UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PATAGONIA SAN JUAN BOSCO FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES DEPARTAMENTO DE FARMACIA CATEDRA DE FARMACOGNOSIA TRABAJO PRÁCTICO N° 5. GLICOSIDOS III. A. GLICOSIDOS CARDIOTONICOS Los glicósidos cardiotónicos son sustancias amargas, derivadas de los esteroides, que actúan sobre el corazón fortaleciendo el trabajo cardíaco. La fracción de hidratos de carbono que constituyen los glicósidos, contiene de tres a cinco monosacáridos, por lo general desoxiazúcares o azúcares especiales. Para que el compuesto resulte activo, deben estar presentes al menos un OH en el C3 en (que constituye el glicósido) y otro en el C14 en ; metilos en , en C10 y C13; una lactona unida al C17 correspondiente a una -lactona -insaturada (cardenólido), o a una -lactona ,-insaturada (bufadienólido), y los anillos A/B y C/D deben estar en cis. Cardenólido Bufadienólido 82 Para la identificación se analiza el núcleo esteroide, la lactona -insaturada y la posible presencia de desoxiazúcares en el caso de glicósidos. Para el grupo esteroide se utiliza la reacción de Liebermann-Burchard, la cual dará positivo para esteroides que cumplan con ciertos requerimientos estructurales: un substituyente -OH en posición 3 (libre o glicosilado) y un doble enlace preexistente en el anillo A o en el B, o bien que puedan formar este doble enlace por la deshidratación generada por el H2SO4 durante la reacción, conjugándose con el originado en C3=C4 o C3=C2. La aparición de un color verde que varía en el tiempo hasta azul petróleo indica reacción positiva. En el presente T.P. se trabajará con hojas de Digitalis purpurea (Scrophulareaceae) y comprimidos comerciales de digoxina (Lanoxin®), glicósido cardiotónico natural, además de la Fracciones B y C de la planta en estudio. Actividades prácticas Preparación del extracto de las hojas de digital (E) (Farmacopea Española, 3° Ed.): Pesar 1 g de hojas de digital reducidas a polvo disponer en contacto con una mezcla de 20 ml de alcohol al 50 % V/V y 10 ml de acetato de plomo. Calentar a ebullición durante 2 minutos, enfriar y centrifugar, separando el sobrenadante para utilizar. Extraer el sobrenadante 2 veces con 15 ml de cloroformo cada vez, reunir las dos capas clorofórmicas, desecar con sulfato de sodio anhidro y filtrar. (*) Evaporar 10 ml a sequedad en baño de agua y luego disolver el residuo en 1 ml de una mezcla de volúmenes iguales de cloroformo y metanol (este último paso se realiza previo a la realización de la TLC). 1- RECONOCIMIENTO DEL GRUPO ESTEROIDE Reacción de Liebermann-Burchard Muestras a ensayar: extracto de hojas de digital (E), comprimidos de digoxina (D), Fracciones B y C de la planta en estudio. Patrón: colesterol. Reactivos y técnica: se mezclan 1 ml de anhídrido acético y 1 ml de cloroformo, se enfrían a 0 ºC y se añade la muestra a analizar en idéntico volumen. Luego por las paredes del tubo se agrega 1 gota de ácido sulfúrico concentrado previamente enfriado en baño de hielo. El tubo se vuelve a poner en baño de hielo y se observa la reacción. Si hay formación de colores azul, verde que cambian con el tiempo indica presencia del núcleo esteroide. Si la coloración es rojo-naranja pardo indica la presencia de núcleo triterpénico. 2- RECONOCIMIENTO DEL GRUPO CARDENOLIDO Reacción de Kedde Reactivo: sol. A: ácido 3,5 dinitrobenzoico al 2 % en metanol. sol. B: KOH al 5,7 % en agua. Técnica: se mezclan cantidades iguales de las soluciones A y B del reactivo y se añade una punta de espátula de la muestra a ensayar. Los cardenólidos y sus agliconas dan color azulado, rosa hasta violeta. 83 3- CROMATOGRAFÍA ANALÍTICA PLANAR DE CAPA FINA (TLC) Se trabajará con el siguiente sistema cromatográfico: Cromatofolio con las medidas adecuadas. Fase estacionaria: sílicagel 60 HF254+366 (las placas serán preparadas en el laboratorio en las clases anteriores). Fase móvil: acetato de etilo-metanol-agua (81:11:8). Muestras: extracto de hojas de digital (E) (*); comprimidos de digoxina (D). Procedimiento: siembra en banda, desarrollo ascendente de aproximadamente 10 cm. Revelado: se efectuará una vez seco el cromatograma, mediante rociado con el reactivo de Kedde (mezcla recién preparada de 5 ml de la solución A y 5 ml de la solución B del reactivo). Evaluar al visible. Informe de los resultados: calcular los Rf y establecer una conclusión. Comparar los resultados con la bibliografía. B- SAPONINAS Se da el nombre de saponinas a un grupo de glicósidos que al disolverse en agua, disminuyen la tensión superficial de ésta; por lo tanto, al agitar sus soluciones, se formará una espuma abundante y relativamente estable. Tienen sabor amargo y acre, y las drogas que los contienen suelen ser estornutatorias e irritantes de la mucosa. Las saponinas destruyen los glóbulos rojos por hemólisis. Son tóxicas sobre todo para animales de sangre fría, por eso se las usa como veneno para peces. Por hidrólisis de las saponinas se obtienen carbohidratos y una aglicona, llamada genéricamente SAPOGENINA, la cual puede tener un esqueleto de tipo esteroidal (tipo A) o de tipo triterpeno (tipo B). Se conocen más de 200 saponinas esteroidales, localizadas fundamentalmente en las Monocotiledóneas y otras tantas triterpénicas, aisladas principalmente de Dicotiledóneas. Ambos grupos de saponinas se han obtenido de diversos órganos vegetales. Además se hallan presentes en organismos marinos. Las saponinas son sustancias polares y es posible extraerlas en caliente o en frío con agua o con alcoholes de bajo peso molecular. Los materiales lipídicos se separan de estos extractos con hexano, benceno, tolueno. Al concentrar la solución alcohólica se separan las saponinas y después se cristalizan en mezclas de alcohol-agua. Para obtener sapogeninas las saponinas se pueden hidrolizar con enzimas naturales o con HCl o H2SO4 (este último se prefiere en el caso de sapogeninas insaturadas). Después se separan las sapogeninas con benceno, éter, cloroformo, acetona, dependiendo de los substituyentes que posea. Estas se pueden acetilar para dar compuestos fácilmente cristalizables permitiendo así su purificación y estudio. Actividades prácticas En este trabajo práctico se trabajará con un extracto de centella asiática (E) y con el infuso (I) de la planta en estudio retomado en agua y calentado a BM durante 10 min. Preparación del extracto de centella asiatica (E) (Farmacopea Española, 3° Ed.): 84 Pesar alrededor de 2,5 g de droga vegetal y disponer en contacto con 25 ml de alcohol al 30 % V/V. Extraer mediante reflujo durante 15 min (contando el tiempo a partir de que comienza el reflujo). Filtrar y utilizar el filtrado. a) Reacciones de reconocimiento 1- PODER TENSIOACTIVO: agitar vigorosamente en un tubo de hemólisis 1 ml de la muestra a ensayar (extracto de centella e infuso), observando la cantidad y persistencia de la espuma formada. Medir la altura a tiempos 0, 5 y 15 minutos. 2- PODER EMULSIFICANTE: añadir 1 ml de un líquido no miscible con el agua (cloroformo) a 1 ml de la muestra a ensayar y agitar. Comparar con lo que ocurre en otro tubo en el cual se sustituye el extracto o muestra con agua. 3- SAPOGENINA: realizar la reacción de Liebermann-Burchard como se describió anteriormente. Puede dar un color que varía desde el verde hasta el azul petróleo indicando reacción positiva para saponina esteroide. O dar color desde amarillo naranja hasta pardo amarronado, también positiva, pero en este caso para saponina triterpénica. b) Cromatografía analítica planar de capa fina ( TLC) Se trabajará con el siguiente sistema cromatográfico: Cromatofolio con las medidas adecuadas. Fase estacionaria: sílicagel 60 HF254+366 (las placas serán preparadas en el laboratorio en las clases anteriores). Fase móvil: acetato de etilo-ácido acético-ácido fórmico-agua (100:11:11:27). Muestras: extracto de centella (E); comprimidos de CENTELLA QUEEN® (Q); comprimidos de CENTELLA NATUFARMA® (N); tintura de centella (T). Procedimiento: siembra en banda, desarrollo ascendente de aproximadamente 10 cm. Revelado: se efectuará una vez seco el cromatograma, mediante rociado con el reactivo anisaldehído sulfúrico (mezcla recién preparada de 50 l de anisaldehído con 1 ml de ácido acético glacial, seguido de 8,5 ml de metanol y 0,5 ml de ácido sulfúrico, en ese orden). Llevar a estufa a 100 °C, 5-10 min y evaluar al visible y al UV a 366 nm. Informe de los resultados: calcular los Rf y establecer una conclusión. Comparar los resultados con la bibliografía. BIBLIOGRAFIA - Bruneton, J., “Elementos de Fitoquímica y Farmacognosia”, 1991. Ed. Acribia. España. Harborne, J.D., “Phytochemical Methods”, 1991. 2° Ed. Chapman and Hall. Domínguez, J.A., “Métodos de Investigación Fitoquímica”, 1985. México. Limusa. FNA VI Ed., 1978. Real Farmacopea Española, 3° Ed., 2005. 85