Efectos de la administración simultánea de eritropoyetina y

Resumen: M-025
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2005
Efectos de la administración simultánea de eritropoyetina y filgrastim
sobre la granulopoyesis de ratones pretratados con ciclofosfamida
Berecoechea, Carlos S. - Abraham, Raisa M. - Enacan, Rosa E. - Poletti, Oscar H. - Barrios, Lilian
Cátedra Nº 1 de Fisiología Humana- Facultad de Medicina de la Universidad Nacional del NordesteMoreno 1240.CPA W3400ACX - Corrientes – ArgentinaTE: 03783- 421355- FAX: 03783-425508- E-mail: lbarrios@med.unne.edu.ar
ANTECEDENTES
Si bien la disponibilidad para uso terapéutico de los factores de crecimiento hematopoyéticos recombinantes
eritropoyetina y filgrastim constituye una importante arma terapéutica para pacientes con patologías hematológicas u
oncológicas, su uso ha mostrado efectos dispares. Mientras algunos autores hallaron que su administración conjunta
amortigua el efecto mielodepresor producido por las drogas quimioterápicas y/ ó la irradiación en pacientes
oncológicos (1, 2), otros autores (3) no hallaron que el uso de estos factores de crecimiento mejorara la calidad de
vida y /o sobrevida mas allá del efecto de las drogas antineoplásicas en pacientes con cáncer gástrico avanzado, ni en
pacientes que estaban recibiendo quimioterapia intensiva para el tratamiento de neuroblastoma(4), entre otros.
Uno de los interrogantes que generan estos resultados es el comportamiento de progenitores comunes a varias células
sanguíneas, cuando dicha célula está siendo estimulada para aumentar dos tipos celulares diferentes mediante la
administración de dosis farmacológicas de los correspondientes factores de crecimiento recombinantes.
La administración de eritropoyetina recombinante ha demostrado producir recuperación de la anemia que acompaña al
tratamiento con quimioterapia antineoplásica en pacientes oncológicos (5).
Por otro lado
el factor estimulante de colonias de granulocitos recombinante humano (filgrastim) reduce la
morbilidad relacionada a la infección en pacientes con cáncer, aliviando la neutropenia postquimioterapìa. (6).
El objetivo del presente trabajo fue comparar el efecto sobre la granulopoyesis del tratamiento con filgrastim
(factor estimulante de colonias recombinante humano) administrado en forma individual ó en forma conjunta con
eritropoyetina recombinante humana. En nuestros estudios investigamos el comportamiento del sistema hemopoyético
in vivo, Todos los estudios se realizaron en ratones pretratados con ciclofosfamida, droga que deprime tanto la
granulopoyesis (7) como la eritropoyesis (8). Se evaluó la granulopoyesis mediante la medición del número absoluto
de neutrófilos circulantes y el contenido, en números absolutos, del compartimento de progenitores y precursores
granulopoyéticos en médula ósea femoral y bazo
MATERIAL Y METODOS
Animales: se usaron ratones hembras CF1 de 3 meses de edad con 25 a 30 g de peso corporal.
Ciclofosfamida: (Cy) (Endoxan-Asta, LABINCA) Todos los animales recibieron 100mg/Kg de ciclofosfamida disuelta
en agua destilada apirógena, vía ip, el día 0 de 1 ciclo del estudio de 20 días de duración.
Factor estimulante de colonias de granulocitos recombinante humano: ( Filgrastim). Laboratorios ROCHE: 5
viales conteniendo cada uno: 30 millones de unidades = 300 µg de filgrastim. Antes de las inyecciones, la solución que
contiene el filgrastim fue diluida con buffer salino de fosfato, pH 7.4, (PBS) conteniendo 0,1 % de albúmina bovina
sérica. Los animales fueron inyectados con 20 µg/kg/día de filgrastim vía sc, en un volumen de 100 µl/ratón,
iniciándose la administración un día después de la administración de ciclofosfamida. Se eligió la dosis de 20 ug/kg/día
de filgrastim debido a que, sí bien en pacientes neutropénicos por quimioterapia es usado con frecuencia en dosis de 2 a
10 ug/kg/día, al ser esta una molécula heteróloga para el ratón, (ya que existe solo una homología parcial entre el
filgrastim humano y murino), estimamos necesaria la administración de una dosis mayor a la empleada en seres
humanos.
Eritropoyetina recombinante humana: (Epo) Hemax. Laboratorios Sidus: cada frasco ampolla con liofilizado de
HEMAX contiene 2000 UI de eritropoyetina humana recombinante. Excipientes: manitol 40 mg, cloruro de sodio 7
mg, fosfato monosódico 2,8 mg, fosfato disódico dodecahidratado 8 mg, albúmina humana 5 mg, disueltos en 2 ml de
agua bidestilada estéril apirógena. Los lotes de animales que recibían diariamente una inyección de 20 ug/kg/ de
filgrastim fueron inyectados simultáneamente con 50 U de Epo/kg, los días 1, 4, 7, 10, 13, 16 y 19. Animales
control: Los animales control fueron inyectados con 100 ul/ratón de PBS.
Lotes de seis animales fueron sacrificados los días 0, 4, 8, 12, 16 y 20.
Método de cultivo para la determinación de células progenitoras:
Células nucleadas de médula ósea y bazo de los distintos lotes de animales se suspendieron en alfa medio suplementado
con albúmina sérica; suero bovino fetal; lecitina, ácido linoléico y araquidónico, colesterol, transferrina saturada
humana, selenito sódico, 2 - mercaptoetanol; penicilina - estreptomicina, insulina, hidrocortisona y methylcelulosa.
La cantidad de células fue de una concentración final de 5 x 104 /ml de medio de cultivo para estudio de GM- CFU
(Unidades formadoras de colonias de granulocitos – macrófagos) medulares y de 2 x 105 para GM – CFU esplénicas
usándose como estimulante una concentración final de 20 % de medio condicionante de bazo de ratón (preparado en
nuestro laboratorio). 0,5 ml de suspensión final se colocó en placas de 26 cavidades, y se dejó permanecer 7 días en
estufa de cultivo con control electrónico de temperatura a 37º C y atmósfera húmeda de 5 % de CO2 (Cole Parmer
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Instruments). Las colonias fueron contadas en microscopio invertido Nikon. Se consideraron colonias derivadas de
GM-CFU a colonias mayores de 8 células claras y redondeadas. Las colonias se contaron a los 8 días de cultivo.
Contajes celulares: los leucocitos periféricos/mm3 se contaron en hemocitómetro de Neubauer, mediante extracción de
300µl de sangre por punción cardíaca. Las células de médula ósea femoral y de bazo fueron procesadas con
homogenador de vidrio y contadas en hemocitómetro standard.
Morfología celular: fue evaluada en sangre periférica, médula ósea y bazo mediante frotis teñidos con May GrünwaldGiemsa.
Análisis estadístico: los datos se analizaron mediante ANOVA y el Test de comparaciones múltiples de StudentNeuman-Keuls. Los datos son expresados como promedio ± un error estándar y se consideró significativa una p< .05.
DISCUSION DE RESULTADOS
En los lotes de animales control que solo recibieron ciclofosfamida y PBS, el número de neutrófilos periféricos/ mm3
disminuyó el día 4 y luego se observó un aumento, aunque no significativo hasta el día 12 del experimento, retornando
la cifra de polimorfonucleares al valor normal a los 16 días posteriores a la administración del quimioterápico. Salvo
en día 16, el tratamiento con filgrastim no fue capaz de aumentar significativamente el número de neutrófilos
circulantes cuando se lo administró en forma simultánea con Epo, comparado con el lote control. Sin embargo, la
administración diaria de 20 ug/kg/día de filgrastim solo, desde del día 1 hasta el día 20, fue capaz de sostener un
número significativamente incrementado de neutrófilos desde el día 8 y hasta el final del experimento (Fig. 1)
Fig 1: Cambios en el número absoluto de neutrófilos
circulantes. Todos los ratones fueron inyectados con
ciclofosfamida en dosis de 100 mg/kg
el día 0 del
experimento. .Epo y filgrastim fueron administrados en forma
conjunta según el siguiente esquema y dosis: Epo: 30 U/ kg
los días 1, 4, 7, 10, 13, 16 y 19 + filgrastim 20 ug/kg /día desde
el día 1 hasta el día 20, (barras grises). Filgrastim solo fue
administrado en dosis de 20ug/kg/día desde el día 1 a 20
(barras negras). Los animales control (barras blancas )
recibieron PBS. Las barra representan el valor promedio ± 1
Error Standard. (***) indica diferencia significativa entre lote
Cy+filgrastim ó Cy+Epo+Filgrastim comparado con lote Cycontrol p< .001.(*) p < .05.
El estudio de la población granulocítica femoral no mostró variaciones significativas a lo largo del experimento en los
animales control a los que se administró únicamente ciclofosfamida y solución diluyente , ni en los que fueron tratados
en forma conjunta con Epo y filgrastim (salvo en día 20) . Sin embargo, en los animales que fueron inyectados solo
con filgrastim, hubo un aumento significativo de la población granulocítica femoral el día 8 y los días 16 y 20 del
experimento, comparado con el lote control . (Fig. Nº 2)
Fig 2: Cambios en el número de células precursoras
granulocíticas de médula ósea x 106. Animales inyectados
con ciclofosfamida en dosis de 100 mg/kg el día 0 del
experimento recibieron inyecciones simultáneas de .Epo y
filgrastim según el siguiente esquema : Epo: 30 U/ kg los
días 1, 4, 7, 10, 13, 16 y 19 + filgrastim 20 ug/kg /día desde
el día 1 hasta el día 20 (barras grises) ó fueron tratados solo
con filgrastim en dosis de 20ug/kg/día desde el día 1 a 20
(barras negras ).Los lotes de animales control (barras
blancas ) recibieron PBS. Las barras representan el valor
promedio ± 1 Error Standard. (***) indica diferencia
significativa entre lote Cy +filgrastim y lote Cy-control p<
.001; (**): p< .01; ( * ): p< .05.
A nivel esplénico (Fig. 3) , en los animales que fueron inyectados simultáneamente con Epo y filgrastim se observó un
importante aumento de células granulocíticas esplénicas (Fig. 3) el día 12 del experimento, no existiendo diferencias
significativas con el lote control en el resto de días en que se sacrificaron los animales. A diferencia de lo que sucede
en médula ósea, en los lotes de animales que solo recibieron inyecciones de filgrastim, no se observaron cambios
significativos de células precursoras granulocíticas, comparado con el lote control tratado con ciclofosfamida , salvo en
el día 8 del experimento en que se observó un aumento de su contenido comparado con el lote control.
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Fig 3: Cambios en el compartimento de células precursoras
granulocíticas esplénicas en animales pretratados con
ciclofosfamida en dosis de 100 mg/kg
el día 0 del
experimento. Los valores de ratones que recibieron inyecciones
simultáneas de .Epo y filgrastim según el siguiente esquema:
Epo: 30 U/ kg los días 1, 4, 7, 10, 13, 16 y 19 y 20 ug/kg /día
de filgrastim desde el día 1 hasta el día 20 se representan con
barras grises. Los valores de ratones tratados solo con
filgrastim en dosis de 20ug/kg/día desde el día 1 a 20 se
representan por barras negras. Los valores de animales control
que recibieron PBS se representan por barras blancas.. Las
barras representan el valor promedio ± 1 Error Standard. (***)
indica diferencia significativa entre lote Cy+ Epo +filgrastim
ó Cy + filgrastim comparado con lote Cy-control p< .001; (*):
p< .05.
La administración de filgrastim produjo un sostenido aumento del número de los progenitores tempranos
granulocíticos GM-CFUs medulares , desde el día 8 y hasta el final del experimento, comparado con el lote control.
También se observó un aumento del contenido de esta población celular en los animales tratados en forma simultánea
con Epo y filgrastim los días 4 y 12.
Fig 4: Cambios en el número de GM-CFU (Unidades de
colonias de granulocitos – macrófagos ) de médula ósea x
103. A todos los ratones se les administró 100 mg/kg de
ciclofosfamida el día 0 del experimento. Los valores de los
lotes de ratones que recibieron inyecciones simultáneas de
Epo y filgrastim según el siguiente esquema: Epo: 30 U/ kg
los días 1, 4, 7, 10, 13, 16 y 19 y 20 ug/kg /día de filgrastim
desde el día 1 hasta el día 20 se representan con barras grises.
Los valores de ratones tratados solo con filgrastim en dosis
de 20ug/kg/día desde el día 1 a 20 se representan por barras
negras. Los valores de animales control que recibieron PBS se
representan por barras blancas.. Las barras representan el valor
promedio ± 1 Error Standard. (***) indica diferencia
significativa entre lote Cy+ Epo +filgrastim ó Cy + filgrastim
comparado con lote Cy-control p< .001.
La población de GM-CFUs de bazo, por otro lado, aumentó significativamente en los ratones que habiendo
recibido previamente ciclofosfamida fueron tratados luego con filgrastim, en los días 12 – 16, disminuyendo luego a
valores casi indetectables – También aumentaron estas células progenitoras en los ratones que adicionalmente al
tratamiento con ciclofosfamida y filgrastim recibieron la administración de eritropoyetina en los días 12 y 20.
Fig. 5: Cambios en el número de GM-CFU (Unidades de
colonias de granulocitos – macrófagos ) esplénicos x 103.
A todos los ratones se les administró 100 mg/kg de
ciclofosfamida el día 0 del experimento. Los valores de los
lotes de ratones que recibieron inyecciones simultáneas de
.Epo y filgrastim según el siguiente esquema: Epo: 30 U/ kg
los días 1, 4, 7, 10, 13, 16 y 19 y 20 ug/kg /día de
filgrastim desde el día 1 hasta el día 20 se representan con
barras grises. Los valores de ratones tratados con
filgrastim en dosis de 20ug/kg/día desde el día 1 a 20 se
representan por barras negras. Los valores de animales
control que recibieron PBS se representan por barras
blancas.. Las barras representan el valor promedio ± 1 Error
Standard. (***) indica diferencia significativa entre lote
Cy+ Epo +filgrastim ó Cy + filgrastim comparado con lote
Cy-control p< .001.
Como puede observarse en Tabla 1, por otro lado, la administración de Eritropoyetina junto con filgrastim, no aumento
significativamente el valor de hematocrito de los animales en ninguno de los lotes estudiados
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Tabla 1: % de hematocrito en inyectados con ciclofosfamida el día 0 del y que luego experimento recibieron
inyecciones simultáneas de .Epo y filgrastim según el siguiente esquema : Epo: 30 U/ kg los días 1, 4, 7, 10, 13, 16 y
19 + filgrastim 20 ug/kg /día desde el día 1 hasta el día 20 (Cy + Epo + Filgrastim) ó fueron tratados solo con
filgrastim en dosis de 20ug/kg/día desde el día 1 a 20 (Cy + Filgrastim ).Lotes de animales control (Cy control )
recibieron PBS.
Cy + Filgrastim
Día
Cy Control
Cy +Epo + Filgrastim
0
41,6 ± 0,5
41,6 ± 0,5
41,6 ± 0,5
4
38,3 ± 0,7
38,6 ± 0,6
37 ± 0,8
8
38,8 ± 1,0
36,8 ± 1,7
37 ± 1,1
12
37,3 ± 0,9
43 ± 1,2
40,5 ± 1,0
16
36,5 ± 1,5
41,2 ± 1,7
41,0 ± 0,3
20
40,3 ± 1,3
42,1 ± 0,7
38,7 ± 0,7
CONCLUSION
La administración de ciclofosfamida, quimioterápico de amplio uso en tratamiento de neoplasias de diverso origen
tiene, entre otros, un efecto adverso depresor tanto de la línea celular granulopoyética como de la eritropoyética (7,8).
En el presente trabajo hemos empleado un animal pretratado con ciclofosfamida para estimular en forma simultánea
ambas líneas celulares administrando eritropoyetina y filgrastim a los efectos de comparar el efecto estimulante sobre la
granulopoyesis del filgrastim administrado en forma individual comparado la administración conjunta de filgrastim y
eritropoyetina. La administración de filgrastim en forma individual a los animales pretratados con ciclofosfamida
produjo un aumento sostenido del número de neutrófilos periféricos. En cambio cuando se administró este factor
estimulante de la granulopoyesis en forma conjunta con eritropoyetina, solo se logró un aumento significativo de estas
células el día 16. Este resultado sugiere que Epo y filgrastim podrían estar compitiendo por la célula progenitora común
de las líneas granulopoyética y eritropoyética: la unidad formadora de colonias de granulocitos, eritrocitos,
megacariocitos y macrófagos (GEMM-CFU), motivo por el cual el efecto estimulante granulopoyético de filgrastim no
se traduce en aumentos significativos de granulocitos circulantes cuando se administra en forma simultánea con Epo .
Esto es coincidente con la falta de aumento del valor de hematocrito observado en estos mismos animales
En médula ósea, la administración de filgrastim en forma individual a los animales pretratados con ciclofosfamida,
aumentó significativamente tanto el contenido de células progenitoras tempranas (GM-CFU) como precursoras
granulocíticas tardías a lo largo del experimento, comparado con el lote de con los animales control que recibieron
ciclofosfamida sola. El hecho de que cuando se administró filgrastim en forma conjunta con Epo no se produjo
estímulo de la granulopoyesis femoral en ninguno de los lotes estudiados (salvo en día 20) también sugeriría un efecto
competitivo de ambos factores de crecimiento sobre una célula progenitora común. Los importantes pero transitorios
cambios de la granulopoyesis a nivel esplénico, sin embargo, pueden ser explicados por efectos de migración de
progenitores desde médula ósea a bazo y probablemente de bazo a médula ósea, ya observados en trabajos previos (7).
Los resultados obtenidos permiten sugerir que podría haber un efecto competitivo entre factores de crecimiento
específicos de las líneas granulocítica y eritrocítica sobre su célula antecesora común: la GEMM-CFU, en el modelo
experimental usado. Esto es de importancia clínica,
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