Alteraciones morfológicas en la membrana de eritrocitos

Resumen: E-047
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2004
Alteraciones morfológicas en la membrana de eritrocitos
provocadas por venenos ofídicos de la familia Viperidae
1
1
2
Bustillo, Soledad - Rodríguez, Juan Pablo - Teibler, Pamela
2
1
2
Maruñak, Silvana - Leiva, Laura - Acosta, Ofelia
1. Cátedra de Química Biológica I, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura, UNNE.
Av. Libertad 5600. Corrientes, CP: 3400. Argentina. Tel: 54-3783-457996-112
2. Cátedra de Patología Médica, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNNE. Corrientes, Argentina.
Antecedentes
Las intoxicaciones moderadas y severas producidas por mordeduras de serpientes de los géneros Crotalus y Bothrops
pertenecientes a la familia Viperidae provocan, entre otras lesiones, hemólisis intravascular, detectándose hemoglobinemia como así también hemoglobinuria en el animal intoxicado (Ronsenfeld, 1971; Gibly et al, 1998 ).
Ensayos realizados en nuestro laboratorio han demostrado que especimenes del nordeste argentino pertenecientes a las
especies Botrhops alternatus (yarará de la cruz ó yarará grande) y Crotalus durissus terríficus (cascabel) tiñen marcadamente de rojo tanto el plasma como la orina de animales de experimentación inoculados con tales venenos, confirmando la presencia de hemoglobina como principal responsable de esta pigmentación (Leiva et al, 2000). Sin embargo
ensayos in vitro han demostrado que los venenos no producen la lisis de hematíes por simple contacto con los mismos,
tal como fuera demostrado por Martínez Cadillo et al (1991) con venenos de otras serpientes sudamericanas.
Dado que ha sido descripto la presencia de factores en venenos de serpientes capaces de desorganizar membranas celulares (Condrea, 1991; Yamamoto et al, 2001) es de interés demostrar si el veneno de Crotalus durissus terrrificus y el
de Bothrops alterantus son capaces de producir alteraciones morfológicas en la membrana eritrocitaria, que induzcan
un aumento en la fragilidad osmótica del glóbulo rojo.
Materiales y Métodos
Venenos
Se utilizó un pool de venenos de serpientes adultas de Bothrops alternatus (yarara) y Crotalus durissus terrificus (cascabel) de la región Nordeste de la Argentina, desecados y conservados a -20ºC hasta el momento de ser utilizados.
Resistencia Globular Osmótica
Se siguió el método de Dacie (Miale, 1962). Los glóbulos rojos (GR), obtenidos de sangre de carnero con heparina,
fueron lavados con solución tamponada de fosfatos (12 mM). Posteriormente, estos GR se incubaron separadamente
con veneno de cada una de las especies a estudiar (1mL suspensión de GR en buffer salino de fosfatos con 0.1 ml de
veneno 4 mg/mL) durante 30 minutos a 37 ºC. Una suspensión de GR, incubada con buffer fosfato, fue utilizada como
control. La suspensión de GR tratados se centrifugó y el paquete globular, previamente lavado, se enfrentó a soluciones de osmolaridad creciente (0.88 a 8.78 g/l NaCl), incubando a 4 ºC por un período máximo de 48 hs. A diferentes
tiempos (3, 24 y 48 hs.) se centrifugaron los tubos a bajas revoluciones (2000 rpm) durante 5 minutos y se leyó la absorbancia del sobrenadante a 540 nm en un Espectrofotómetro Camp Spec M330. Se calculó el porcentaje de hemólisis
(% hemólisis) respecto al correspondiente tubo control.
Microscopía optica
Una gota de las suspensión de GR, preincubada durante 30 minutos con cada uno de los venenos (Crotalus durissus
terrrificus y Bothrops alterantus), se tiñó con May Grünwald Giemsa para su observación morfológica al microscopio.
Glóbulos rojos preincubados con buffer fueron utilizados como control.
Microscopía electrónica de barrido
Los GR tratados con cada veneno (1mL suspensión de GR en buffer salino de fosfatos con 0.1 ml de veneno 4 mg/mL,
durante 30 minutos a 37 ºC.), fueron procesados por técnica clásica para microscopía electrónica, secados a punto crítico y metalización con oro de paladio, para su observación en microscopio electrónico de barrido (Joel 5800 LV). Una
suspensión de GR, incubada con buffer fosfato, y sometida al mismo tratamiento para su observación microscópica, fue
utilizada como control.
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Discusión de resultados
Se constató un aumento de la fragilidad osmótica en los GR tratados tanto con veneno de cascabel como con los preincubados con veneno de yarará, siendo en este último más acentuado el efecto. Este comportamiento se evidenció tanto a
las 3 hs, como a las 24 hs (Figuras 1 A y B), siendo más significativa la diferencia entre los venenos a los menores tiempos de incubación, a una concentración hipotónica de NaCl de 6 g/l. (Figura 1. A). Mientras que a las 48 hs. no se evidencia comportamiento diferencial , ni siquiera, respecto del control (Figura 1.C)
Por microscopia óptica no se detectaron alteraciones en la morfología de los eritrocitos tratados con los venenos. Sin
embargo, por microscopia electrónica de barrido, se apreció una significativa (p < 0.01) reducción del diámetro eritrocitario correspondiente a aquellos glóbulos tratados con veneno de cascabel y de yarará, respecto al control (Figura 2).
Una leve diferencia, se observa entre el diámetro promedio de los glóbulos rojos preincubados con venenos, siendo
menor con el de yarará. Esto se correspondería con los resultados obtenidos del ensayo para evaluar la fragilidad osmótica, donde la mayor fragilidad osmótica detectada en aquellos eritrocitos incubados con veneno de yarará, se correlaciona con una mayor alteración del tamaño corpuscular.
Por otro lado, las imágenes por microscopia de barrido muestran deformaciones de la membrana en los eritrocitos tratados con ambos venenos, se observan protuberancias de aspecto “globoso”, ausentes en los eritrocitos control (Figura
3). Alteraciones morfológicas de GR cuando estos son expuestos a venenos de serpientes han sido descriptas desde hace
tiempo, por ejemplo Gitter y colaboradores (1959) denotaron cambios en la forma eritrocitaria al incubar GR con veneno de Vipera palestinae, sin embargo, hasta el presente, no habían sido descriptas la formación de “ampollas” en la
superficie globular.
Tales deformaciones de la membrana, con el demostrado aumento de la fragilidad osmótica detectado, provocaría una
ruptura mecánica de la pared eritrocitaria al atravesar capilares sanguíneos, lo que desencadenaría la hemólisis intravascular observada en el animal intoxicado.
100
% hemólisis
% hemólisis
100
75
50
25
0
4.00
5.00
6.00
7.00
8.00
75
50
25
0
4.00
9.00
5.00
6.00
7.00
[NaCl], (g/l)
8.00
9.00
[NaCl], (g/l)
A
B
%hemólisis
100
75
50
25
0
4.00
5.00
6.00
7.00
8.00
9.00
[NaCl], (g/l)
C
Figura 1. Resistencia globular osmótica expresada como porcentaje de hemólisis de glóbulos rojos de carnero, preincubados con: veneno de Crotalus durissus terrificus (cascabel: ), veneno de Bothrops alternatus (yarará: ) y buffer
fosfato (Control ), enfrentados a diferentes concentraciones de NaCl (0.88 a 8.78 g/l). A. 3 Hs. de incubación. B. 24
Hs de incubación. C. 48 Hs de incubación.
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3.5
diámetro (micras)
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
Control
Yarará
Cascabel
Figura 2: Diámetro de glóbulos rojos preincubados con venenos de Crotalus durissus terrificus (cascabel) y Bothrops
alternatus (yarara) durante 30 minutos a 37ª C. Glóbulos rojos preincubados con buffer fosfato fueron utillizados como
control. (p<0.01)
Figura 3. Microscopía electrónica de barrido de glóbulos rojo de carnero. A. Glóbulos rojos preincubados con buffer
fosfato (Control). B. Glóbulos rojos preincubados con veneno de cascabel. C. Glóbulos rojos preincubados con veneno
de yarará. Señaladas con una flecha (→) deformaciones de la membrana en los eritrocitos tratados con ambos venenos
(B y C).
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Conclusiones
Los resultados hallados permiten asignar como posible causa de la hemólisis intravascular detectada, la alteración morfológica eritrocitaria provocada por los venenos, lo que conllevaría a un aumento de la fragilidad celular.
Agradecimientos
A la Ing. Agr. Myriam Carolina Peichoto y al Servicio de Microscopía electrónica de Barrido de la Facultad de Ciencias
Agrarias de la UNNE, por la preparación de muestras y asesoramiento en la interpretación de imágenes. A la Secretaría
de SGCyT (UNNE) por financiar el servicio de microscopía.
Bibliografía
- Condrea, E. “Hemolytic Effects of Snake Venom”, Chapter 13, p 448, In: Editor Chen Yuan Lee: Handbook of Experimental Pahrmacology (Vol 52): Snake Venoms,, reprinted by Sigma Chemical Company, Saint Louis, 1991.
- Gibly, R. L.; Walter, F. G.; Nowlin, S. W.; Berg, R. A. “Intravascular hemolysis associated with North American
crotalid envenomation”. J Toxicol Clin Toxicol. 36(4): 337 – 343, 1998.
- Gitter, S.; Kochwa, S.; Danon, D.; de Vries, A. “Disk esphere-transformation and inhibition of rouleaux formation
and sedimentation of human red blood cells induced by vipera xanthinapalestinae venom”. Arch. Int Pharmacodyn.
Ther, 118: 350 – 357, (1959).
- Miale, J. “Laboratory Medicine Hematology”. Ed. C. V. Mosby. 1962.
- Leiva, L.; Acosta, O.; Fidanza, N.; Bustillo, S.; Maruñak, S. “Intoxicación con venenos ofídicos: Test para la detección de mioglobina y hemoglobina”. XX Jornadas Interdisciplinarias de Toxicología, IV Latinoamerican Workshop
on doping Análisis. 2000.
- Martínez Cadillo, E.; Bonilla Ferreira, C.; Zvealeta, A. “Hemolytic activity of venoms from sankes of the genera
Bothrop, Lachesis, Crotalus, and Micrurus (Serpentes: Viperidae and Elapidae)”. Rev. de Biol Trop. 39(2): 311 – 314,
1991.
- Rosenfeld, G. Symptomatology, pathology and treatment of snake venoms with a practical methodof threatment of
snake bites in South America. In: Buckley E. E. Bücherl, W. (Eds.): Venomous and Their venoms. Vol: II. New
York- London Academic Press, 1971.
- Yamamoto, C.; Tsuru, D.; Oda-Ueda, N.; Ohno, M.; Hattori, S.; Kim, S. T. “Trimeresurus flavoviridis (habu snake)
venom induces human erythocyte lysis through enzymatic lyposis, complement activation and decreasd membrane
expresión of CD55 and CD59”. Pharmacol Toxicol, 89(4): 188 – 194, 2001.