ii. aislamiento del hongo

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JOSÉ: Bl:NIlO 51AK'rIN17
,\tientras i^ue el autckla^^e tcnxa presión, n^^ dehe abrir;e la Ita^^e de despren^íimient<^ c1e capnr, por^kue la ^lescompretiión brus.a deterioraría los ubjetos qu^e s,e
e^terilizan.
^.a keparto del yrre^lio preparado en ti,^bos y matyaces. - Después de la filtración, y mientras qu^ el agar está todavía caliente,
se distribuye ^ste en tubos y matraces de res^erva, por medio de un
embudo (embudo repartidor), teniendo cuidado d^e no manchar
los bordes de los recipientes.
Las cantidacles de substrato que se deben poner ^en cada tubo,
son las siguientes:
Yara las sirmbras en estría (tubos en bisel), dos dedos.
Para l^^s aislamientos en caja Petri, de dos a cuatro dedos, según las dimensione^ cle caja.
6.^ Esterili^aczón de los medios de c^tiltivo contenidos en los
trebos y matraces. - Se hace en el autoclave, a t^ 5", durante veinte minutos, y por último, después de la esterilización, se deja solidificar el substrato, poniendo los tubus o matraces: unos, derechos,
y otros, inclinados, para formar el bisel.
;.a Preparacicín de las cajas Petri para la sientbra.-Los tubos. de que antes hablam^os, que contienen el substrato sólido ^esterili^ado, se ponen al haño de I^laría hasta que s^e licue el agar,
é inmeciiatamente se vierte su contenido en las cajas Petri, lo más
rápidamente posible, para evitar contaminaciones. Una vez enfriacías las cajas y solidificado el substrato, se las invierte (con el fondo hacia arriba) y se las coloca de este modo en la estufa de cultivo; en donde se las tiene algún tiempo en observación. Las que
queden estériles, al cabo de ese tiempo, son aptas para hacer la
siemhra; las otras, hay que desecharlas. Conviene preparar, para
cada siembra, 5-to cajas Petri.
II. A[SLAMIENTO DEL HONGO
La operacicín fundamental y la más d^elicada de la técnica de
cultivos, cualquiera que sea el sistema de aislamiento que se emplee, es la operación de siembra. Cuantas precauciones se tomen
son pocas, pues el menor descuido basta para que se infecten los
cultivos - con hifales del género Penicillíum, sobre todo - y se
pierda todo el trabajo.
'rF.CM('.:1 DL CULTIVO DE LOS HOtiGOS Dl^ LA hS.1DF.KA
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Las siernbras, lus tran,plantes y, en general, todas las operaciones de aislamientu en que haya peligro de infección, deben hacerse en cíepartamentos ad hoc o en camarines cíe siembra previamente desinfectados (^). To^to el instrumental (bisturíes, agujas
c1e siembra, etc.) ha de estar perfectamente esterilizado. E1 operaclor ha de actuar cun las máximas condiciones de asepsia: con
batas de laboratorio esterilizadas, las manos escrupulosamente limpías y desinfectadas y, en algunos casos, incluso con guantes cíe
goma esteriliracíos, sobre toclo cuan^lo sc: realizan siembras c3e micelio, en las que hay que hacer hastantes manipulacione ^^tz), como
]uego veremos.
Los cíos sistemas cie aislamiento que pueden seguirse son :
a) .^isla^niento, partiendo de la espora.
h) .qislarTZietirto, partiendo etel ^nicelio.
Q^ f^ISLAMIENTO,
PARTIENDO DE LA ESPORA^
^) Procedimiento de la agaeja seca de Hanna. -Cansiste en lo
siguiente: En el fondo de una gran caja Petri (i4 cm.3 de cíiámetro
y 2 cm.3 de alto), se coloca una hoja de papel de filtro con ^o aberturas circulares. En cadá abertura se pone una cámara anular de
^ 7 mm,. de diírmetro y io mm. de alto. Cada cámara se cubre con un
disco de vidrio (,sin vaselina). Todo esto se esteriliza en seco. Después del enfriamiento se echa sobre el papel de filtro un poco de agua
esterilizada, y sobre la cara inferior de cada.^isco de vidrio se
pone una pequeña porcicín del substrato nutritivo. Una caja Petri, preparada de tal modo, está ineiicada en sección en la figura 8 A,
y en proyecciún horizontal, en la figura 8 t3.
Sobre una placa d^e vidrio esterilizada, se coloca el esporóforo
clel hongo que queremos aislar, cun el himenio hacia abajo. Des(i) En lus laboratorios de Mic^logía apli^a^la ^debe haber tres d©partamentos: uno, dedicado a SistemáCica; otru, a la E^repara^iún cle medius de cultivo, y un
tercero de^icado +exclusivamente a las operaciones ^ie cultivo (siembras, transplantes, etcJ. En los laboratorius de Fitopatulogía se necesita, además, una estufá u
in^^ernadero especia^l para hacer in^oculaciunes s^>bre plantas vivas.
(a) Esta precauciGn ha ^ie tomarse espeeialmen[e cuan^o se opera ^ ^in ciert:u
maderas de ^construcción y carpintería, atacadas ^e pu^iriciunes húmeda;, en dunde
suelen eneuntrarse, con frecuencia, gérmenes de miçroorganismos patógenos.
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J(1SÉ BfNI'rO MAR'rÍNE7.
pués de un cierto tiempu (con algunos hongos basta^n 1-z minutos),
se deposita ^en la placa una cierta masa de esporas, al parecer muy
numerosa; pero si se mira la placa al microscopio se ve que estas
esporas están bastante separadas entre sí. Aún en el caso en que
PROCEDIMIBNTO DF. LA AGUJA SECA UE HANNA
F5'g. 8.-A, caja Petri, con las cámaras anulares en secciGn transversal; B, caja
Petri en pr^yección horizontal; P, cámaras anulares; C, aguja de siembra; U, dis^positi^o para ha^cer la siembra.
haya caido una gran cantidad de esporas, se puecl^en encontrar zonas en que las esporas ^estén suficientemente separad;as para pocler
elegir la espora necesaria para la siembra. I'ara hacer esta yelecci^n,
se mueve la placa de vidrio en la platina del microscopio, hasta que
en el centro d^e( campo aparece la espora de tamaño y forma desea^
TÉCNI(^.A DE CL't.'I'IV0 DE LOS HONGOS DE LA M.4DEKA
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da. Después, tomando una aguja de siembra (fig. S C) ^entre los dedos pulgar e índice ^de la mano derecha, se desplaza su punta, lentamentc, hasta que toque la espora deseada. Tan pronto ocurre esto,
la espora se adhiere a la punta de la aguja (I ), la cual está entonces dispuesta para hacer la siembra.
1.a operacicín íle la siembra se haoe, cíando un s^:ncillo toque
con la punta ííe la aguja en el substrato nutritivo, que se encuenPROCF.DIMIC•NTO DE L.4 AGUJA SECA DE HANNA
i^ig. y. -- Aspecto de la placa de vidrio con las esparas y de la aguja de siembra,
tal como aparecen al microscopio, con pequeño aumento.
tra en la cara inferior de las discos de vidrio, que cubren las cárnaras anttlares.
Observando el substrato nutritivo al microscopio, se puede
ver rápidamente el lugar en donde se hizo la siembra y convencerse, en efecto, de que la espora se encuentra allí. Después, cuando la espora germina en la cámara anular y forma micelio, éste
se transplanta del disco de vidrio a una caja Petri ordinaria, con
substrato de agar-malta.
(^) La facultad de las esporas de adherirse a las puntas puede ser explicada
ciel siguiente mocio: Las esporas son cuerpos de {^equeñísimo tamaño ( del orden
de micras), pero tienen una gran superficie, en relación con su masa. Debido a esto,
la fuerza de con^atenación actúa en ellas con más intensidad que la fuerza de la
gravedad. Por esta misma causa, se produce la adherencia de las esporas a lás puntás.
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_iutií: isi^vrru tit.^K^rítii^.z
Para hacer el transplante se puede emplear una aguja cle platinc^ esterilizada o, mejc^r aún, un trucitci de una cuchilla de afeitar de i cm. de anchc^, cc^l^^cada en un mangc^ de madera (fig. 8 U).
Con auxilio ^je este pequeño instrument<^ se puede sacar, sin causar da^^o, el joven micelio del disco de vidrio.
Se^ún las experiencias cie Hanna, el método de la aguja seca
puede s^er empleacic^ con éxito para el aislamiento de ]os honges
del grupo de lc^s Iiimeniafes, que es en donde se ^encuentran precisamente los hon^c,s cíestructc^res de la madera.
z) Procedrmle^7to de la espora ímica de Kertt, modi/icado por
F.Zekiel.-Cc^nsiste en Ic, si^uiente: Llénense varias cajas Petri
con agar-m.^lta, !c^ má, transparente pc,sihle (agar, ^o-^ 5 g.; extract<i de malta, zo-;c^ ^.; a{;ua clestiLa^ia, i litro). La c^nsi^stencia del
a^ar-malta es también cie importancia. Debe permitir hacer con
la aguja de siembra las rayas características del procedimiento, y
no clebe estar ci^emasiade^ enelurecido, a fin de que se puedan cortar los discos de agar, de que luego hablaremos. Inviértanse estas
cajas Petri, tan pronto como ha tenido lugar la solidificación del
agar, y ténganse así, por espacio de veinte hc^ra^, hasta que ninguna gota c1e líquicio apare•r.ca sobre la superfieie ciel agar. La cantidad de agar que hay que pc^ner en cada placa varía con el grueso
del fondo cie la caja, puesto que la observación microscí^pica se
hace a través clel fundo, mirandc^ pur su parte exterior. Con la caja
Petri stancz`ard (c^5 mm. cie diámetro) hay que echar en cada caja
d^e 6 a R un.^; c{el substrato indicado.
Hágatie entonces una dilucicín de espc^ras, en una solucicín acuosa de agar al ^ por i.c^oo, y pc^r medio de una aguja de platino,
con punta en forma de espátula, se hace la siembra, trazancio en
el agar cuatro u cincu rayas paralelas y separadas entre sí z-z,5 cm.
i..a a^uja debe ^irar un poco entre los ciede^s, al empezar cada raya,
d^e tal modo, qire siempre se pu^eda pon^er en contacto con el agar
una superficie nueva de la aguja. D^e este modo, la primera raya
tendrá las esporas relativamente am^ntonadas, y las siguientes
las tendrán catia vez más separadas (fig. io).
Con espc^ras ubs^curas (^eospor^), se puede hacer la selección
inmeciiatamente, pero si se trata de esporas hialinas (hialoesporc^),
hay que esperar de die^.iséis a veinticuatrc^ huras, para que las esporas terminen y se facilite la c^bservaciún.
I.a caja Petri se observa, a través del fondo, sin abrirla; pri-
'I'ÉCNI^:A DE CUI.TIVO DF LOS HOtiGOti DF 1.:1 51ADF^.RA
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n1C1'amente, COn el OhJetlvO Cie lo aUnlentUS S^ ^1^,Uen iaJ ra)^as il^S-
ta que se encuentre ima espora que esté sola. I^sta se e^,amina ^ntonces co ❑ el ubjetivo c1e zo aumentos, para as^egurarse c1e que en el
punto observaclo sí^lo hay una espora. i^ lecho esto, se pone un punto de tinta en el sitio en dond^e se encuentra la espora. Se exa-
}^ig. ^o.--C, caja Petri ^con las rayas características del pruce^limiento; a, 8, agujas de siembra; T, tubo ^1e cultivn con el ^lisco ^ie agar-malta qu^e contie^e la
espora única.
n11na 'entOnGeS tOCia 11 "LOna CirCUIICiante, y S1 reSUita C^Ue, etectl-
vament^e, la espora observacía está aislada, se traza con (a pluma
un círculo alreciedor ciel punto de tinta.
Se abre entonces la caja Petri, y por mecíio de una aguja esteriliracla, con pttnta en forma de tubo (no representada en Ia
fi^ura), se hace rápidam^ente una incisión circular alrededor del
punto señalado con tinta. Se vuelve a cerrar la caja, se quita el
punto de tinta y se eaamina si el p^equeño cilindro o disco de
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JOSf: E3FaI'r0 ^^1;^R"rÍNF:7_
agar, señalado con la aguja tubiforme, contiene la espora elegida
y ninguna otra más.
Comprobado esto, se abre la caja y se introduce la aguja dc
platino de forma de espátula debajo del disco, para extraerlo y
transportarlo sobre el bisel d^e agar de un tubo de cultivo. EI disco
debe colocarse en el borde del bisel, con su cara superior pegada
al tubo y hacia la parte inferior cíel bisel, para que el hango encu^entre la humedad suficiente. Terminada la operación, se comprueba nuevamente con el microscopio si en el disco sóio hay una
espora, y en caso afirmativo, ya se puede poner el tubo en la estufa de cultivo.
b^
AISI.AMILNTO,
PAR^'IENDO DEL MICELIO.
Este sistema es el que se emplea, generalmente, cuando se trata de aislar los hongos típicos d^e la madera, ya sea partiendo del
tejido del esporóforo o ya de la madera atacada. Puede practicarse por dos proc^.iimientos:
I. I_os trozos de esporóforo o de madera atacada, bien lavados y limpios, se desinfectan introduciéndolos 5-lo minutos en
una soluci(ín de sublimado al 1-2 por ^ .ooo; después, se lavan perfectamente cc^n agua esterilizada, y, por último, se secan con papel secante esterilizado. Después, con un bisturí, previamente flameado, se quita la capa exterior d^el esporóforo o de la rnadera y se
hace un raspado en su parte interna. El polvillo, que cae, se echa
en un tubo de ensayo que contiene agua esterilizada; con esto.
ya tenemos el caso reducido a hacer un ai^slamiento, partiendo de
la espora (las esporas están representadas aquí por las partículas
de micelio;. Este procedimiento tiene el inconveniente cíe que las
pequeñas porciones de micelio se encuentran de improviso en contacto con el agar, que es un medio nutritivo muy distinto, por su
composición, del natural, en que el micelio ha vivido, por lo cual.
muchas veces, no resisten un tránsito tan brusco y se mueren.
II. 1'ara evitar este inconveniente del raspado, se extraen pequeños trozos del esporóforo o de la madera atacacía y se transportan rápidamente a las cajas Aetri o a los tubos que contengan
el substrato de agar. De este modo, el micelio que se halla en el
tejido del esporcíforo o de la madera suele pasar, gradualmente,
'1'I^:CNICA UE CUL"1^1V0 DF LOS HONGOS DI-: LA MADFRA
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c1^e ^u vicla para^itaria habitu^ ^ I ^^ l. ^ saprcífita, en el mecliu c1e cultivu,
1_.a reseccicír, del troiu de teji^lo, que se ha de transportar al
agar nutritivo, se hace pc^r m^eclio ^cle un bisturí. Con éste, después de esterilizadu a la llama, se arrancan virutas c, astillas, o bien
se hacen cuatro incisiones, ^ie mocí^ cle limitar un recti ^ ngulo de
5 X 7 mm. Cuando se trata ae madera, es preferible que el lado
mayor de este rectángulo esté orientaciu en el sentido longitudinal de los elementos fibru-vasculares, porque el micelio se desar ^ olla generalmente en ese senticjo. llechas estas incisiunes, ei
mismo bisturí, introduci^lo en direccicín tangencial y ublicua, puede levantar un truro de tejido cíe pocu espesur y cíe la dimensiún
deseada. Una vez obtenido el trozu de tejido, se deja caer en la
caja Netri o en el tubu ^1e cultivu que contenga el agar nutritivo,
y después, con la aguja c1e platino, se pune el trozo introducido en
posicic^n conveniente, acihiriéndole ^erfectamente al agar u, m^ejor
aún, introduciéndole un pcycu en él.
Y, para terminar, vamos a inclicar un método para vivificar
los ciiltivos viejus, que no dejará de tener aplicación en las investigacion^es sobre conservación cle maclera.
^7F:TODU llE hOVAH PARA VIVIFICAR LOS CULTIVOS VIEJOS.
Cuando se tienen en un laboratorio cultivos puros de hongos,
ucurre con frecuencia que, cíebido a la larga permanencia de los
hongos en los tubos de cultivu, sin haber hecho los debidos transplantes (1), los cultivos languidecen faltos de vitalicíad. Aara reanimarlus, propttso 1-^ovah ^el proceclimiento siguiente:
Tn los tuhos que contengan cultivos viejos, se vierte una pequeña cantidad cle agar caliente. Después, se les coluca en posi^i^>n inclinada, para formar el biçel, y una vez solidificado el agar,
se les lleva a la estufa cíe cultivu, a la temperatura c1e z8°. A1 cabo
cíe uno o cios días ^e ve, en muchos casos, que los cultivos recohran stt vitalidad y brotan con e^:uberancia.
(i ) Los transpiantes deben hacerse, p^^r lo menus, men;ualmente. La operaci6n ^1e transplante rcquiere las manipulacion^e, siKuientes: