0
2
0
6.2
1.2
18
2
3
1
36
8.7
94
0
3
0
9.4
3.6
38
3
0
0
23
4.6
94
1
0
0
3.6
0.17
18
3
0
1
38
8.7
110
1
0
1
7.2
1.3
18
3
0
2
64
17
180
1
0
2
11
3.6
38
3
1
0
43
9
180
1
1
0
7.4
1.3
20
3
1
1
75
17
200
1
1
1
11
3.6
38
3
1
2
120
37
420
1
2
0
11
3.6
42
3
1
3
160
40
420
1
2
1
15
4.5
42
3
2
0
93
18
420
1
3
0
16
4.5
42
3
2
1
150
37
420
2
0
0
9.2
1.4
38
3
2
2
210
40
430
2
0
1
14
3.6
42
3
2
3
290
90
1,000
2
0
2
20
4.5
42
3
3
0
240
42
1,000
2
1
0
15
3.7
42
3
3
1
460
90
2,000
2
1
1
20
4.5
42
3
3
2
1100
180
4,100
2
1
2
27
8.7
94
3
3
3
>1100
420
--
8.
8.1
8.2
8.3
8.4
8.5
9.
REGISTROS
Registro cepas control de incubadora
Registro cepas control baños de agua para análisis de coliformes fecales
Registro control de esterilidad de medios de cultivo utilizados en el análisis de
coliformes, coliformes fecales y E. coli.
Registro control de ambiente
Registro de resultados de análisis de coliformes, E. coli y Salmonella en muestras de
alimento.
ANEXOS
No Aplica