Reacciones Bisustrato dos sustratos ⇒ dos productos (60% de las reacciones bioquímicas conocidas) • Son reacciones Bi- Bi = 2 sustratos y 2 productos Reacciones con mas de un sustrato E A + B P + Q Tema 12 • Son reacciones de transferencia (Transferasas) • Mecanismo de acción y cinética E A–X + B Clasificación de las reacciones de transferencia de grupos catalizadas por enzimas 1.- Reacciones secuenciales ó de desplazamiento simple a) Mecanismo ordenado b) Mecanismo estadistico ó al azar P + B-X 1.- Reacciones secuenciales ó de desplazamiento simple Todos los sustratos se han de combinar con el E antes de que la reacción tenga lugar y se liberen los productos En ambos casos, la reacción transcurre con la formación de un compuesto ternario a) Mecanismo ordenado (orden obligado de adición de sustratos) 2.- Reacciones secuenciales de doble desplazamiento ó reacciones ping-pong S2 E + S1 ES1 E S1S2 E + P1 + P2 1 b) Mecanismo estadístico ó al azar (no existe preferencia sobre el orden de adición de los sustratos) 1.- Reacciones secuenciales ó de desplazamiento simple a) Mecanismo ordenado E E S1 S2 E S1 + S1 ES1 E E S1 + S2 S2 E + P1 + P2 E Compuesto ternario ES2 + P1 + P2 Ej: Enzimas deshidrogenasas Ej: oxidaciones de sustratos con el coenzima (NAD+ y NADP+). 1.- Reacciones secuenciales ó de desplazamiento simple a) Mecanismo estadistico ó al azar Ej: Fosforilación de la glucosa con ATP, catalizada con hexoquinasa, con tendencia a unirse a la glucosa en primer lugar E E + S1 S1 Compuesto ternario E + S2 2.- Reacciones secuenciales de doble desplazamiento ó reacciones ping-pong Transferencia de grupo en las que uno o mas productos se liberan antes de que todos los sustratos se hayan agregado E E + S1-X E S2 S1-X X-S2 P1 S1 E E P2 E S2 + S1 + S2 P1+P2 +E Ej: a) Tripsina o Quimotripsina b) Transaminasas S2 . 2 2.- Reacciones secuenciales de doble desplazamiento ó reacciones ping-pong Cinética Enzimática de Reacciones Bisustrato Para reacciones monosustrato: • Parámetros de la cinética del estado estacionario son Km y Kcat/Km Se liberan uno ó mas productos antes de que se hayan incorporado todos los sustratos Para reacciones bisustrato: No se forma un compuesto ternario • La cinética del estado estacionario ayuda a conocer si se forma compuesto ternario durante la reacción ó no P1 E + S1 ES1 E´ P1 E´ E´ S2 E + P2 Se utilizan los gráficos de dobles recíprocos ó las inversas de 1/V0 y de 1/S1 E´: Intermediario del E sustituido temporalmente Características Cinéticas de las Reacciones Enzimáticas. Reacciones enzimáticas bisustrato: A + B Características Cinéticas de las Reacciones Enzimáticas. P + Q Reacciones enzimáticas bisustrato: A + B NO se forma un complejo ternario E-A-B Simbología de Cleland Si se forma un complejo ternario E-A-B a). Mecanismo secuencial ordenado B A E EA Q P EAB=EPQ EQ E b). Mecanismo secuencial al azar A E EA EB B v= B EAB EPQ A 2.-Reacciones ping-pong Q P E EQ EP Q P V máx [ A ][ B ] +K K K [A] + K [ B ] + [ A ][ B ] m,A m,B m,B m,A P + Q E B P A EA=FP F Q FB=EQ E Vmáx [A] [B] v = Km, B [A] + Km, A [B] + [A][B] 1.- Reacciones secuenciales ó de desplazamiento simple 3 • Se trazan curvas de v para cada caso con dobles recíprocos y se obtiene un conjunto de rectas Mecanismo Enzima Exp.1 Exp.1 Exp.2 Exp.3 Exp.2 Exp.3 Exp.4 Bi-Bi al azar Bi-Bi ordenado 1 [s1] Indica formación de compuesto ternario Se cortan a la izda del eje 1/V0 Si son paralelas Alcohol deshidrogenasa (EC.1.1.1.1) Malato deshidrogenasa (EC.1.1.1.37) 1 [s1] Indica mecanismo ping-pong Adenilato quinasa (EC 2.7.4.3) Citrato sintasa (EC.4.1.3.7) Exp.4 Lactato deshidrogenasa (EC.1.1.1.27) Bi-Bi ping-pong Coenzima A transferasa (EC.2.7.8.7) Glutamato-alanina transferasa (EC.2.6.1.2) Análisis cinético en el estado estacionario de las reacciones bisustrato 4