tecnicas histologicas

UNCPBA
Facultad de Ciencias Veterinarias
Departamento de Ciencias Biológicas
CURSO DE HISTOLOGÍA, EMBRIOLOGIA Y TERATOLOGIA
GUIA DE ESTUDIO:
TECNICAS HISTOLOGICAS
AUTOR
M.V.M Sc. RICARDO ALZOLA
PROF. ADJUNTO
AÑO 2001
Se llama técnica histológica a la serie de pasos que han de darse para obtener un preparado
observable con el microscopio óptico. Es un proceso largo que abarca desde el momento en que se
toma el material hasta que el preparado puede observarse.
PASOS:
1.- Toma de material.
2.- Fijación
3.- Deshidratación
4.- Preparación para la inclusión
5.- Inclusión
6.- Modelado del bloque – catalogación
7.- sección con el micrótomo extendido de los cortes – pegado
8.- Coloraciones: de rutina o especiales
1.- Toma de material:
Introducción:
Tratándose de un área de Histología el material ha de ser de un animal sano y normal.
Si es posible debe extraerse de un animal vivo y anestesiado, en caso contrario, al menos han de
extraerse él o los órganos sanos lo más rápidamente posible después de la muerte.
La mayoría de las células consisten en una compleja membrana externa que rodea el protoplasma
fluido, mezcla de soluciones de sales, proteínas, hidratos de carbono, lípidos, ácidos orgánicos y
enzimas. Si las células no fueron fijadas, mu chas de estas sustancias se perderán por solución
simple, por diálisis o por ingurgitación osmótica de las células en el proceso que debe preceder al
corte y a la tinción. En la técnica histológica muchos componentes texturales se pierden durante los
sucesivos pasos de la misma. Los componentes que perduran son en gran medida moléculas grandes
que no se disuelven con facilidad en especial después de aplicar el fijador.
Las moléculas grandes, particularmente aquellas que forman complejos con otras moléculas de gran
tamaño, para producir compuestos macromoleculares, son las que mejor se conservan en un corte:
Ej.: - Acidos nucleicos asociados con una proteína (nucleoproteína)
- Proteínas intracelulares del citoesqueleto que forman complejos con otras proteínas.
- Proteínas extracelulares en grandes agregados insolubles asociados con otras moléculas vecinas
similares, a través de enlaces cruzados (como sucede en las fibras colágenas) y los fosfolípidos
de las membranas.
Las proteínas y ácidos nucleicos “pequeños” como el ARN de transferencia en general se pierden
durante la preparación de la muestra de tejido. Además pueden perderse moléculas grandes, por ej.
estas pueden ser hidrolizadas por un pH desfavorable en las soluciones fijadoras. Son ej. de
moléculas grandes, que desaparecen durante la fijación de rutina en fijadores acuosos: el glucógeno,
proteoglucanos y glucosaminoglucanos. También suelen perderse los lípidos neutros.
Al preparar muestras para su inclusión en parafina también se pierden moléculas pequeñas solubles
o iones.
Además y con el mismo propósito, la fijación debe hacerse muy cuidadosamente antes de proceder
a la deshidratación.
Muestreo:
En cuanto la sangre deja de llevar oxígeno a los tejidos y de extraerles el anhídrido carbónico,
las enzimas de las células que componen los tejidos comienzan a actuar y se produce la autólisis,
las propias estructuras moleculares son deformadas, que es lo que precisamente se ha de evitar. Los
tejidos y órganos se han de extraer considerando las siguientes prioridades:
-
Las glándulas exócrinas y endocrinas lo más rápidamente posible.
El páncreas y el riñón deben extraerse no más de 10 a 15 min. post-mortem.
Otros órganos tales como intestino delgado y/o grueso, estómago, hígado, se deben extraer no
más allá de los 30 min.
Los músculos esqueléticos, huesos, piel, encéfalo, médula, ganglios nerviosos no deben
extraerse más allá de 60 min. postmortem.
Material de necropsia:
El examen necrópsico debe ser realizado lo más rápidamente posible después de la muerte,
si esto no es posible el animal debe ser colocado a 4° C. o sometido a embalsamamiento por vía
arterial.
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Comentario:
Procedimientos generales:
Si se extraen varios órganos se debe tener cuidado en registrar cada trozo de órgano
envolviéndolo en una gasa o bien pasando un hilo directamente por un extremo del órgano, mientras
quede el extremo opuesto se coloca un trozo de cartulina resistente donde se escribe con lápiz las
indicaciones (órgano, porción, etc.) del caso, todo esto es necesario si las muestras a extraerse son
muchas pues luego se verá dificultado el reconocimiento.
La cantidad de líquido fijador en microscopia óptica debe ser aproximadamente 10 a 20 veces el
volumen de la muestra.
Los fragmentos de órganos no deben ser mayores de 1 cm de espesor; deben ser tomados en
ángulos rectos a la superficie de los órganos y deben ser suficientemente profundos para
comprender los constituyentes anatómicos normales como por ej. cápsula, corteza, médula, etc. A
veces pueden cortarse trozos de órganos de mayor tamaño, 2 o 3 cm y luego de algunas horas en
fijador en que las piezas están más fáciles de manejar, se realizan cortes más pequeños de los
mismos.
¿Cómo realizar las secciones?
Los trozos de órganos tubulares se seccionan directamente con tijeras, los macizos han de ser
“desprendidos” con las tijeras.
Extraídos los órganos deben seccionarse en fragmentos, para esto se debe utilizar una hoja de
afeitar o de bisturí (se utilizan a manera de serrucho sin presionar). Los bordes cortados con tijeras
se seccionan y se desechan, porque comprimen los órganos y los deforman.
2.- Fijación:
Concepto:
La fijación es una operación destinada a “matar” las células, conservándolas, cuanto sea
posible en el estado en que están durante la vida.
Introducción:
Una buen a fijación debe:
-
inmovilizar la célula
conservar exactamente todas las partes constitutivas.
no hacer aparecer artificialmente otros detalles en la estructura.
Tal fijación es por ahora imposible de realizar.
Una acción rápida y enérgica del reactivo impide bien las alteraciones espontáneas postmortem,
pero este modifica también la estructura celular.
Los mejores fijadores son los que además de actuar rápidamente producen el menor numero
posible de reacciones (modificaciones) secundarias o artificios, capaces de darnos una idea muy
falseada de la morfología interna de la célula.
Un tejido bien fijado mostrará células plenas, no vacuolizadas, ni hinchadas, ni arrugadas, sino
presentando muchos detalles de estructura fina.
¿En qué consiste esencialmente la fijación? :
Es verdad que la masa celular, formada de albuminoides, no puede ser conservada
exactamente, sino es por un proceso que la solidifique. Esta solidificación se obtiene por
coagulación o precipitación.
La coagulación es producida por agentes físicos, la precipitación, siempre acompañada de
modificaciones químicas, es producida por agentes químicos.
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El verdadero papel de la fijación es el de producir una coagulación o una precipitación lo más
completa posible de todos los albuminoides celulares, conservando la configuración correspondiente a su naturaleza amorfa (citoplasma), granulosa (gránulos de secreción), filamentosa (con drioma), etc.
Conservación morfológica de los Tejidos:
Debe endurecerlos suficientemente para permitirles resistir sin deformarse, todas las
manipulaciones subsiguientes (deshidratación, inclusión, cortes, etc.).
La fijación debe producir al mismo tiempo la insolubilización de los elementos constitutivos de la
célula y de los tejidos. Es pues necesario que los detalles de estructura, conservados por el fijador
no sean destruidos enseguida por la acción de los líquidos de lavado o de las soluciones colorantes.
Esta insolubilización puede ser producida por la deshidratación, coagulación y principalmente por
la combinación química del reactivo fijador con los albuminoides celulares.
Preparación para la coloración:
Ciertas combinaciones formadas entre fijadores y tejidos tienen la propiedad de combinarse
con ciertas materias colorantes, estas así pueden mordentar los tejidos y permitir coloraciones
específicas.
Función del equilibrio físico:
Cuando hablamos de fijación debemos tener en cuenta las reglas del equilibrio físico que se
relacionan con las membranas permeables. Desde el punto de vista físico, la fijación es la
penetración de un producto extraño a través de una membrana permeable, es ante todo un fenómeno
de ósmosis.
La rapidez de la difusión está en razón directa con la concentración de la sustancia que se difunde,
conviene regular esta concentración de manera que la célula pueda conservar lo más intacta posible
su forma, volumen y contenido, asegurando una penetración rápida y completa.
La rapidez de la penetración está en función directa a la concentración y en función inversa del
peso molecular de las sales; esta es mayor para los cuerpos minerales que para los cuerpos
orgánicos.
Cuando una pieza es sumergida en un fijador, pueden suceder tres cosas:
-
La pieza cae al fondo, en este caso el fijador es hipotónico, y la fijación tiene bastantes
probabilidades de ser incompleta e irregular.
La pieza permanece flotando en la superficie, el fijador es hipertónico, muy denso y las células
se contraerán.
La pieza se sumerge, pero queda por encima del fondo del recipiente, hay equilibrio físico y la
fijación será buena si los ingredientes del fijador fueron bien elegidos.
Cualidades de los fijadores:
El fijador ideal sería aquel que conservase la célula en un estado idéntico al estado viviente,
este fijador en realidad no existe, por eso debemos buscar una serie de cu alidades en el fijador a
utilizar que nos acerquen lo más posible al fijador “ideal”.
Cualidades:
- Potencia o poder de penetración: al menos en lo que concierne a los tejidos de manera que el
líquido pueda fijar muy bien las zonas más profundas e igualmente las capas superficiales.
- El fijador debe producir una coagulación total de los albuminoides, pero esto no quiere decir
que la coagulación haya de ser violenta e instantánea, por el contrario, conviene que la
coagulación sea en cierto modo fraccionada para evitar las contracciones.
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La rapidez de acción de un fijador debe tener por objeto el de “matar” lo más pronto posible las
células. La precipitación total, por el contrario, debe producirse adecuadamente de modo que no se
produzcan contracciones.
“La muerte de la célula debe ser inmediata y su coagulación debe ser mediata”.
Agentes fijadores:
Los agentes fijadores pueden ser de orden físico o de orden químico.
Agentes Físicos:
- Frío:
No puede ejercer ninguna acción fijadora a temperaturas que no pasen de 0° C. Endurece los
tejidos y suspende las alteraciones celulares debidas a la necrosis y a la autodigestión. Este
agente no sería más que una ayuda.
La congelación de los tejidos frescos parece ser a priori, un detestable procedimiento
histológico. El aumento de volumen de los líquidos que los llenan y la formación de agujas de
cristales no puede evitar la producción de verdaderos deterioros. Su única ventaja es la de no
precipitar los albuminoides y de no alterarlos.
-
Calor:
Ejerce una acción muy diferente según se aplique a objetos secos o húmedos. La fijación por
agua hirviendo o por diversos fijadores en ebullición presta servicios para invertebrados y
búsquedas histoquímicas.
Agentes químicos:
- Ácido acético:
Incoloro, cristalizable por debajo de 17° C. Aumenta el contraste entre núcleo y citoplasma.
Forma parte de la mayoría de las mezclas fijadoras como fijador de la cromatina.
-
Ácido ósmico:
Se presenta bajo la forma de cristales amarillentos. Se obtiene comercialmente en pequeños
tubitos de vidrio sellados, contienen cantidades que varían de 0.1 a 1 g.
El manejo de este cuerpo presenta dificultades, es muy volátil y emite sin cesar vapores
extremadamente irritantes.
Es un enérgico oxidante por lo cual es reducido rápidamente por trazas de materia orgánica, por
lo que se debe tener especial precaución para preparar las soluciones. El título habitual es de 1
a 2 %, puede prepararse en agua destilada o en ácido crómico.
Desde el punto de vista morfológico, fija sin precipitar, impidiendo además la precipitación por
el alcohol durante la deshidratación. Mata rápidamente las células y fija bien el citoplasma y el
condrioma pero no muy bien el núcleo. El osmio es un buen fijador de sustancias grasas y de la
mielina. Es poco difusible y por consiguiente poco penetrante de manera que las capas
superficiales de las piezas están superfijadas mucho antes que el reactivo haya llegado al
interior.
-
Ácido pícrico:
Pequeños cristales amarillentos que se emplean en soluciones acuosas saturadas o en soluciones
alcohólicas. Solubles en frío en agua, mayor solubilidad con temperatura.
Es un reactivo muy penetrante que no se lo emplea solo, sino formando parte de mezclas, como
en el líquido de Bouin. El ácido pícrico es un excelente fijador, sobre todo desde el punto de
vista tintorial. Se fija con intensidad sobre los citoplasmas, facilita todas las coloraciones.
Contrae pero endurece poco.
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-
Alcohol metílico:
Reactivo importante en la técnica de frotis desecados.
-
Alcohol etílico:
Puede servir como fijador el alcohol absoluto o el de 96 °.
El alcohol 100, puede dar excelentes fijaciones, por ej. para el sistema nervioso o frotis
desecados.
Disuelve los lípidos, precipita el glucógeno sin fijarlo y da con los nucleoprótidos un
precipitado hidrosoluble. Es poco penetrante, fija mal los núcleos y poco los citoplasmas.
-
Bicloruro de Mercurio:
Pequeños cristales blancos muy venenosos, solubles en agua, en frío (7%) en ebullición (54%),
muy soluble en alcohol (32%). En solución acuosa precipita enérgicamente los albuminoides,
principalmente los del núcleo. Estas propiedades se exaltan por la adición de ácido acético, que
vuelve más penetrante el fijador. Una vez terminada la fijación es necesario eliminarlo de los
tejidos para evitar la formación de cristales.
-
Bicromatos:
Los bicromatos alcalinos, (Potasio, sodio, Magnesio, Estroncio, Zinc) fijan bien los citoplasmas
pero destruyen los núcleos. Los bicromatos de Bario, Calcio, Cobre, fijan bien las mitosis pero
no los citoplasmas. El más empleado de los bicromatos es el de Potasio, gruesos cristales de
color rojo anaranjado, fácilmente solubles en agua (12.4%).
-
Formaldehído:
Este cuerpo es un gas cuya solución acuosa lleva el nombre de formalina o de formol. Toda vez
que hablemos de formol puro tendremos en vista la solución comercial al 40%.
El formol es el fijador más utilizado, a causa de su bajo precio y la facilidad de su empleo.
Es un fijador importante a causa de su poder coagulante y su notable capacidad de penetración.
El formol comercial es un líquido incoloro, que emite vapores irritantes. A veces los vapores
del formol pueden producir accidentes febriles, bronquitis, queratitis.
Resulta muy desagradable manejar piezas embebidas en formol a causa de las violentas
punzadas que no se tarda en sentir en los ojos, la acción sobre la mucosa olfatoria, es tal vez
menos sensible, pero más durable y la olfación puede terminar por quedar notablemente
disminuída.
Conviene no poner los dedos en contacto con las soluciones que contienen formol porque la
epidermis se fija rápidamente y endurece de manera poco agradable, además de poder
ocasionar dermatitis alérgicas por contacto.
Para manejar piezas que han permanecido en formol sin sufrir los inconvenientes mencionados,
se las lava con agua y luego se las introduce en agua ligeramente amoniacal, así se suprime
todo olor.
El formol de comercio casi siempre contiene una cantidad más o menos considerable de ácido
fórmico. Esta impureza daña muchas veces la fijación, produce precipitación en los tejidos,
destruye las células mucosas y daña seriamente los citoplasmas por lo que es necesario
emplear siempre formol neutro.
Es conveniente adoptar una convención para formular el título de las diluciones:
El porcentaje mirará siempre la solució n comercial de 40%, para preparar una solución al 5%
se mezcla 5 cc. de formol con 95 cc. de agua. La solución comercial presenta a veces una
alteración particular que se manifiesta por un aspecto lechoso y por la formación de
precipitado blando más o menos abundante, el frío interviene mucho en este fenómeno.
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Estas transformaciones se explican por la existencia de tres isómeros:
a.- El formol con una molécula de formaldehído,
b.-el paraformol con dos moléculas,
c.- el trioximetileno con tres moléculas.
El formol y el paraformol coexisten en las soluciones límpidas, bajo la influencia del frío o por
otras causas, se polimerizan y dan trioximetileno, insoluble, que forma un precipitado blanco.
Teóricamente el formaldehído es un no-electrolito, por consiguiente incapaz de formar sales,
pero sí de formar compuestos de adición.
El formol solo, puro o diluido es un mal fijador, produce hinchamiento de los tejidos y
vacuoliza las células o bien les da un aspecto de sobrefijados, disminuye los contrastes entre
citoplasma y núcleo.
La adición de ácido acético, corrige el defecto del formol y aumenta notablemente la
coloreabilidad del núcleo. En los órganos muy vascularizados el formol a veces forma
precipitados negruzcos muy incómodos, que pueden pasar por pigmentos. Para eliminarlos
pueden tratarse los cortes con potasa. El formol forma parte de gran cantidad de mezclas
fijadoras y es uno de los mejores fijadores para el sistema nervioso y para las mitocondrias.
Mezclas Fijadoras:
Las mezclas fijadoras se utilizan para técnicas de rutina o para técnicas especiales.
Las mezclas fijadoras son combinaciones de agentes fijadores, cada uno de los cuales es por si solo
insuficiente para dar una fijación que respondaa todas las exigencias.
q
q
q
de von Tellyesniczki:
A base de bicromato de potasio ácido acético y agua destilada (3 g, 5 cc, 100cc). el bicromato
conserva bien el citoplasma. El ácido acético conserva bien los núcleos. Las muestras no deben
ser mayores de 0.5 cm de diámetro. El tiempo de fijación no debe superar los dos días, al
término del mismo debe hacerse un lavado en agua corriente de 24 h.
de Bouin:
Para hacer esta mezcla es conveniente tener una solución saturada de ácido pícrico.
Componentes: solución saturada de ácido pícrico 15 cc, formol 40% 5 cc, ácido acético 1 cc.
Es uno de los mejores fijadores para el estudio del glucógeno; penetra rápidamente a los
tejidos, es un buen fijador general, salvo para el riñón. Es muy adecuado para las coloraciones
de Masson y Mallory. Produce poco encogimiento. Según el tamaño de la pieza la fijación
requiere de 1 a 24 h. El líquido completo es una solución estable. Este fijador produce lisis de
los glóbulos rojos y disminuye la cantidad de hierro férrico demostrable. Los tejidos no deben
permanecer por más de 12 a 24 h. pues sino se vuelven duros y quebradizos. Una vez terminada
la fijación se debe pasar directamente a la deshidratación con alcohol 80°.
De Carnoy:
Los componentes de esta mezcla son los siguientes: alcohol etílico, cloroformo, ácido acético
glacial (60 ml, 30 ml, 10 ml ).
Este fijador es muy adecuado para pequeños fragmentos tisulares, por ej. obtenidos por
raspado, que se fijan bien en 30 min. a 2 h. También inicia la deshidratación, es un bu en fijador
para el glucógeno, los núcleos se tiñen bien. Como inconvenientes podemos citar que produce
lisis y encogimiento importante. Disuelve los lípidos y la mielina. Fija bien el glucógeno.
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3.- Deshidratación:
Concepto:
Los tejidos contienen grand es cantidades de agua, tanto intracelular como extracelular, que
debe ser eliminada y reemplazada por parafina.
Detención de la fijación:
Una vez transcurrido el tiempo de fijación deseado es preciso detenerlo rápidamente.
El fijador que rodea la pieza p uede ser eliminado por lavado en:
a.- agua
b.- alcohol
a.- Es imprescindible hacerlo después de la fijación con ácido crómico, bicromato de potasio y
ácido ósmico.
Se hace en agua corriente de 2 a 24 h.
b.- Piezas que han estado en alcohol, ácido pícrico o formol, se llevan directamente al alcohol 70 o
80%, llevándose así a cabo el lavado y el inicio de la deshidratación.
La deshidratación se realiza por medio de un reactivo anhidro pero ávido de agua. Puede utilizarse
la acetona o el alcohol etílico (es el más utilizado).
La deshidratación se hace en forma progresiva con sucesivos baños de alcohol, cada vez menos
hidratados 70° – 80° – 90° – 96° – 100°.
Tiempos de permanencia en cada líquido:
Alcohol 70
las piezas pueden perman ecer varios días.
Alcohol 96
2 baños en un lapso de 24 h.
Alcohol 100
3 baños de una hora c/u.
Como han de introducirse las piezas:
Las piezas se han de envolver en gasa a manera de bolsitas, colocarlas en cartulina, etc. pero
siempre suspendidas.
Para la deshidratación deberán emplearse frascos anchos y de cierre hermético. Los recipientes
deben ser agitados periódicamente para que la mezcla de alcohol y agua sea lo más perfecta
posible.
En cada etapa la cantidad de deshidratante debe ser superior a 10 veces el volumen del tejido por
deshidratar. Una mala deshidratación es siempre perjudicial por lo que es necesario controlar el
resultado de la misma.
Los disolventes utilizados antes de la parafina son el xileno, benceno, tolueno, butilo, si la pieza ha
sido mal deshidratada los líquidos se tornan opalinos.
4.- Preparación para la Inclusión:
El aclaramiento o desalcoholización permite que el alcohol de los tejidos sea reemplazado
por un líquido (solvente) que disuelva la parafina con la cual el tejido va a ser impregnado.
La parafina es un hidrocarburo sólido, con escasa elasticidad que ha de penetrar a los tejidos,
ocupando hasta sus últimos intersticios. Para lo cual ha de licuarse mediante temperatura.
Solventes:
Benceno – xileno – tolueno – cloroformo – fenol en alcohol – carbolxilol – etc.
La palabra aclarar proviene de que además de eliminar el alcohol muchas de estas sustancias tienen
la propiedad de trasparentar los tejidos.
Xileno: es un excelente agente aclarante pero tiende a hacer que los tejidos sean excesivamente
duros y quebradizos y esto nunca deben dejarse en este líquido más de 3 horas.
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El xileno es inadecuado para el encéfalo y los ganglios linfáticos, pues los hace demasiado
quebradizos, para estos órganos es mejor utilizar cloroformo.
Tolueno: tiene las mismas propiedades generales que el xileno pero resulta mejor porque endurece
mucho menos los tejidos.
Cloroformo: resulta excelente para el tejido nervioso, ganglios linfáticos y emb riones pues
produce poco encogimiento y no endurece mucho los tejidos.
¿Cómo se realiza el aclaramiento? :
Las piezas se trasladan a un frasco que contenga el volumen adecuado del solvente (30
veces).
Si cuando las piezas son colocadas en el solvente se observa que están formando nubosidades
opalinas y que estas no desaparecen de inmediato, quiere decir que la deshidratación no ha sido
completa. Debe volverse al alcohol absoluto.
¿Cuándo esta terminado este paso? La finalización de este paso es tarea de la vista, si las piezas se
han vuelto diáfanas, trasparentes, lo está. Las piezas pueden ser trasladadas a la parafina.
5.- Inclusión:
La parafina es un hidrocarburo no cíclico. A la temperatura ambiente es sólido. La
temperatura suave la disuelve por completo. Una temperatura mayor de 65° llega a disolverla,
produciéndose vapores de olor desagradable, inflamables y también tóxicos. Hay parafinas que
funden a distintas temperaturas, para la mayoría de los trabajos pueden utilizarse las que lo hacen a
56-58°. En la estufa debe haber cuatro vasijas con parafina ya disuelta. En cada vasija ha de haber
un volumen suficiente como para cubrir por completo las piezas que se han de colocar. Es
conveniente que cada vasija posea su número de orden 1, 2, 3 y 4.
El recipiente número 1 debe tener parafina ya fundida a la que se mezclará una pequeña cantidad de
solvente, el 2 y 3 deben contener parafina pura, que poco a poco ira adquiriendo algo de solvente
cuando las piezas vayan pasando por ellas.
El 4 debe tener parafina completamente pura.
Tiempo de cada baño:
Depende un poco del tamaño de cada pieza. En cada recipiente pueden estar de 2 a 3 h. Lo
que se ha hecho hasta ahora mediante los baños de parafina se conoce con el nombre de
impregnación.
La inclusión consiste en encerrar cada pieza dentro de un bloque de parafina pura.
Pasos de la inclusión:
Se ha de preparar tantos moldes cuantas piezas han de incluirse.
Se extrae una pieza, se la libera de la envoltura de gasa, se la ubica en el fondo del molde,
orientándola para saber luego por donde ha de ser cortada.
Sobre la pieza puesta en el molde se vierte parafina fundida, pura de la cuarta vasija. Se deja el
molde sobre una superficie plana y fría, se espera que la falta de calor solidifique toda la parafina,
formándose así un bloque. Mientras se trabaja en una pieza las demás deben estar en la estufa.
Los moldes:
Los hay de varias clases: barras de Leukart, cajas de papel, hormas de metal.
Barras de Leukart:
Consisten en un par de barras de metal, dobladas en ángulo recto a manera de escuadras. A su vez
cada rama de la escuadra tiene un ángulo recto en el extremo. Esta disposición permite que una
barra se aplique contra la otra, como permite deslizamiento es posible agrandar o achicar el molde
conforme las neces idades.
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Las cajas de papel :
Se construyen con una tira de cartulina delgada o con papel resistente. Son muy económicas con
respecto a las barras dado que aquellas son sumamente caras.
Hormas de metal:
Se pueden hacer de dos maneras circulares o cuadradas . Las circulares se hacen cortando
transversalmente “rodajas” de caños de metal o de plástico, las cuadradas se hacen cortando láminas
de aluminio o de hojalata que se doblan sobre un molde de madera, los extremos libres pueden
soldarse.
Ambos tipos de hormas carecen de piso, por lo que es necesario colocarlas al hacer la inclusión
sobre una superficie lisa (ej. un azulejo)
6.- Modelado del bloque – catalogación:
La forma de los bloques deben ser preferentemente de pirámide truncada. Las caras opuestas
han de resultar paralelas entre sí, lo mismo que las aristas.
Catalogación:
Cada pieza lleva un hilo con una tarjeta donde se indica de qué órgano o porción del mismo
se trata. Esta medida es la base para catalogar los bloques. La catalogación puede hacerse de
diferentes maneras de acuerdo a las necesidades particulares.
Siempre se tendrá en cuenta que en la misma conste, animal, fijador, fecha, código, bloques, etc.
7.- Sección con el micrótomo – extendido de los cortes – pegado:
Como la finalidad de todos estos pasos es poder observar los tejidos con el microscopio, es
necesario reducir las piezas histológicas a delgadas secciones.
Las secciones finas y parejas se obtienen con el micrótomo. Este aparato consiste básicamente en
una base pesada que soporta una superficie por la que se desliza una cuchilla, un tornillo que
acerque el material y lo ponga al alcance del filo de la navaja, de modo que siempre su avance
ofrezca la misma medida del material.
Como el tipo de micrótomo más utilizado es el de deslizamiento, las indicaciones se harán siempre
con referencia a este tipo.
El bloque se debe pegar en un taco de madera, de la siguiente forma: se calienta una espátula en la
llama de un mechero, la que se aplica a la cara inferior del bloque, que se sostiene algo inclinado
sobre el taco de madera, a fin de que algunas gotas de parafina fundida caigan sobre su cara
superior, una segunda aplicación de la espátula calentada contra la parafina, disolverán otra porción
de parafina, que no será necesario dejar caer sobre el taco, y el bloque se aplica y presiona entonces
contra el taco y luego se deja enfriar.
El micrótomo lleva una pieza que posee una morsa, entre sus ramas se coloca el taco de madera y
luego se aprietan con el tornillo de presión hasta que este muy firme.
Es conveniente que la navaja del micrótomo ya este colocada en el cepo de la pieza portacuchilla.
Una vez colocado el bloque se hace deslizar la cuchilla hasta que su filo esté ubicado sobre el
bloque.
La pieza portabloque posee una cremallera que permite bajar o subir el bloque, que deberá hacerse
contactar con el filo de la navaja. La cara inferior de la cuchilla no debe ser paralela a la cara del
corte.
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¿Como se regula el espesor de los cortes?
Se hace mediante un tornillo micrométrico, sus pasos de rosca son muy estrechos. Al
avanzar, empuja el bloque portamaterial por una rampa oblicua al plano de deslizamiento de la
cuchilla. Para hacerlo avanzar hay una palanca lateral, una especie de brazo y un tope.
Elegido el espesor que se desea dar a los cortes, se desliza la cuchilla. Se hace el primer corte. Este
si ha salido entero, se recoge con un pincel húmedo y se deposita en la superficie del agua contenida
en una bandeja o cubeta. Es mejor que sea agua fría. Los cortes que naturalmente salen ondulados
se extienden y alisan por completo mediante el agregado a la bandeja de agua tibia.
Pegado de los cortes:
Para la mayor parte de los preparados de histología normal, la técnica exige que los cortes
estén fijos.
El portaobjeto debe estar limpio, para recoger cortes se toma un portaobjeto seco, se deposita en su
centro una gota pequeña de albúmina de Mayer, se extiende esta gota con el borde externo del dedo
meñique. La gota debe quedar extendida por completo, formando una película sumamente delgada,
casi invisible.
Ahora se lleva el porta al agua de modo que su cara untada esté arriba. Se coloca esta cara por
debajo de un corte sin defectos. El corte puede ser sujetado por un pincel. Se levanta el porta y se
extrae del agua junto con el corte en el centro del porta.
Todavía el corte está libre, para que se adhiera hay que hacer evaporar el agua y coagular la película
de albúmina de Mayer mediante calor, esto se consigue llevando el porta a una estufa a 37 0 40 °,
durante unos 30 min como mínimo.
8.- Coloraciones de rutina y especiales:
Las manipulaciones siguientes son inmediatamente previas al proceso de coloración. Para
que el corte pueda ser coloreado debe estar completamente libre de parafina y suficientemente
hidratado.
Los colorantes son cuerpos químicos disueltos en agua destilada o a veces el alcohol. La parafina no
se mezcla con ellos, como aquella ha penetrado en el interior de las células estas no podrán ser
teñidas.
Desparafinación de los cortes:
Para realizar la desparafinación de los cortes los mismos son introducidos en un frasco de
boca ancha que contenga xileno. Lo ideal es hacer dos baños de aproximadamente 10 min. c/u, de
esta forma se asegura una perfecta desparafinación de los cortes. El xileno puede utilizarse varias
veces.
En los pasos siguiente el xileno debe ser eliminado porque sino la hidratación del corte será
imposible. Se elimina mediante el alcohol etílico. Se realizan sucesivos lavados en alcohol 100°.96°
y 70°.
Una vez realizados los baños con alcohol se puede proceder a la hidratación de los cortes.
La hidratación es una operación necesaria. Debe eliminarse el resto de alcohol que hay en el corte.
Se realiza sumergiendo los mismos en un frasco que contenga agua destilada, durante dos o tres
min. De esta forma el corte estará listo para comenzar algún proceso de coloración.
Teoría de la coloración:
Se sabe que las imágenes producidas por absorción, en preparaciones coloreadas, son mucho
más fáciles de interpretar que las imágenes de difracciones dada por preparaciones no coloreadas,
además los diversos elementos de los tejidos poseen poco más o menos el mismo índice de
refracción lo que hace que el reconocimiento sea una tarea difícil.
Estos dos argumentos hacen comprender la necesidad de las coloraciones para el estudio
morfológico de células y tejidos.
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Un colorante es un cuerpo coloreado que puede comunicar su color a otro cuerpo.
La mayor parte de los colorantes artificiales (y aún los naturales como la hematoxilina), derivan de
cuerpos incoloros, por ej. de carburos aromáticos.
La coloración es la propiedad que tienen ciertos cuerpos de ejercer una absorción selectiva sobre la
luz. Dicho de otra manera un cuerpo se ve de tal color porque trasmite por trasparencia o por
difusión las radiaciones complementarias de las que él absorbe.
Tipos de coloraciones:
Directas: se producen por inmersión en el baño colorante.
Indirectas: en este tipo de coloración, el colorante no puede actuar directamente, el objeto que ha
de colorearse debe ser tratado de antemano por otra sustancia que lo prepare para admitir el
colorante, esta se llama mordiente.
Clasificación de los colorantes:
Puede hacerse desde el punto de vista químico (por su naturaleza) o desde el punto de vista
histológico (por su uso).
Desde el punto de vista químico los colorantes se agrupan conforme a su constitución.
Desde el punto de vista histológico se los clasifica en naturales y artificiales.
Colorantes naturales:
En todos ellos hay un principio colorante producido por la naturaleza que luego la técnica
del hombre ha sabido extraer, componer y hacerlo efectivo.
Hematoxilina: La hematoxilina es una sustancia capaz de colorear, extraída de la madera de un
árbol conocido como árbol de Campeche, originario de Centroamérica.
La hematoxilina se expende en polvo, el cual es cristalino, casi incoloro o algo amarillento a veces
más oscuro.
La hematoxilina, como tal, aunque esté disuelta en agua o en alcohol de 96° o de 100°, es incapaz
de colorear, para poder hacerlo, debe sufrir una oxidación.
La hematoxilina oxidada es hemateína y bajo este cambio físico -químico y la unión con una base es
capaz de colorear.
La base es conocida como mordiente, hay muchas bases que actúan como tal, la más conocida es el
alumbre que puede ser de potasio, hierro o cromo.
El mordiente es un intermediario entre el colorante y el tejido y en general entre dos cuerpos que
químicamente carecen de afinidad.
De alguna manera activa las moléculas del tejido y forma con ellas una unión firme y estable. Con
el colorante forma un precipitado que presenta una fuerte coloración y es, además insoluble en
agua y otros líquidos. Este tipo de precipitado coloreado se llama “laca”. Los mordientes deben ser
ácidos nunca básicos.
Orceína: Es un principio colorante extraído de ciertos líquenes. Es un ácido débil. Utilizando una
mezcla en que el ácido acético actúa como mordiente se utiliza para colorear cromosomas. También
colorea las fibras elásticas.
Colorantes artificales:
Algunos son colorantes del núcleo y otros del citoplasma.
Son sales producidas de la unión de una base y un ácido.
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Colorantes para el núcleo: su base es la que se combina con los ácidos nucleicos, por lo tanto
ésta es la coloreada. El ácido es el incoloro.
Colorantes para el citoplasma: el ácido del colorante es el que se combina con el citoplasma.
La base es la incolora.
Colorantes artificiales más comunes: vesubina, tionina, azul de toluidina, azul de metileno, fucsina
básica, violeta de metilo, verde de metilo, anaranjado de acridina.
Se ha dividido a los colorantes según su afinidad que presentan con el núcleo o con el citoplasma:
• colorantes nucleares o básicos su componente colorante activo es una base coloreada.
• Colorantes citoplasmáticos o ácidos: su componente activo es un ácido coloreado.
• Colorantes neutros.
La mayor p arte de los colorantes que se utilizan son sales.
Los colorantes básicos son sales cuya base es coloreada y su ácido es incoloro, Ej. azul de
metileno—clorhidrato de tetrametiltionina o sea es una sal formada por la combinación de la
tetrametiltionina (base coloreada) de azul de metileno con el ácido clorhídrico. Reaccionan con los
grupos fosfato de los ácidos nucleicos (DNA-RNA), los grupos sulfato de los glucosaminoglucanos
y los grupos carboxilo de las proteínas.
Los colorantes ácidos llevan una base que es incolora combinada con un ácido coloreado, Ej.
eosina—eosinato de potasio (base incolora) combinada con el ácido eosínico
(tetrabromofluoresceína) que es coloreado.
Los colorantes neutros tanto el ácido como la base son coloreados Ej. eosinato de azu l de metilenoazur de metileno.
Los componentes que se tiñen con colorantes ácidos se dicen que son acidófilos (filamentos
citoplasmáticos, la mayor parte del citoplasma no especializado, y las fibras extracelulares).
Cualquier componente de los tejidos que reaccione con un colorante básico se dice que es basófilo
(heterocromatina, nucleolos, ergastoplasma, matriz del cartílago).
Proceso de coloración:
Tomaremos como base para la descripción de este proceso a la coloración de hematoxilina y eosina
considerada como la “coloración de rutina”.
Coloración de hematoxilina y eosina:
Desparafinar los cortes: realizar dos baños de xileno de 10 a 15 min. c/u.
Eliminamos el solvente por sucesivos baños en: alcohol de 100°, 96°, 70° de 1 a 2 min. c/u.
Hidratación de los cortes: en agua destilada durante 1 a 2 min.
Tinción nuclear: en hematoxilina durante 2 a 12 min. de acuerdo a la formula utilizada.
Viraje de la hematoxilina: en agua corriente hasta desprendimiento total del color (3 a 5 min.).
Lavado en agua destilada o corriente.
Coloración citoplasmática: eosina al 0.5% o en una mezcla de eosina/floxina al 0.5% durante 15
a 30 seg.
Lavado en agua destilada.
Deshidratar, aclarar y montar.
Los pasos de la deshidratación pueden ser suplidos dejando secar el corte en estufa a 37° por 15
a 20 min.
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Coloraciones especiales:
Las coloraciones especiales comprenden un conjunto de tinciones o impregnaciones utilizadas para
poner de manifiesto o resaltar determinadas estructuras de los tejidos.
Para tejido conectivo:
Fibras colágenas:
Tricrómico de Van Gieson: las fibras colágenas se observan de color rojo.
Tricrómico de Gomori: se observan de color rojo.
Tricrómico de Masson: las fibras colágenas se observan de azul.
Fibras Elásticas:
Método de Gomori: las fibras elásticas se tiñen de púrpura oscuro.
Orceína: se tiñen de púrpura.
Fibras reticulares:
Método de Gomori para la impregnación argentica de la reticulina: las fibras reticulares se
observan negras.
Tejido adiposo:
Sudan black: el tejido adiposo se observa de color negro.
Sudan IV-rojo Escarlata:
- grasas neutras: se observan de color rojo vino.
- lipoides: rojo anaranjado
- fosfolípidos: se tiñen poco o nada.
Carbohidratos y mucopolisacáridos:
Acido Peryódico de Schiff (PAS): los mucopolisacáridos básicos o neutros se observan de color
rojo.
Azul alcian: los mucopolisacáridos ácidos se observan de color azul.
Coloración para el estudio neurohistoquímico:
Coloración de la sustancia de Nissl- método de la tionina fenicada: los grumos de Nissl y
núcleos aparecen teñidos de color azul profundo.
Luxol fast blue-PAS-hematoxilina: la mielina se observa azul brillante
Modificación de la técnica de Glees-método de Marsland, de impregnación argéntica a cortes de
parafina: células nerviosas, neurofibrillas y células de la glia en diversas tonalidades de negro,
fondo de color habano.
BIBLIOGRAFÍA
•
Celani M. S., Fernández Surribas J., von Lawzewitsch I. Lecciones de Histología Veterinaria.
Volumen I Microscopia y Técnicas Histológicas. I. Ed. Hemisferio sur S. A. 3ra. Ed. 1984.
•
Jaulmes Ch., Jude A., Querangal J., Delga J. Práctica de Laboratorio. Toray/Masson. 1970.
•
Luna L. G. Edited. Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of
Pathology. Mc Graw Hill Book company. 3 ed. 1992.
14
•
Lynch M., Raphael S., Mellor L., Spare P., Inwood M. Méetodos de laboratorio. 2da. Ed.
Interamericana. México. 1972.
•
Martoja R., Técnica de Histología Animal. Toray-Masson S. A. Barcelona ¡ra. Ed. 1970.
•
Policard A., Bessis M., Locquin M. Traité de Microscopie Instruments et Techniques. Masson
et Cie , Editeurs. Paris. 1957.
•
Roveda N. Histología del Sistema Nervioso y Técnicas de su preparación. Cabaut y cia.
Editores Bs. As. 1909.
•
Stohr P. H. Manuel technique d’Histologie. Paris G. Steinheil, Editeur. 1904
15