¿SON UTILES LOS TRASPLANTES NEURONALES PARA EL CONTROL DE CRISIS TÓNICO-CLONICAS? Claudia Castillo, M. S. Mendoza, M. Giordano Laboratorio de Plasticidad Cerebral, Departamento de Neurobiología Conductual y Cognitiva. Instituto de Neurobiología, UNAM Campus Juriquilla. Carretera Qro-S.L.P. km 15.5, Juriquilla, c.p. 76230, Querétaro, Qro. e-mail: clau_205@yahoo.com.mx; mendozasol@hotmail.com; giordano@servidor.unam.mx RESUMEN El sistema nervioso central tiene una capacidad de regeneración limitada, por lo que se han propuesto alternativas como la terapia celular para tratar enfermedades de diverso origen. En este estudio se evaluó el efecto del trasplante de células sobre crisis tónico-clónicas inducidas por kainato. La línea celular M213-2O CL4 (CL4)1, transfectada con el cDNA del GAD67h, se utilizó como fuente de trasplante. Ratas macho Sprague-Dawley se distribuyeron en 3 grupos: trasplante con línea celular control (A), con CL4, y control (CTRL). Ocho semanas después se administró kainato (AK, 5 mg/kg/h). El grupo CL-4 necesitó un mayor número de inyecciones para llegar a crisis tipo FV, mayor latencia de aparición a la primer FIII, FIV y FV y menor número de FIII, FIV y FV. In vitro se evaluó la liberación de GABA por potasio y el contenido total de GABA, también se cuantificó GABA en el tejido. De acuerdo con lo reportado previamente en la literatura 2,3, estos experimentos muestran que el trasplante intranigral líneas celulares gabérgicas pueden proteger contra el desarrollo de las crisis motoras, además los resultados de las mediciones de GABA sugieren que este efecto es el resultado del incremento de este neurotransmisor en el lugar del trasplante. 1. INTRODUCCIÓN Actualmente la farmacoterapia es la primera opción a tratamiento de las enfermedades neurodegenerativas, sin embargo en algunos casos esto reduce los síntomas pero no detiene el progreso de la enfermedad. Aunado a lo anterior, el SNC tiene una capacidad de regeneración limitada, estas razones han impulsado a muchos grupos de investigación a la búsqueda de alternativas terapéuticas, entre ellas el uso de vehículos celulares, es decir la terapia celular, y la terapia génica. La primera consiste en la administración de sustancias de interés al SNC usando como vehículo el trasplante de células. La finalidad es que estas células trasplantadas substituyan a las células perdidas y proporcionen al tejido huésped ciertos factores de los cuales carece 4,5. La terapia génica por otra parte aprovecha los vectores virales para restaurar los niveles de una proteína determinada con el objetivo de retrasar o detener la degeneración neuronal 6-8. Se han producido líneas celulares con características específicas gracias a la inserción de genes en una célula inmortal preexistente o mediante la inmortalización de células a partir de un cultivo primario para así seleccionar aquellas con características deseables, tales como la producción y liberación de ciertos neuropéptidos y neurotransmisores, la expresión de ciertos tipos de moléculas de adhesión, factores tróficos y enzimas biosintéticas y metabólicas 1,9-12 . De particular interés para este trabajo es la línea celular M213-2O de origen estriatal, la cual fue inmortalizada usando el alelo A58 sensible a temperatura del antígeno T grande del SV40 13. Posteriormente se transfectó con el cDNA del glutamato descarboxilasa humana (GAD67h) usando como vector un plásmido episomal basado en el virus de Epstein-Barr. Una de las clonas resultantes (M210-2O CL-4), presenta una alta expresión de la GAD transgénica y una mayor síntesis de GABA y experimenta apoptosis en respuesta a fármacos anticancerígenos 1. Estas células son potencialmente útiles en modelos donde existe deficiencia del neurotransmisor GABA. La epilepsia comprende un grupo de desórdenes caracterizados por crisis recurrentes debidas a la descarga excesiva, hipersincrónica de grupos neuronales cerebrales14. Las causas de la epilepsia son diversas, entre ellas están cambios en las funciones sinápticas y en las propiedades intrínsecas de las neuronas. Se ha sugerido que las crisis epileptiformes pueden ser el resultado de un desequilibrio entre la neurotransmisión inhibitoria y excitatoria en el circuito responsable del origen de las crisis 15. Con esta hipótesis en mente, las crisis podrían ser suprimidas por trasplantes de células liberadoras de GABA en el foco epiléptico, o en sitios que contribuyen a la generalización y propagación de las crisis 4. Una de las ventajas de los trasplantes es que la liberación del neurotransmisor podría estar controlada por acción sináptica de las células adyacentes y por ende estaría bajo control fisiológico. El modelo de desarrollo de crisis tónico-clónicas con ácido kaínico se considera un modelo de epilepsia del lóbulo temporal ya que el tratamiento sistémico con dosis múltiples y bajas de este excitotóxico produce crisis crónicas en las ratas tratadas, presenta un periodo de latencia entre el tratamiento con kainato y el inicio de las crisis espontáneas y después de la primera aparición, estas crisis son recurrentes y se mantienen hasta la muerte del animal 16. Una estructura cuya inhibición reduce las crisis epileptiformes provocadas en diversos modelos, es la sustancia nigra pars reticulata (SNpr) 17-20. La sustancia nigra pars reticulata (SNpr) envía proyecciones gabaérgicas hacia el colículo superior y al tegmento mesopontino. También proyecta hacia el tálamo, específicamente los núcleos intralaminares, ventralanterior y ventrolateral 21,22. Los estudios de aplicación directa de drogas gabaérgicas y los de trasplantes de células gabaérgicas en la SNpr indican que la desinhibición de los núcleos blanco de la SNpr puede resultar en la supresión de las crisis epileptiformes. Es por esta razón que los modelos de crisis epileptiformes serán de utilidad para evaluar los efectos funcionales del trasplante intranigral de la línea celular gabaérgica que deseamos estudiar. 2. MATERIALES Y METODOS Trasplantes. Se usaron ratas macho de la cepa Sprague - Dawley sometidas a un ciclo normal (12 luz/12 oscuridad), con agua y alimento ad libitum. Las cuales se distribuyeron en los siguientes grupos: un grupo intacto sin trasplante (CONTROL); ratas trasplantadas con la línea celular control (A) y un grupo de ratas trasplantado con la clona M213-20cl-4 (CL 4). Se realizaron inyecciones bilaterales de la CL4 así como de clona A en la SNpr por medio de la técnica esterotáxica. Se trasplantaron 2l de la suspensión celular (200,000 cel/l) utilizando una jeringa Hamilton de 10l. Las células fueron marcadas con bisbenzimida (5M) antes del trasplante. Dosificación. Ocho semanas después del trasplante, se administró ácido kaínico (5 mg/kg de peso por hora) por un periodo de 4 horas hasta alcanzar la categoría de fase III, IV y V en la escala de Racine 16. Las categorías fueron descritas como sigue: Fase III clonus de los miembros anteriores; Fase IV Las ratas se paran en las extremidades posteriores y presentan clonus de los miembros anteriores; Fase V Fase IV pero al final la rata cae. Se registró el número de inyecciones necesarias para llegar a la Fase V, y la latencia de aparición y el número de crisis Fase III, IV y V presentadas por las ratas tratadas. Cinco horas después de iniciado el tratamiento con ácido kaínico los animales fueron sacrificados. Análisis histológico. Se anestesiaron las ratas con una sobredosis de pentobarbital (>50 mg/kg) y se sacrificaron por decapitación. El encéfalo se congeló inmediatamente en hielo seco y utilizando el criostato se realizaron cortes de 20 m que se montaron en portaobjetos gelatinizados. Por medio de microscopia de fluorescencia con un filtro ultravioleta se localizaron las células trasplantadas marcadas con la bisbenzimida. Análisis de la concentración de GABA tisular. En otro grupo de ratas trasplantadas tanto con CLONA 4 como con células control, se sacrificaron a las 4, 8 y 12 semanas posteriores al trasplante. Después de la decapitación se realizó la disección del mesencéfalo ventral y se homogenizó con metanol al 85%. Se centrifugó y el sobrenadante se guardó para su análisis en HPLC. El GABA y glutamato se cuantificaron por HPLC con detección electroquímica. La detección fue por fase reversa utilizando un método de gradientes realizando una derivatización precolumna con ortoftaldehído para permitir la detección de aminoácidos. Pruebas de liberación de GABA por alta concentración de K +. Se realizaron cultivos de las clonas CL4 y A en placas de seis pozos. Cuando llegaron a una confluencia del 90% se les eliminó el medio de cultivo y se lavaron con solución salina. Se aplicó una solución amortiguadora con una concentración de K 50mM la cual se recolecto a los 15, 30 y 45 minutos. A la par se tuvo un control en donde se aplico una solución amortiguadora preparada de manera similar pero con una concentración de K baja (4mM) por 5 min. Determinación de GABA total. Se realizaron cultivos de las clonas CL4 y A en frascos de 25 cm 2. Cuando llegaron a una confluencia del 90% se les aplicó ácido sulfosalicílico al 35% por 20 minutos. Posteriormente se separaron las células con ayuda de un aplicador de plástico y se colocaron en tubos eppendorf. Se mantuvieron a 4°C toda la noche; después se centrifugaron por 5 minutos a 3000 rpm. El sobrenadante se destinó para su análisis en HPLC y el precipitado para el análisis de proteínas totales. RT-PCR. La expresión del transgen se evaluó por medio de RT-PCR en 3 animales trasplantados con la CL4 y 2 trasplantados con clona control. Los animales fueron sacrificados por decapitación 8 semanas después del trasplante, se realizó la disección del mesencéfalo ventral y fue congelado en nitrógeno líquido. Se realizó la extracción de mRNA utilizando Trizol (Invitrogen). La transcripción reversa se realizó utilizando 10 µg de RNA total (Superscript, Invitrogen), y se utilizaron 2µl de la reacción resultante para los subsecuentes PCRs. Se utilizaron oligonucleotidos sentido correspondientes a un fragmento del vector pREP10 y un oligonucleotido antisentido que corresponde a una parte del gen hGAD67. Los fragmentos de DNA amplificados se hicieron pasar por un gel de agarosa al 2%. 3. RESULTADOS El análisis histológico de los cortes de cerebro de las ratas trasplantadas con la CL4 y con la A marcadas con bisbenzimida demostró la presencia de estas células en 80% de los animales trasplantados. La localización del trasplante se observó en la sustancia nigra y en regiones ventrales cercanas a ésta (Figura 1). En los cortes teñidos con la técnica de Nissl (violeta de cresilo) se observó la presencia del trasplante en el área de la sustancia nigra, sin presentar necrosis del tejido, ni la presencia de tumores en ninguno de los animales trasplantados. Se verificó la presencia del trasplante bilateral en la SNPpr antes de incluir a los animales en el análisis estadístico del número de inyecciones de AK, latencia de las crisis y del número de crisis tipo FIII, FIV y FV. Después de la inyección del ácido kaínico los animales presentaron inactividad y postración, minutos más tarde iniciaron las sacudidas (sacudidas de perro mojado) y automatismos, seguidas finalmente de la aparición de las fases III, IV y IV descritas por Racine manteniéndose en status epilepticus hasta el término del experimento. Se encontró una diferencia estadísticamente significativa en el número de inyecciones que se necesitaron para el desarrollo de la Fase V (F(2,23)= 4.25; p<0.05; Figura 2A). Las ratas trasplantadas previamente con la CL4 requirieron de un mayor número de inyecciones, es decir una mayor dosis de ácido kaínico para desarrollar crisis tipo FV de Racine con respecto al grupo CONTROL (Prueba LSD de Fisher, p<0.05, Figura 2A). A B C D Figura 1. Distribución y localización de los trasplantes. Las células transplantadas se encontraron dentro de la región de la SNpr y en regiones ventrales cercanas. El color más intenso en los esquemas representa el área de mayor coincidencia en el grupo trasplantado con A (A) y CL4 (B). C. Corte coronal que demuestra de manera representativa el trasplante con la línea celular M213-2O CL4 por microscopia de fluorescencia (C) y el mismo corte teñido con violeta de cresilo (C y D). Las flechas señalan el mismo sitio en las micrografías. Barra= 50m. También se encontró una diferencia significativa entre grupos al analizar las frecuencias de las crisis tipo FIII, FIV y FV (F(2,23)= 6.85, 7.31, 3.95; p< 0.05, respectivamente; Figura 2B). El grupo de ratas trasplantado con la CLONA 4 presentó una menor frecuencia de las crisis tipo FIII, FIV y FV con respecto al grupo INTACTO (Prueba LSD de Fisher, p<0.05, Figura 2B). Se analizaron por separado las latencias para la aparición de la primer sacudida, crisis tipo FIII, FIV y FV (Figura 2C). No se encontraron diferencias entre grupos con respecto a la latencia de aparición de la primer sacudida. Sin embargo sí se encontraron diferencias significativas en la latencia para la primer crisis tipo FIII (F(2,24)= 4.91; p< 0.05), la primer crisis tipo FIV (F(2,24)= 6.07; p< 0.05) y la primer crisis tipo FV (F(2,24)= 5.86; p< 0.05), siendo el grupo trasplantado con la CLONA 4 el que presenta las latencias mayores de los tres grupos analizados (Figura 2C). En la figura 3 se muestra que la expresión del trasgen solo se detecta en los animales trasplantados con la línea celular gabaérgica. n=9 A *# B 4 250 C n = 10 n=7 4 3 2 1 0 CONTROL CL4 Latencia de aparición (min) 5 Número de crisis Número de inyecciones de AK 6 3 2 * 1 150 100 50 0 A *# 200 0 CONTROL CL4 A CONTROL CL4 A Figura 2. Efecto de los trasplantes sobre las crisis tónico-clónicas inducidas por AK. A. Número de inyecciones necesarias para presentar crisis tipo FV. EL grupo trasplantado con CLONA 4 necesitó una mayor cantidad de ácido kaínico para presentar las crisis motoras. B. Número de crisis (tipo FIII, FIV y FV) observadas para los tres grupos tratados con kainato. El grupo CLONA 4 presenta frecuencias menores de las crisis observadas. C. Latencia de aparición a la primera sacudida, crisis FIII, crisis FIV y crisis FV. Los animales trasplantados con la CLONA 4 presentan latencias mayores para la aparición de la primera crisis tipo FIII, crisis FIV y crisis FV comparado con los grupos CONTROL y A. Figura 3. Expresión del transgen de GAD67h. Solo se observa la presencia del transen en las células gabaérgicas y en los animales trasplantados con estas células. A. B. * 25000 Trasplantes de 40,000 células 20000 15000 n=7 10000 n=7 n=7 5000 n=4 0 B. 4w n=4 n=4 n=4 15 MIN 30 MIN * 400 300 200 100 0 A CL4 Intacto 1500000 1000000 500000 n=5 CL4 Transplantes de 400,000 células 8w 600 GABA (nmol/mg proteina) 500 2000000 A 4w 12w n=5 2500000 0 45 MIN 8w 600 GABA (nmol/mg protein CL4 n=7 BASAL A. 3000000 A GABA (pmol/mg protein) GABA (pmol/mg protein) Figura 4. Concentración de GABA (pmol/mg de proteína) obtenidos de A. Pruebas de liberación de GABA por exposición a un buffer con alto contenido de potasio y B. Contenido total de GABA en las tres líneas celulares en estudio. 12w * 500 400 300 200 100 Figura 5. Contenido de GABA tisular. A. En los animales trasplantados con 40,000 células de manera bilateral y B. Animales trasplantados con 400,000 células por lado en los diferentes tiempos postrasplante, 4, 8 y 12 semanas. 0 A CL4 Intacto En la figura 4 se presentan los resultados de los niveles de GABA obtenidos para las pruebas de liberación y el contenido de GABA total relacionada con los miligramos de proteína presentes en el cultivo. El contenido tisular de GABA en los animales trasplantados con 400,000 células o 40,000 células se grafican en la figura 5. Según estos resultados, el número de células trasplantadas no representa una diferencia en los niveles de GABA detectados en el tejido. En cuanto al tiempo postrasplante se ha encontrado una mayor concentración tisular de GABA a las 12 semanas, solo en los animales trasplantados con la CLONA 4, con respecto a sus niveles a las 4 y 8, semanas los cuales son muy parecidos a los observados para los animales intactos. 4. CONCLUSIONES Este trabajo muestra el efecto de los trasplantes intranigrales de una línea celular gabaérgica sobre las crisis tónico-clónicas inducidas por la inyección sistémica de ácido kaínico. La CLONA 4 modula las manifestaciones de las crisis provocadas por la administración sistémica de ácido kaínico 8 semanas después del trasplante. También como se demostró, se incrementa la dosis de AK requerida para generar una crisis tipo FV, sugiriendo que el trasplante puede tener un efecto protector contra el desarrollo de las crisis. Los animales trasplantados con la clona control que no posee el transgén de la GAD67h, no muestran ninguna modificación en el desarrollo de las crisis, lo cual sugiere que los efectos benéficos observados podrían estar relacionados con los niveles de GABA en el trasplante. Resultados similares han sido previamente descritos en otros modelos de epilepsia experimental como lo son el modelo de kindling (amigdalino y en la corteza entorrinal) y crisis audiogénicas 2,3,23,24. En cuanto a los niveles de GABA in vitro, sólo fue posible detectarlos en la CLONA 4, esto posiblemente a que la sensibilidad del método de detección utilizado no fue suficiente para cuantificar niveles más bajos presentados con la CLONA CONTROL. La CLONA 4 libera GABA en respuesta a alto potasio y la mayor concentración se encontró a los 15 minutos después de la administración del buffer con concentración alta de potasio (50mM), niveles menores de GABA se cuantificaron a los 30 y 45 minutos. Esto probablemente refleje la degradación de GABA o su recaptura. En cuanto al contenido tisular de GABA, se encontró un incremento a las 12 semanas postrasplante sólo en los animales trasplantados con la CL4 pero los niveles de GABA en cerebro no se correlacionan con el número de células trasplantadas. Estos resultados sugieren que sólo una proporción de las células trasplantadas inicialmente sobreviven en el tejido huésped. El mecanismo fisiológico por el cual los trasplantes están generando sus efectos sobre la conducta no es muy claro. En el cerebro huésped las células pueden integrarse al tejido y establecer contactos sinápticos con las células circundantes, por lo que la liberación de GABA podría estar regulada por las condiciones de excitabilidad del sistema. Por otra parte estas células in vitro producen GABA de manera tónica, por lo que no hay que descartar que podrían estar funcionando in vivo como minibombas biológicas, modificando el ambiente neuroquímico del tejido huésped. Hasta el momento sólo podemos decir que la única diferencia entre los grupos trasplantados con las células gabaérgicas, es la presencia del transgen de la GAD67h. Esto nos lleva a pensar que es el incremento en el contenido de GABA el responsables de los efectos conductuales. Otro aspecto importante que tenemos que considerar es que las determinaciones neuroquímicas se realizaron en animales trasplantados que no recibieron el tratamiento con ácido kaínico, por lo que es necesario realizar estudios futuros en los que se determinen los cambios en GABA producidos por el trasplante en animales con crisis tónico-clónicas de forma dinámica usando microdiálisis. * Agradecemos la asistencia técnica del Dr. Manuel Aguilar, Andrés Falcón, Lourdes Lara, Pilar Galarza, Leopoldo Santos, Martín García, Elsa Nydia Hernández, Dra. Aurea Orozco, M. en C. Patricia Villalobos, y el Dr. Michael C. Jeziorski. Trabajo auspiciado por DGAPA-PAPIIT IN225305-16 y CONACYT (46161). BIBLIOGRAFÍA 1. C. Conejero-Goldberg, et al., "Transduction of human GAD67 cDNA into immortalized striatal cell lines using an Epstein-Barr virus-based plasmid vector increases GABA content", Exp Neurol, 161, 2, 2000, pp. 453-461. 2. W. Loscher, et al., "Seizure suppression in kindling epilepsy by grafts of fetal GABAergic neurons in rat substantia nigra", J Neurosci Res, 51, 2, 1998, pp. 196-209. 3. K. Thompson, et al., "Conditionally immortalized cell lines, engineered to produce and release GABA, modulate the development of behavioral seizures", Exp Neurol, 161, 2, 2000, pp. 481-489. 4. A. Björklundand O. Lindvall, "Cell replacement therapies for central nervous system disorders", Nat Neurosci, 3, 6, 2000, pp. 537-544. 5. S. B. Dunnett. "Neural Transplantation", in Neuromethods; (Humana Press Inc., 1998), pp. 55-87. 6. B. L. Davidsonand X. O. Breakefield, "Viral vectors for gene delivery to the nervous system", Nat Rev Neurosci, 4, 5, 2003, pp. 353-364. 7. D. R. Thakker, et al., "Neurochemical and behavioral consequences of widespread gene knockdown in the adult mouse brain by using nonviral RNA interference", Proc Natl Acad Sci U S A, 101, 49, 2004, pp. 17270-17275. 8. Y. Akaneya, et al., "RNAi-induced gene silencing by local electroporation in targeting brain region", J Neurophysiol, 93, 1, 2005, pp. 594-602. 9. M. Giordano, et al., "Development of immortalized cell lines for transplantation in central nervous system injury and degenerations models", Methods in Neurosciences, 21, 1994, pp. 308-325. 10. S. P. Behrstock, et al., "Conditionally-immortalized astrocytic cell line expresses GAD and secretes GABA under tetracycline regulation", J Neurosci Res, 60, 3, 2000, pp. 302-310. 11. K. C. New, et al., "Novel synthesis and release of GABA in cerebellar granule cell cultures after infection with defective herpes simplex virus vectors expressing glutamic acid decarboxylase", Brain Res Mol Brain Res, 61, 1-2, 1998, pp. 121-135. 12. M. J. Eaton, et al., "Transplants of neuronal cells bioengineered to synthesize GABA alleviate chronic neuropathic pain", Cell Transplant, 8, 1, 1999, pp. 87-101. 13. M. Giordano, et al., "Constitutive expression of glutamic acid decarboxylase (GAD) by striatal cell lines immortalized using the tsA58 allele of the SV40 large T antigen", Cell Transplant, 5, 5, 1996, pp. 563575. 14. S. Brailowsky, et al. "Elementos fisiopatológicos de los procesos epilépticos", in Epilepsia. Aspectos neurobiológicos, médicos y sociales; (Ediciones del Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía, México, D.F., 1997), pp. 103-146. 15. R. Cossart, et al., "Dendritic but not somatic GABAergic inhibition is decreased in experimental epilepsy", Nat Neurosci, 4, 1, 2001, pp. 52-62. 16. J. L. Hellier, et al., "Recurrent spontaneous motor seizures after repeated low-dose systemic treatment with kainate: assessment of a rat model of temporal lobe epilepsy", Epilepsy Res, 31, 1, 1998, pp. 73-84. 17. K. Gale, "Mechanisms of seizure control mediated by g-aminobutiric acid: role of the substantia nigra", Fed. Proc., 44, 1985, pp. 2414-2424. 18. M. J. Iadarolaand K. Gale, "Substantia nigra: site of anticonvulsant activity mediated by gammaaminobutyric acid", Science, 218, 4578, 1982, pp. 1237-1240. 19. K. Gale, "Role of GABA in the genesis of chemoconvulsant seizures", Toxicol Lett, 64-65 Spec No, 1992, pp. 417-428. 20. D. S. Garantand K. Gale, "Lesions of substantia nigra protect against experimentally induced seizures", Brain Res, 273, 1, 1983, pp. 156-161. 21. J. H. Fallonand S. E. Loughlin. "Substantia Nigra", in The rat nervous system; (Academic Press, 1995), pp. 215-237. 22. A. Parentand L. N. Hazrati, "Functional anatomy of the basal ganglia. I. The cortico-basal gangliathalamo-cortical loop", Brain Res Brain Res Rev, 20, 1, 1995, pp. 91-127. 23. M. Gernert, et al., "Genetically engineered GABA-producing cells demonstrate anticonvulsant effects and long-term transgene expression when transplanted into the central piriform cortex of rats", Exp Neurol, 176, 1, 2002, pp. 183-192. 24. K. C. Ross, et al., "Transplantation of M213-2O cells with enhanced GAD67 expression into the inferior colliculus alters audiogenic seizures", Exp Neurol, 177, 1, 2002, pp. 338-340.