ensayo de tiempo de floración en diferentes mutantes de

ENSAYO DE TIEMPO DE FLORACIÓN EN DIFERENTES MUTANTES DE
ARABIDOPSIS THALIANA.
Ramos Cruz D., De Folter S., Marsch Martínez N., Zuñiga Mayo V. M.
Facultad de Química/ Centro de Estudios Avanzados del IPN (CINVESTAV
Irapuato), unidad LANGEBIO.
RESUMEN.
Arabidopsis thaliana es de las plantas mejor caracterizada y se ha utilizado ampliamente
por la comunidad científica como modelo de estudio por la disponibilidad de su genoma
y tamaño que facilitan los estudios de mutagénesis; en este laboratorio se han generado
diversas mutantes de A. thaliana. y en este estudio se pretende analizar si algunas de las
mutantes están afectadas en el proceso del tiempo de floración ya que la posterior
caracterización de los genes que participan en las vías moleculares de la floración se
realizan mediante el análisis de mutantes que presentan alteración en el proceso del
tiempo de floración.
INTRODUCCIÓN.
Arabidopsis thaliana pertenece a la familia de las crucíferas, su ciclo de vida dura entre
seis y ocho semanas, durante este periodo ocurre la floración, etapa que determina que
la planta pase de una fase vegetativa a una fase reproductiva.(Marsch y col, 2008) Los
recientes estudios moleculares han comenzado a revelar las cascadas de regulación
transcripcional involucradas en el desarrollo de la flor, entendiendo varios aspectos del
desarrollo y definiendo las vías que controlan la formación de la flor, las cuatro vías
descritas (Fig. 1.) corresponden a señales físicas, químicas y biológicas que determinan
el inicio de la floración; (Komeda Y, 2004 i).Vía de las giberelinas: Las giberelinas son
factores reguladores del crecimiento de la planta. El acido giberélico es una fuente para
la floración en plantas de días largos como A. thaliana. ii)Vía autónoma: esta vía regula
la expresión del represor de la transición floral FLC, una elevada expresión de FLC
causa retardo en la floración siendo el gen FRIGIDA (FRI) un regulador positivo para
FLC, los genes FCA LD FVE, FPA y FY, son represores del gen FLC.(Quesada, 2003)
iii)Vía de vernalización: De los genes identificados en esta vía ,VRN2 y VP4 juegan un
papel represor en la expresión de FLC, iiii)Vía dependiente de la luz: Los genes PHYA,
PHYB, CRY1 y CRY2 son los genes clave de esta vía, los genes LHY, CCA1, ELF3 y
TOC1 procesan la señal y la transmiten al gen GI que activa a CO, gen responsable de
la floración temprana. Estas vías finalmente activan genes de la identidad del
meristemo floral (FMI) tales como LEAFY (LFY) y APETALA1 (AP1), los cuales se
aseguran de que el primordio adopte la identidad de flor, mientras que el gen FT es el
responsable de la evocación floral(Komeda y Krizek, 2005).. En A. thaliana, los genes
que promueven la floración han sido identificados a través de la caracterización de las
mutantes de floración retardada, por tanto este estudio se centrara en el análisis y
comparación entre el tiempo que tardan en florecer las plantas transgenicas en relación
con las plantas silvestres. Del ecotipo COLUMBIA se tienen las mutantes: Agl14 gen
de la familia de agamus like, la cual es knock out, Wip 2/3 es una doble mutante
insercional knock out, IAA27 gen perteneciente a la familia de proteínas de respuesta a
auxinas, mutante de silenciamiento y el factor de transcripción perteneciente a la familia
de homeodominio (HAT)siendo mutantes de silenciamiento HAT 4.3-8, HAT 4.3≈7,
HAT 4.3 D3 y HAT 4.3-7F, mientras que HAT 4.3 ins 23-3 es una mutante knock out,
las 5 observaciones diferentes en HAT se refieren a plantas que fueron transformadas
independientemente. Del ecotipo WS, se deriva la mutante EMPTY SILIQUE (ES),
mutante con sobreexpresión de un gen de la familia citocromo P450.
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Fig. 1. Vías genéticas de la floración en Arabidopsis thaliana. Regulación positiva (flechas), regulación negativa
(líneas T).
OBJETIVO: Identificar si alguna de las mutantes (ES, Agl14, Wip2 y 3, IAA27 y
HAT) está afectada en el proceso del tiempo de floración.
MATERIALES Y MÉTODOS.
Ensayo de floración: Se sembraron semillas en charolas y se Incubaron 3 días a 4°C.
Pasar las charolas con las semillas a la cámara de fotoperiodo a 22°C. La semilla
germina de 3 a 4 días. Después de la germinación de la semilla, esperar dos semanas
para comenzar el monitoreo. Se comienza a monitorear cada día, cada planta para ver si
hay inflorescencia. Llevar una bitácora, donde apuntar el número de hojas y el número
de dias que tardo la planta en producir la primera inflorescencia. El parámetro de
floración se estableció en contar el número de hojas de la roseta hasta la primer caulina
y el hecho de que la inflorescencia tuviera de 3 a 5 mm de largo para comenzar a contar.
Con los datos obtenidos de número de hojas y número de días que tardo la planta en
producir la primera inflorescencia, se realizo el análisis estadístico con la prueba T de
Student para muestras con varianzas diferentes con una confianza del 99% para los 2
ecotipos y las plantas genéticamente modificadas.
RESULTADOS.
El primer ensayo de floración se realizó entre el ecotipo Columbia y las mutantes
generadas en este ecotipo, obteniéndose la diferencia que presentaban dichas mutantes
en el tiempo de floración, en relación con la planta silvestre COL. Fig. 1 y Tabla 1.
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Fig. 1. La grafica muestra los promedios obtenidos para COL y las diferentes mutantes, tanto para el número de hojas
que producen y el tiempo que se tardan en producir la primera inflorescencia. El número de plantas analizadas fue:
para COL 32, para Wip 2/3 67, para Agl14 59, para HAT (4.3 ins 23-3) 59, para HAT (4.3-7D) 23, para HAT (4.3-8)
29, para HAT (4.3=7) 31, para HAT (4.3-7F) 33.
Tabla 1. La tabla muestra la diferencia obtenida para las mutantes en relación con la planta silvestre COL, datos
obtenidos mediante la prueba estadística T de Student.
Mutante
Wip 2 y 3
Agl 14
IAA27
HAT 4.3 INS 23-3
HAT 4.3-7D
HAT 4.3-3-8
HAT 4.3≈7
HAT 4.3-7F
Dias
no hay dif. significativa
si hay dif. significativa
no hay dif. significativa
no hay dif. significativa
si hay dif. significativa
no hay dif. significativa
no hay dif. significativa
si hay dif. significativa
Hojas
si hay dif. Significativa
si hay dif. Significativa
no hay dif. Significativa
no hay dif. Significativa
no hay dif. Significativa
no hay dif. Significativa
no hay dif. Significativa
no hay dif. Significativa
El último ensayo de floración se realizo entre el ecotipo WS y la mutante Empty Silique
(ES).Fig 2 y Tabla 2. Los resultados obtenidos muestran que si hay una marcada
diferencia para el tiempo de floración entre ES y el tipo silvestre WS, pero no hay
diferencia entre ambas para la cantidad de hojas que producen al momento de presentar
la primera inflorescencia.
Fig. 2. La grafica muestra los promedios obtenidos para hojas producidas y tiempo que tarda la planta en producir la
primera inflorescencia. El número de plantas analizadas fue: para WS 32 y para ES 46.
Tabla 2.La tabla muestra los resultados obtenidos mediante la prueba T de Student para la mutante ES en relación con
la planta silvestre WS.
Mutante
ES
Dias
si hay diferencia
significativa
Hojas
no hay diferencia
significativa
DISCUSIÓN.
En las mutantes generadas del ecotipo Columbia, la mutante Wip 2/3 no presento
diferencia significativa en el tiempo de floración, con respecto a la planta silvestre COL,
sin embargo presenta una diferencia significativa con respecto al número de hojas que
produce, lo cual significa que en el mismo tiempo la doble mutante Wip 2/3 está
generando mayor biomasa, que podría ser el resultado de un metabolismo acelerado. La
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mutante Agl14 presenta diferencia significativa tanto para el número de hojas
producidas, como para el tiempo de floración, resultado que nos indica que tal vez este
gen está involucrado directa o indirectamente en el proceso de floración en la planta.
Las mutantes IAA27, HAT 4.3 ins 23-3, no presentaron diferencia con la tipo silvestre
COL, por lo cual se puede descartar la posibilidad de que IAA27 y HAT 4.3 ins 23-3,
esta ultima knock out, tengan una participación sustancial en el proceso que determina
el tiempo de floración de A. thaliana. En cuanto a las mutantes de silenciamiento HAT
4.3-8, HAT 4.3≈7, HAT 4.3 D3 y HAT 4.3-7F, las primeras dos no presentan
diferencia con la tipo silvestre COL mientras que las últimas dos si la presentan para
tiempo de floración, por lo cual se puede pensar que la diferencia en el tiempo de
floración no depende tanto del gen HAT, ya que en la planta knock out para HAT no se
presento diferencia en tiempo de floración, sino del sitio en el genoma en donde cae la
construcción de silenciamiento para este gen.
Para el ensayo entre el ecotipo WS y la mutante derivada de este ES, la mutante
presento retardo en la floración con una diferencia significativa, por lo cual se puede
pensar que este gen muy probablemente este involucrado en el proceso de floración.
Cabe resaltar que esta mutante presenta un fenotipo anormal siendo más alta que la de
tipo silvestre WS, por lo cual se puede pensar que probablemente este gen (CYP78A9)
esta involucrado en la vía de las giberelinas.
CONCLUSIÓN.
De las mutantes analizadas la mutante knock out Agl14 y HAT 4.37F, fueron las que
presentaron una diferencia en el tiempo de floración, comparado con la tipo silvestre
COL, por lo cual sería recomendable realizar otros ensayos para verificar que
efectivamente estos resultados se reproducen; además la mutante Agl14 produce mayor
cantidad de hojas, resultado de la alteración en el metabolismo de esta mutante. Sería
también interesante realizar estudios posteriores con esta mutante para verificar si
efectivamente este gen está involucrado en el proceso de floración y de ser así en que
vía o vías participa. Para la mutante ES que presento también diferencia en el tiempo de
floración es recomendable realizar otros experimentos para verificar si esta mutante
presenta alguna alteración en la vía de las giberelinas.
BIBLIOGRAFÍA.
Komeda Y. “Genetic Regulation of Time to Flowering in Arabidopsis Thaliana”, Annu.
Rev. Plant Biol. 55: 521-535, 2004.
Krizek B. A y Fletcher J. C. “Molecular Mechanisms of Flower Development: An
Armachair Guide”. Nature. 6: 688-698, 2005.
Marsch Martínez N. Y col. “Genómica Funcional de Plantas: Estudio del Desarrollo de
Flores y Frutos.” Acta Universitaria 19 (1): 21-29, 2008.
Quesada V. (2003). “Autoregulation of FCA pre-mRNA processing controls
Arabidopsis flowering time.” EMBO. 22(12): 3142-3152.
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