3º congreso de la asociación ibérica de endocrinología comparada

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Isorna et al.
REGULACIÓN AMBIENTAL DE LA SENSIBILIDAD DE LOS TEJIDOS A LA
MELATONINA EN EL ANURO Rana perezi. LOCALIZACIÓN DE LOS
RECEPTORES DE MELATONINA.
E. Isorna1,2, A.I. Guijarro1, N. de Pedro1, M. López-Patiño1, M.J. Delgado1,
J. Falcón2, A.L. Alonso-Gómez1.
1. Dpto. Fisiología (Fisiología Animal II). Facultad de Biología, Universidad
Complutense de Madrid. España. 2. Laboratoire Aragó. Université Pierre et
Marie Curie (Paris VI)-CNRS. Banyuls sur Mer. France.
La melatonina (MEL, 5-metoxi N-acetiltriptamina) se considera un
mensajero capaz de codificar la información ambiental facilitando la
adaptación de numerosas funciones cíclicas diarias y estacionales a
los cambios ambientales. En este estudio hemos investigado la
localización y regulación de los receptores de MEL en el anuro Rana
perezi. Los estudios autorradiográficos apoyan la hipótesis de que en el
sistema nervioso central de anfibios la MEL tiene un papel relevante en
la percepción e integración de la información visual, así como en la
regulación neuroendocrina. La clonación de un fragmento del receptor
MT1 y su localización en diversos tejidos sugieren que en la rana
algunas de las acciones de la MEL se ejercen a nivel periférico.
Además, mostramos que el receptor de MEL es una estructura capaz
de ser regulada por el fotoperiodo y la temperatura, siendo por tanto un
elemento activo del sistema que transduce la información ambiental en
una señal hormonal. Al igual que ocurre para la síntesis de MEL, en la
rana, la temperatura es un factor ambiental crucial regulador de la
interacción de la MEL con su receptor así como de la transducción de
la señal hormonal.
Introducción
La MEL se sintetiza en la retina de los anfibios con una marcada ritmicidad
diaria y estacional, donde además de desempeñar funciones intraoculares es
liberada a la circulación (1). Si bien se cree que la mayoría de las funciones de
la MEL se realizan en tejidos del sistema nervioso central (ojos y encéfalo),
donde se ha descrito la presencia de receptores de MEL en Rana perezi (2),
las áreas diana concretas de la hormona no se conocen. Por ello hemos
realizado estudios de autorradiografía en el encéfalo de esta especie.
Además, para identificar qué subtipo o subtipos de receptores de MEL se
expresaban en la rana, hemos clonado un fragmento de un receptor
semejante a MT1 y estudiado su expresión por RT-PCR en diversos tejidos
centrales y periféricos, ya que algunos trabajos apuntan a la existencia de
funciones de la MEL mediadas directamente por tejidos periféricos.
Al igual que en otros poiquilotermos, en R. perezi la escotofase regula la
duración del pico nocturno de MEL, mientras que la temperatura regula la
amplitud del mismo (1,3). Sin embargo, se ignora si los tejidos diana para la
MEL pueden, mediante cambios de sensibilidad, contribuir a un ajuste fino de
la respuesta del organismo a la señal de la hormona. Por ello, utilizando
ensayos de radioligando sobre membranas aisladas, nos propusimos
averiguar el posible efecto que tiene la exposición de los animales a diferentes
condiciones de iluminación y temperatura sobre los receptores centrales de
MEL en R. perezi. Por otro lado, investigamos cómo puede afectar la
temperatura de un modo directo a la transmisión de la señal melatoninérgica,
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Localización y regulación ambiental de los receptores de MEL
estudiando el efecto de este factor ambiental sobre la interacción de la MEL
con su receptor.
Material y Métodos
Hemos utilizado ejemplares adultos de Rana perezi procedentes de Orense
(España), mantenidos en fotoperiodo 12L:12D y 22ºC de temperatura, durante
al menos 2 semanas. Las autorradiografías se realizaron siguiendo el
protocolo previamente descrito para mamíferos (4). La preparación de las
membranas y los ensayos de radioligando se realizaron siguiendo el protocolo
descrito por Isorna et al. (2). La clonación del receptor de MEL se realizó
utilizando oligonucleótidos degenerados para los dominios conservados en
otras especies de vertebrados “CHSLPYD” y “CWAPLN”. El producto obtenido
por PCR se clonó en el vector PGEM-T Easy (Promega) siguiendo el protocolo
del proveedor y se transformaron bacterias por electroporación. Secuenciado
el fragmento, e identificado como un receptor de tipo MT1, se diseñaron
oligonucleótidos específicos para los estudios de Retrotrascripción InversaPCR (RT-PCR) en los distintos tejidos estudiados.
Resultados y Discusión
1. Autoradiografías para sitios de unión a MEL en el encéfalo de Rana
perezi. El análisis autorradiográfico revela una amplia distribución de los sitios
de unión a MEL en el encéfalo de Rana perezi, con una localización tanto en
somas como en fibras nerviosas (Fig. 1). Se han identificado más de 30 áreas
con receptores de MEL, apoyando una posible función neuromoduladora de la
MEL en muchas y diversas áreas del encéfalo. No obstante, las mayores
densidades encontradas en áreas visuales relacionadas con la percepción e
integración de la información visual (techo óptico, tracto óptico, núcleos
interpeduncular y oculomotor), así como en el hipotálamo (área preóptica,
área supraquiasmática, núcleos hipotalámicos), refuerzan la hipótesis del
papel clave desempeñado por la MEL en la regulación de funciones visuales y
como mediador neuroendocrino en poquilotermos (2).
A
B
SP
ST
lfb
Hb
MTN
ot
LTNr
otr
SCN lfb
mfb
C
OT
TdIs
Tv ft Im
IP
tbsp
Figura 1. Autoradiografías para [125I]Mel a tres niveles del encéfalo de R.
perezi. Secciones transversales (20 m): A, Telencéfalo, B, Diencéfalo, C:
Mesencéfalo posterior. A la izquierda se presenta el autorradiograma y a la derecha un
esquema con las estructuras identificadas. ftg, fascículo del tegmento; Hb, núcleo
habenular; Ip, núcleo interpeduncular; Is, núcleo del itsmo; lfb, cerebro anterolateral; lm,
lemnisco; LTN, núcleos talámicos laterales; mfb, cerebro anteromedial; MTN, núcleos
talámicos mediales; OT, techo óptico, otr, tracto óptico; SCN, núcleo supraquiasmático;
SP, Septum; ST, Estriado; tbsp, tracto tectobulboespinal; Td, núcleos dorsales del
tegmento; Tv, núcleos ventrales del tegmento.
2. Clonación de un receptor de tipo MT1 a partir del techo óptico de R.
perezi y localización de su expresión por RT-PCR en diversos tejidos.
Hemos clonado una secuencia parcial (378 pb) de un receptor semejante al
MT1 a partir del techo óptico de rana. La localización de este fragmento
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Isorna et al.
utilizando oligonucleótidos específicos en el telencéfalo y el techo óptico,
corrobora los resultados obtenidos en las autorradiografías y refuerza dichas
funciones propuestas para la hormona. Sin embargo la ausencia en el
diencéfalo sugiere que otros subtipos de receptores pueden estar
coexpresándose en el encéfalo de esta especie, como ocurre en otros
vertebrados. Además, los resultados sugieren que en Rana perezi algunas de
las acciones de la MEL se ejercen a nivel periférico, ya que nuestro estudio
demuestra, por primera vez en los anfibios, la expresión de MT1 en intestino,
hígado y músculo. Si bien no descartamos la presencia de receptores de MEL
en otros tejidos periféricos como gónadas, riñón, corazón o bazo, donde la
expresión es probablemente muy baja, así como la existencia de distintos
subtipos de receptores.
3. Influencia del fotoperiodo sobre los receptores de MEL. En el encéfalo y
la retina de R. perezi, los sitios de unión a MEL presentan un ritmo diario
inverso al de la hormona, con la acrofase durante el día, sugiriendo la
existencia de un ritmo en la sensibilidad al indol (5). Tras exponer a los
animales durante 7 días a luz continua u oscuridad continua, los sitios de
unión a MEL no difieren en los tejidos encefálicos entre ambos grupos, lo que
sugiere que los ritmos diarios de receptores no estarían determinados por la
luz en el techo óptico, el telencéfalo y el diencéfalo, pudiendo tener por tanto
un carácter endógeno o ser dependientes de los niveles de MEL. En la retina,
por el contrario, la iluminación continua aumenta la capacidad del tejido para
unir MEL respecto a la oscuridad continua. Sin embargo, la propia hormona in
vitro no desensibiliza sus receptores tras 7 horas de tratamiento, por lo que
sugerimos que los ritmos diarios observados en la retina están regulados
directamente por el ciclo diario luz:oscuridad (5).
4. Modulación de la interacción receptor-ligando por la temperatura del
ensayo. Ensayos realizados con membranas aisladas de la retina de R.
perezi muestran que existe una compensación térmica de la constante de
disociación (Kd) y la unión máxima (Bmáx) (Fig 2A). Sin embargo, las tasas de
asociación y disociación del ligando a su receptor aumentan
exponencialmente con la temperatura. Además, el grado de activación de
proteínas G tras la unión de la MEL a su receptor, medido como la
concentración del análogo no hidrolizable del GTP (GTPS) necesaria para
inhibir la unión del ligando, también disminuye a baja temperatura (Fig 2B).
B)
A)
Figura 2. Efecto de la temperatura del ensayo sobre la unión del ligando
a su receptor y la activación de las proteínas G asociadas. A)
Modificaciones de las tasas de asociación (K+1) y disociación (K-1), y constante
de disociación (Kd). B). Cambios en la inhibición de la unión por GTPS.
4
Localización y regulación ambiental de los receptores de MEL
Por tanto, el hecho de que tanto las tasas de asociación y disociación del
ligando, como que la activación de las proteínas G acopladas a los receptores,
se reduzcan muy notablemente a temperatura baja, confirma el papel clave
que ejerce este factor ambiental en el control de las funciones estacionales de
la MEL en poiquilotermos. Ni la temperatura de aclimatación de los animales
(30 días a 5 ó 22 ºC) ni la estación del año (invierno y verano) afectan a la
capacidad de los tejidos encefálicos y la retina para unir MEL, ni a las
características cinéticas de la unión receptor-ligando (Tabla 1).
Tabla 1. Efecto de la temperatura del ensayo y de la temperatura de
aclimatación sobre los parámetros cinéticos de la unión (K+1, K-1) y la afinidad
(Kd) del receptor de MEL en la retina de Rana perezi.
Temperatura del ensayo
15°C
Tª de aclimatación
22°C
25°C
22°C
5°C
K+1 (pM -1·min-1) x10-3
0,11  0,01 0,11  0,01
5°C
0,31  0,04
0,36  0,04
K-1 (min-1) x10-3
Kd cinética
2,06  0,17 1,64  0,21
18,78
1,84
10,49  0,76
34,42
7,72  1,10
21,57
Por tanto, proponemos que durante el invierno las funciones de la MEL
pueden verse afectadas por un bloqueo de la interacción con su receptor o
con la activación de los segundos mensajeros, ya que el enlentecimiento de la
cinética así como la menor activación de las proteínas G asociadas al
receptor, podrían bloquear la transducción de la señal diaria de MEL (6).
Agradecimientos
Este trabajo ha sido financiado por el MCYT (proyecto BFI2001-1368), y por
una beca predoctoral del MECD a E. Isorna. Los autores agradecen la ayuda
de la Dra. M. Masson-Pévet en la realización de las autorradiografías.
Bibliografía
1. Delgado MJ, Vivien-Roels B 1989 Effect of environmental temperature and
photoperiod on the melatonin levels in the pineal, lateral eye and plasma of
the frog, Rana perezi: importance of ocular melatonin. Gen Comp Endocrinol
75:46-53.
2. Isorna E, Guijarro A, Delgado MJ, Alonso-Bedate M, Alonso-Gómez AL
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the frog Rana perezi. Gen Comp Endocrinol 135:259-267.
3. Delgado MJ, Alonso-Gómez AL, Gancedo B, De Pedro N, Valenciano AI,
Alonso-Bedate M 1993 Serotonin N-acetyltransferase and melatonin levels
in the frog retina are not correlated during the seasonal cycle. Gen Comp
Endocrinol 92:143-150.
4. Masson-Pévet M, George D, Kalsbeek A, Saboureau M, Lakhdar-Ghazal N,
Pévet P 1994 An attempt to correlate brain areas containing melatoninbinding sites with rhythmic functions: a study in five hibernator species. Cell
Tissue Res 278:97-106.
5. Isorna E, Delgado MJ, Guijarro AI, López-Patiño MA, Alonso-Bedate M,
Alonso-Gómez AL 2004 2-[125I]-Melatonin binding sites in the central
nervous system and neural retina of the frog Rana perezi: regulation by light
and temperature. Gen Comp Endocrinol 139:95-102.
5
Isorna et al.
6. Isorna E, Guijarro AI, López-Patiño MA, Delgado MJ, Alonso-Bedate M,
Alonso-Gómez AL 2005 Effects of temperature on 2-[125I]-iodomelatonin
binding to melatonin receptors in the neural retina of the frog Rana perezi. J
Pineal Res 38:176-181.