PRÁCTICA No. 2 Métodos de cultivo y aislamiento de bacterias

PRÁCTICA No. 2
Métodos de cultivo y aislamiento de bacterias
Objetivos. Que el alumno conozca las diferentes técnicas de aislamiento en
medios de cultivo sólido para la obtención de cultivos puros de bacterias. Que el
estudiante prepare medios de cultivo de uso general, diferenciales y selectivos
para el cultivo de diferentes especies bacterianas.
Introducción
Las bacterias deben ser cultivadas en medios de cultivo de laboratorio
para caracterizar su crecimiento, hacer su identificación y determinar sus
actividades metabólicas. Un medio de cultivo es una solución acuosa de diferentes
compuestos que contiene todos los elementos indispensables que requieren los
microorganismos para crecer.
Generalmente las bacterias son inoculadas o introducidas en medios
líquidos (caldos) o solidificados con agar para su propagación y/o conservación,
así como para estudiar sus características de crecimiento. Es importante recordar
que la inoculación de los microorganismos en los medios de cultivo, siempre
deberán realizarse en zona aséptica (cerca del mechero o en campana de flujo
laminar), condiciones que limitan la presencia de microorganismos indeseables o
contaminantes.
Las técnicas de aislamiento, permiten la obtención de microorganismos a
partir de muestras complejas (suelo, agua, alimentos, etc.) en las que hay una
gran diversidad microbiana, así como para comprobar la pureza de los cultivos
obtenidos. Los cultivos puros están formados por un solo tipo de microorganismo;
y son indispensables para conocer las características morfológicas, propiedades
de tinción, actividad bioquímica, patogenicidad, sensibilidad a antibióticos e
identificación de las especies microbianas.
El aislamiento de cultivos microbianos puede realizarse por métodos de
dilución, en medios sólidos por estría en placa o en medios líquidos. En el primer
caso se considera que cada célula bacteriana que se separa dará origen a una
población que formará una colonia característica, visible a simple vista.
La limitación principal de estas técnicas de dilución, es que no es
práctica para el aislamiento a partir de mezclas donde el microorganismo de
interés se encuentra en pequeñas cantidades, donde solamente se obtendrán las
bacterias dominantes.
Para favorecer el aislamiento de cultivos de baja intensidad, se aplican
métodos de cultivo especiales, en los que se utilizan medios que contienen
nutrientes especiales, antibióticos, altas concentraciones de sales y/o condiciones
de pH, luz o temperatura para favorecer el crecimiento de microorganismo de
interés y se conocen como selectivos o de enriquecimiento.
En ocasiones se pueden agregar a los medios de cultivo otros
componentes como: sangre, colorantes, indicadores, etc. Para distinguir especies
bacterianas diferentes por la forma en que metabolizan los sustratos que se
manifiesta por cambios en la apariencia o modificación del pH del medio de
cultivo. Estos medios se conocen como medos diferenciales y son de gran utilidad
para la caracterización e identificación de especies bacterianas.
Materiales
3 cajas de Petri con Agar nutritivo
3 cajas de Petri con Agar de eosina azul de metileno EMB
3 cajas de Petri con Agar papa-dextrosa
1 Mechero
1 Asa de siembra
1 Parrilla de agitación
1 Autoclave
Procedimiento
El alumno recolectara muestras para ver el tipo de microorganismos que
estan presentes en estas muestras.
Técnica de estría cruzada
a) En la parte posterior y exterior de la caja, dividirla en cuatro
cuadrantes. Tomar una muestra con el asa previamente flameada y
fría, inocular la muestra haciendo 4-5 estrías simples muy juntas de
lado a lado borde el primer cuadrante de la caja, cerrar la caja
(Figura 4).
b) Flamear el asa de inoculación y hacer girar la caja de Petri un cuarto
de vuelta. Abrir nuevamente la caja y enfriar el asa de siembra
tocando la superficie del medio lejos de la zona de estrías recién
hechas.
c) Rozar con el asa una vez la superficie del conjunto original de estrías
y hacer un segundo grupo de estrías en el segundo cuadrante como
en el caso anterior.
d) Repetir el procedimiento 4 y 5 en el tercer cuadrante y al efectuar la
siembra en el último cuadrante, no se deberá flamear el asa de
siembra y se hará una estría más abierta (simple).
Siembra de cajas de Petri con medios diferenciales y selectivos
1. Hacer grupos de 3 cajas, primer grupo medio nutritivo, segundo grupo y
tercer grupo agar papa-dextrosa. Sembrar en las cajas por estría
2. En otra serie de tres cajas con cada uno de los medios antes descritos,
sembrara por estría cruzada la muestra problema.
Condiciones de incubación
1. Incubar las cajas en forma invertida a 35°C durante 24 horas
Resultados
A. Recopilar la información de la caracterización colonial de cada cepa
en los cuadros 4 y 5
B. De acuerdo a sus observaciones identifique las especies presentes
en la muestra problema.
Cuadro 4
Morfología colonial de cultivos bacterianos
Muestra 1
Muestra 2
Aislamiento por
Estría cruzaca
Forma:
Color:
Tamaño (mm)
Borde:
Superficie:
Aspecto:
Elevación:
Luz transmitida:
Luz reflejada:
Consistencia:
Medio Nutritivo
Agar EMB
Muestra 3
Agar papa-DX
Siembra
en
medios selectivos
y diferenciales:
Microorganismo
1:
Forma:
Color:
Tamaño (mm)
Elevación
Luz transmitida:
Luz reflejada:
Consistencia:
Nota: La descripción colonial puede hacerse considerando los siguientes criterios
Forma: circular, irregular, filamentosa o rizoide
Borde: entero, lobulado, aserrado
Superficie: lisa o rugosa
Aspecto de la colonia: húmeda, seca, butirosa
Elevación: convexa, plana, hundida
Luz transmitida: translúcida, opaca
Luz reflejada: brillante, mate
Consistencia: dura, blanda, mucoide
Cuestionario
1. ¿Qué es el agar y de donde se obtiene? ¿Cuáles son los nutrimentos que
proporciona a los microorganismos?
2. ¿Cuál es la composición química de los medios: medio nutritivo, agar EMB,
Agar papa-dextrosa.? ¿Cuáles son los componentes o propiedades
responsables de su función como medios selectivos o diferenciales?
3. ¿Por qué el agar nutritivo es un medio de uso general para el cultivo de
bacterias? Proponga algunas sustancias que se le agregarían para hacerlo
selectivo para bacterias Gram negartivas?
4. Bibliografía consultada
Referencias Bibliográficas
• Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. 1983. Prácticas de laboratorio en
Microbiología. Ed. Limusa México.
• Compendium of Methods for the Microbiological Examination of
Foods (4th Edition). Edited by Frances Pouch Downes and Kelth Ito,
200
• Practical Handbook of Microbiology.CRC Press, 1989. William M
O’Leary, Cornell Medical College, New York, New York, USA.
• Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. 9th edition, The
Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.
• Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater.
American Public Health Associated (APHA), American Water Eorks
Association (AWWA). Standard Methods for the Examination of
Water and Wastewater Ed. (1991).