CARACTERIZACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE CONSORCIOS BACTERIANOS CAPACES DE CRECER SOBRE PLAGUICIDAS ORGANOFOSFORADOS Maria Luisa CASTREJÓN GODINEZ1, Enrique SÁNCHEZ SALINAS2, Ma. Laura ORTIZ HERNÁNDEZ2 1 Facultad de Ciencias Biológicas y 2 Laboratorio de Investigaciones Ambientales. Centro de Investigación en Biotecnología. Universidad Autónoma del Estado de Morelos. Av. Universidad No 1001 col. Chamilpa, Cuernavaca Morelos, C.P 62209 Tel. (777) 329-7057. sanchez@buzon.uaem.mx, luicado@yahoo.com.mx Palabras claves: plaguicidas, bacterias, consorcios bacterianos, suelo RESUMEN Los plaguicidas aplicados constantemente a suelos agrícolas, los envases contenedores y los productos caducos, generan grandes cantidades de residuos líquidos y sólidos que contaminan suelos y cuerpos de agua, afectando a las cadenas tróficas y al hombre mismo. Ante esta situación, es importante generar alternativas para el tratamiento de residuos de estos xenobióticos y/o para la limpieza de sitios contaminados. La biodegradación con bacterias aisladas de sitios expuestos a estos xenobioticos, es una alternativa valiosa. Sin embargo, estas bacterias pueden ser patógenas, de ahí la importancia de identificarlas para utilizarlas de manera segura o bien emplear estrategias moleculares para su aprovechamiento en el tratamiento de residuos de plaguicidas o en la restauración de sitios contaminados. El consorcio bacteriano aislado de suelos agrícolas esta compuesto por 11 bacterias, seis con capacidad de crecer en presencia de Paratión metilico y cinco para cadusafos. Las especies identificadas son: Bacillus brevis, Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia pseudotuberculosis, Weeksella virosa, Flavobacterium odoratum, Burkholderia cepacia, Pseudomonas stutzeri. La cepa identificada como Bacillus brevis resultó con mayor capacidad de crecimiento en un medio mínimo con paratión metílico como única fuente de carbono y en medio líquido. Burkolderia cepacia es una bacteria con capacidad de crecer en medio liquido con cadusafos; se ha reportado para la recuperación de suelos contaminados con residuos tóxicos. Diferentes bacterias identificadas son patógenas, sin embargo pueden ser utilizadas en el tratamiento de residuos de paratión metílico y cadusafos y probablemente, de otros plaguicidas de la misma familia química, con el debido control o utilizando herramientas moleculares. INTRODUCCION La extraordinaria diversidad biológica de la tierra, no solo comprende a los animales, plantas, hongos y otros organismos macroscópicos, sino también a los millones de especies microscópicas, distribuidas en los hábitats más diversos que incluyen a suelos y aguas contaminados con xenobioticos. Debido al papel particular que juegan las 1 bacterias en los ecosistemas y su importancia en la vida del hombre, se han empezado a investigar sus patrones de diversidad y las factores que los regulan (Horner-Devine et al. 2003). Los estudios de diversidad microbiana en sitios con constantes aplicaciones de plaguicidas permiten la caracterización e identificación de especies bacterianas con un potencial de aplicación en procesos de biorremediación de sitios contaminados y/o el tratamiento de residuos caducos u obsoletos. Se estima que 4.5 billones de libras de plaguicidas, son comercializados en todo el mundo anualmente (Klaasen 2001). Están incluidos insecticidas, rodenticidas, fungicidas, herbicidas y fumigantes, de uso agrícola, industrial y doméstico. Esto genera grandes cantidades de residuos y productos obsoletos, dispuestos de manera inadecuada, principalmente de la familia de los organofosforados, que son los más usados a nivel mundial. La presencia de bacterias capaces de metabolizar compuestos organofosforados ha recibido una especial atención, debido a que han sido el resultado de un proceso de evolución de poblaciones microbianas autóctonas que se han adaptado a estos contaminantes y porque proveen la posibilidad de ser usadas in situ en la detoxificacion de ambiente severamente contaminados. Por esta razón, estos sitios son los mas apropiados para el aislamiento de cepas capaces de crecer y en consecuencia de degradar estos xenobioticos (Ortiz-Hernández et al. 2001). MARCO TEORICO Definición de plaguicida. La Organización de las Naciones Unidas para la alimentación (FAO 2002) define a un plaguicida como cualquier sustancia o mezcla de sustancias destinadas a prevenir, destruir o controlar cualquier plaga, incluyendo los vectores de enfermedades humanas o de los animales, las especies de plantas o animales indeseables que causan perjuicio o que interfieren de cualquier otra forma en la producción, elaboración, almacenamiento, transporte o comercialización de alimentos, productos agrícolas, madera y productos de madera o alimentos para animales, o que pueden administrarse a los animales para combatir insectos, arácnidos u otras plagas en o sobre sus cuerpos. El término incluye las sustancias destinadas a utilizarse como reguladoras del crecimiento de las plantas, defoliantes, desecantes, agentes para reducir la densidad de fruta o agentes para evitar la caída prematura de la fruta, y las sustancias aplicadas a los cultivos antes o después de la cosecha para proteger el producto contra la deterioración durante el almacenamiento y transporte. Cronología del desarrollo de los plaguicidas. La era de los plaguicidas químicos comenzó en el siglo pasado cuando se desarrollaron los sulfuros y se les encontró una aplicación práctica como fungicidas. Posteriormente fueron los compuestos arsenicales los que se emplearon para el tratamiento de las plagas de insectos en la producción agrícola. En ambos casos se trataba de sustancias de una elevada toxicidad, lo que limitó su empleo generalizado. Fue en 1940 cuando aparecieron en el mercado los primeros plaguicidas organoclorados que tienen su máximo exponente en el dicloro 2 difenil tricloroetano (DDT). Desde entonces se han empleado tanto en los tratamientos agrícolas como en el control de plagas vehiculizadas por insectos portadores. En el transcurso de los últimos 150 años el hombre ha fabricado muy diversos compuestos químicos con objeto de satisfacer las necesidades crecientes del desarrollo tecnológico y mejorar su calidad de vida. Desde el inicio de la revolución industrial, se estiman en más de 120,000 las sustancias químicas de nueva síntesis y los subproductos derivados de éstas producidos por la actividad humana, censo que se incrementa día a día y que parece no tener fin si se considera que se incorporan a la lista cerca de 2.000 nuevos compuestos cada año (Olea y Fernández 2001). Importancia de los plaguicidas. Se ha manifestado frecuentemente que debido al empleo de plaguicidas, herbicidas y fertilizantes, las cosechas se han visto incrementadas significativamente y las pérdidas en la producción se han reducido de forma espectacular. Se sustenta que es indudable el gran beneficio derivado del empleo de los plaguicidas en los programas de salud y en la lucha contra enfermedades transmitidas por vectores o con huéspedes intermediarios (Olea y Fernández 2001). Efecto de los plaguicidas en el ambiente. El empleo de agroquímicos en las actividades agropecuarias es una de las más grandes amenazas para la pérdida de la fertilidad de los suelos, de su capacidad biodegradadora y otras funciones, frecuentemente mediante prácticas inadecuadas, constituye una de las formas de contaminación más importantes, que impactan no sólo los suelos de las áreas en donde se aplican, sino que llegan a través de los ríos hasta las zonas costeras afectando las especies marinas. La aplicación de plaguicidas genera conflictos sociales por el elevado número de trabajadores del campo intoxicados por estos productos, con un alto índice de mortalidad, así como también por la sospecha de efectos adversos sobre la salud de las comunidades vecinas, la flora y la fauna (Lichtinger et al. 2001). Los microorganismos del suelo. El suelo contiene básicamente cinco grupos de microorganismos: bacterias, actinomicetos, hongos, algas y protozoarios. Como ecosistema, el suelo incluye además a los constituyentes orgánicos e inorgánicos propios de un determinado lugar (Alexander 1980). En la tabla 1 se muestra la distribución de los microorganismos en varios horizontes del suelo. Los hábitats naturales de los microorganismos son extremadamente diversos. Cualquier hábitat que sea adecuado para el crecimiento de organismos superiores, también lo es para el crecimiento de microorganismos. Pero además, hay muchos hábitats donde, debido a las extremas condiciones físicas o químicas, no se encuentran organismos superiores; sin embargo, en ellos pueden existir microorganismos que, en algunos casos, incluso crecen mejor ahí. En la tabla 2 se muestra el número aproximado de organismos comúnmente encontrados en suelos. 3 Tabla 1. Distribución de microorganismos en diferentes profundidades de un perfil de suelo (Alexander 1980). PROFUNDIDAD (cm) 3-8 20-25 35-40 65-75 135-145 BACTERIAS AEROBIAS 7,800 1,800 472 10 1 BACTERIAS ANAEROBIAS 1,950 379 98 1 0.4 ACTINOMICETOS HONGOS ALGAS 2,080 245 49 5 - 119 50 14 6 3 25 5 0.5 0.1 - Tabla 2. Número aproximado de organismos comúnmente encontrados en suelos (Martínez 1997). Organismos Número estimado Bacterias 3,000,000 a 500,000,000/g Actinomicetos 1,000,000 a 20,000,000/g Hongos filamentosos 5,000 a 900,000/g Algas 1,000 a 500,000/g Protozoarios 1,000 a 500,000/g Levaduras 1,000 a 100,000/g Nemátodos 5,000 a 20,000/100g Requerimientos fisiológicos de los microorganismos degradadores. La mayoría de los microorganismos necesitan de diferentes factores para su óptimo crecimiento, se enlistan continuación (Ortiz et al. 1997): 1. Nutrimentos y oxígeno: Las bacterias heterotróficas para crecer necesitan una fuente de carbono, otros nutrimentos y un aceptor final de electrones, el cual es el oxígeno para el caso de las aerobias. Las bacterias llegan a necesitar micronutrimentos en concentraciones traza y algunos factores de crecimiento como aminoácidos, vitaminas u otras moléculas orgánicas. 2. Humedad del suelo: Los microorganismos, igual que todos los organismos, necesitan humedad para crecer, ya que se componen por más de un 80% de agua. Por lo tanto, es importante mantener el contenido de humedad a un nivel adecuado, que de acuerdo a varios autores, es de 50 a 80%. 3. pH del suelo: La acidez o alcalinidad de una solución afecta el crecimiento de los microorganismos. La mayoría de las bacterias crecen de manera óptima, en un rango de 6.5 a 7.5, aunque hay excepciones. 4. Temperatura: La temperatura óptima para el crecimiento de las bacterias aisladas del suelo es entre 20 y 25°C. OBJETIVO GENERAL Caracterizar e identificar bacterias de consorcios bacterianos aislados de suelos agrícolas, con capacidad de crecimiento sobre plaguicidas organofosforados. 4 MATERIAL Y METODOS Los consorcios bacterianos previamente aislados de suelos agrícolas del estado Morelos (Sánchez-Salinas 2005) fueron empleados para la obtención de cepas puras. Se realizaron cinéticas de crecimiento de los consorcios y fueron cultivaron en 30 mL de medio mineral a 10, 25 y 40 mg/L de paratión metilico y 40,60 y 100 mg/L de cadusafos como única fuente de carbono. Se cultivaron por un periodo de 120 horas, a una temperatura de 25°C, 150 rpm y bajo ausencia de luz. Proceso de selección y obtención de colonias puras (Ortiz-Hernández et al. 2002). Las colonias se eligieron en función de su morfología, tamaño, color, consistencia, bordes y superficie. Fueron cultivadas en placas con agar de soya de tripticaseína (ATS) conteniendo 15 mg/L de paratión metilico y cadusafos (concentración final). Se tomaron aquellas que se lograron aislar para asegurar la pureza. Las colonias se incubaron durante 24 horas a 37ºC, este procedimiento fue repetido varias veces para asegurar el aislamiento de las colonias. Caracterización de los consorcios bacterianos. El sistema de identificación bacteriana BBL-Crystal® fue empleado para la identificación bacteriana, adicionalmente se aplicaron diferentes pruebas bioquímicas como rojo de metilo, Voges Proskauer, Indol, tinción de Gram, oxidasa, fermentación de carbohidratos, motilidad y citrato de Simons (Koneman et al. 1992). El procedimiento para la identificación fue realizado de acuerdo con Bergey`s Manual of Systematic Bacteriology (Krieg y Holt 1984). Conservación de los consorcios. Los consorcios bacterianos y las cepas puras se adicionaron a la colección bacteriana del Laboratorio de Investigaciones Ambientales, utilizando tubos eppendorf con glicerol adicionado con cada plaguicida a una concentración final de 25 mg/L y conservados a una temperatura de -70ºC en un congelador REVCO (Yañez-Ocampo 1998). RESULTADOS Y DISCUSION De los consorcios seleccionados se aislaron 6 cepas puras para el consorcio bacteriano aislado en presencia de Paratión metílico (CB-SP) y 5 para el consorcio bacteriano aislado sobre medio con Cadusafos (CB-SC). Las diversas pruebas bioquímicas aplicadas, además del sistema de BBL Crystal, proporcionaron la información que permitió la identificación y el porcentaje de confiabilidad para cada cepa bacteriana (tabla 3). Las cepas fueron identificadas como: Bacillus brevis, Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia pseudotuberculosis, Weeksella virosa, Flavobacterium odoratu, Burkholderia cepacia, Pseudomonas stutzeri. 5 Tabla 3. Pruebas bioquímicas de las cepas aisladas. Clave CB-SP1 CB-SP2 CB-SP3 CB-SP4 CB-SP5 CB-SP6 CB-SC1 CB-SC2 CB-SC3 CB-SC4 RM - V-P - Gram + - Indol - Mot + + + + ++ - Cat + + + + + + + + + + F-C Ac SC Alc-SC Alc-SC SC Alc-SC Alc-SC Alc-SC Alc-SC Ox + -(+) + + + - CS + + +(-) + + + - Forma Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo Cocobacilo Bacilo Cocobacilo Coco Bacilo Bacilo Identificación (sistema BBL) Bacillus brevis 97% Stenotrophomonas maltophilia 98% Pseudomonas aeruginosa 97.67% Stenotrophomonas maltophilia 97.19% Yersinia pseudotuberculosis 99.99% Weeksella virosa 97.67% Flavobacterium odoratum 85% Burkholderia cepacia 75% Burkholderia cepacia 99.8% Stenotrophomonas maltophilia 99.8% Alc-SC CB-SC5 + + Alc-SC + + Coco Pseudomonas stutzeri 87.67% RM = Rojo de metilo; V-P = Voges-Proskauer; Gram = Tinción de gram; Mot = Motilidad; F-C = Fermentación de carbohidratos; CS = Citrato de simons; Ac = Acido. Características de las bacterias identificadas Bacillus brevis. Este género es típico de la familia Bacillaceae, comprende más de 40 especies de bacilos aerobios y anaerobios facultativos grampositivos que producen endosporas y son generalmente cilíndricos o elipsoidales. La mayor parte de las especies producen catalasa (Grimont et al. 1991). Las especies de Bacillus son de naturaleza ubicua y habitan en el suelo, agua y polvo del aire. Bacillus brevis mide 0.60.9 µm x 1.5-4 µm. Algunas pueden ser parte de la flora intestinal normal del hombre y los animales (Krieg y Holt 1984). B. brevis, se ha aislado principalmente de suelos, de agua y de alimentos. Este microorganismo produce antibióticos como la gramicidina y la tirotricina (Zinsser 2004). Esta especie fue aislada a partir de suelos agrícolas con un amplio historial de aplicaciones de plaguicidas organofosforados. Crawford (1975) informa que esta especie presenta una importante eficiencia en remoción de hidrocarburos. B. brevis, resultó ser la cepa con mayor capacidad de crecimiento en un medio mínimo con paratión metílico como única fuente de carbono. Stenotrophomonas maltophilia. Anteriormente conocida como Pseudomonas maltophilia o Xantophomonas maltophilia, es un bacilo gram-negativo no fermentativo, aerobio, (Schaumann 2003). Móvil mediante varios flagelos polares, es un microorganismo ubicuo que ha sido aislado en numerosas fuentes de agua: ríos, pozos, lagos, agua embotellada, y aguas negras; suelo; animales; alimentos; plantas y residuos orgánicos (López et al. 2003). Lee et al. (2002), reportan a esta especie con capacidad para degradar tolueno, benceno, etilbenzeno, y xileno, esto permite plantear su potencial en la degradación de residuos de plaguicidas, suelos y aguas contaminados con estos xenobioticos. Pseudomonas aeruginosa. Es un bacilo gram-negativo versátil, aerobio, pertenece a la familia pseudomonadaceae, mide 0,5 a 0,8 µm por 1,5 a 3,0 µm, son móviles por medio de un flagelo polar, habita en suelo y agua. Su temperatura óptima para el crecimiento es 37ºC y crece a temperaturas de hasta 42ºC. Es un patógeno oportunista causa infecciones de la zona urinaria, infecciones del sistema respiratorio, dermatitis, bacteremia, y las infecciones gastrointestinales. Es resistente a las altas concentraciones de sales y de tintes, de antisépticos débiles, y de muchos antibióticos 6 comúnmente usados (Zinsser 2004). Esta bacteria es capaz de utilizar una enorme variedad de compuestos orgánicos como sustrato para crecer, capacidad que le permite colonizar nichos en los que son escasos los nutrimentos que otros organismos pueden asimilar. Se han reportado cepas de P. aeruginosa que tienen la capacidad de degradar alcanos y alquenos de cadena ramificada y que, por tanto, son útiles en la limpieza de sitios contaminados con estos compuestos o con metales pesados (Soberón-Chávez et al. 1994). Yersinia pseudotuberculosis. El genero Yersinia incluye 11 especies, tres de las cuales son potencialmente patógenas para humanos: Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis y Yersinia enterocolitica. Yersinia Pseudotuberculosis es un cocobacilo gram negativo, pertenece a la familia Enterobacteriaceae. Aislada por primera vez en 1883 por Malasez y Vignal el organismo recibió distintos nombres hasta concluir en el genero Yersinia. La designación de pseudotuberculosis deriva de la característica histopatológica encontradas en nodos linfáticos mesentéricos. Yersinia pseudotuberculosis se encuentra distribuida ampliamente en el ambiente (suelo, agua, vegetales, etc) esta bacteria es el patógeno principal de animales salvajes y domésticos en todos los continentes. Casi todas las especies de animales son vectores. Es la causante, en los gatos, de la pseudotuberculosis felina, enfermedad de pronóstico fatal en la que se producen lesiones piogranulomatosas generalizadas. El contagio es por la ingestión de pequeñas aves y roedores que son portadores de la bacteria; en el hombre es la responsable de la peste bubónica. Aun cuando no hay reportes de su posible capacidad de degradación de xenobioticos y su patogenicidad, es importante realizar experimentos de cinéticas de degradación de la cepa y de sus extractos enzimáticos, afín de confirmar su capacidad de transformación de los organofosforados y la posibilidad de continuar con otros trabajos con herramientas moleculares. Weeksella virosa. Es un bacilo gram-negativo, catalasa positiva. (Reina et al. 1990). Se reporta como un nuevo género y una nueva especie, aerobias, no presentan movilidad, son aisladas de los especimenes clínicos humanos (Holmes et al. 1986). En relación taxonómica las flavobacterias son suficientemente similares al género Weeksella por lo que Botha et al. (1989) sugieren la inclusión posible en este género. Además mencionan que Weeksella virosa presenta una semejanza con Bergeyella, al ser examinadas por taxonomía numérica (Botha et al. 1998). Hasta el momento no se sabe donde clasificarla, debido a la semejaza que presenta con estas dos bacterias. No se encontraron reportes acerca de su capacidad de crecer o degradar algún xenobiotico. Flavobacterium Odoratum. Se encuentra en suelo, agua, plantas y materias del alimento. Mide 0.5 µm x 1.0-2.0 µm, es un cocobacilo gram negativo, aerobio facultativo y presenta movilidad por flagelos peritricos. Las colonias son generalmente de color amarillo, producen olor a frutas. Es característico que reduzcan nitritos pero no nitratos. Son no fermentadores, indol negativo, oxidasa positiva. Algunas especies del Flavobacterium son capaces de degradar el pentaclorofenol y otros compuestos similares. Éste es un ejemplo de las capacidades de biodegradación de este género (Korin 2004). 7 Burkolderia cepacia. Pertenece a la familia Pseudomonadaceae que incluye cuatro géneros diferentes (Pseudomonas, Xanthomonas, Frateuria y Zooglea). Esta especie se ubica dentro del género Pseudomonas. En medio sólido TS en un periodo de 24 horas a 28ºC se observan colonias grandes 4-6 mm de diámetro, distribuidas por todo el medio, poseen una forma fusiforme con bordes ondulados irregulares y una superficie convexa, presentan un color café claro y son opacas (Yañez-Ocampo 1998). B. cepacia (antes denominadas Pseudomonas cepacia) es un bacilo Gram negativo no fermentador, multiresistente. Es un reconocido patógeno en pacientes portadores de fibrosis quística (FQ) y neutropénicos. Descrito en 1950 como patógeno de plantas, especialmente encontrado en cebollas y ampliamente distribuido en el suelo, puede también crecer en antisépticos (Gil 2001). Burkholderia cepacia se reporta para la biorecuperación de suelos contaminados con residuos tóxicos (Hillyard 2005). Pseudomonas stutzeri. Es una bacteria gram negativa, presenta respiración aeróbica, presenta motilidad, crece a una temperatura optima de 37ºC. Auto compiten con otras bacterias a un pH 8.2. Puede crecer en niveles bajos de hierro y degradar el tetracloruro de carbono a bióxido de carbono o a otros compuestos inertes (Dybas 1995). Secretan una biomolecula, pyridine-2,6-bis (thiocarboxylic acid) (PDTC). Esta biomolécula es usada en transformaciones de tetracloruro de carbono a CO2 (Lewis 1999). Es un microorganismo con una extraordinaria variabilidad fenotípica y genotípica. Debido a esta enorme variabilidad genotípica la especie se subdivide en genomovares, entendiendo a la genomovar como un estatus taxonómico provisional que agrupa a cepas genotípicamente similares dentro de una misma especie. En la actualidad se conocen 18 genomovares diferentes (Cladera et al. 2005). Son muy numerosas las publicaciones en las que se hace referencia a la capacidad de Pseudomonas sp. Para sobrevivir e incluso degradar una amplia variedad de compuestos orgánicos como los plaguicidas, los hidrocarburos derivados del petróleo y otros compuestos halogenados (Fuenmayor y Rodríguez 1997, Lee y Kim 1997, Ashok et al. 1995, Lebkowska et al. 1995, Chablain et al. 1997, Whyte et al. 1997, Kallastu et al. 1998, Kumasi et al. 1998, Moller et al. 1998, Bieszkiewics et al. 1998, Hubert et al. 1999, Isken et al. 1999). Diferentes bacterias identificadas son reportadas como patógenas, sin embargo con un manejo adecuado como el tratamiento de residuos en reactores, o bien utilizando herramientas moleculares como la clonación y la transformación, pueden ser utilizadas en el tratamiento de residuos de plaguicidas como el paratión metílico y cadusafos y probablemente de otros de la misma familia química. CONCLUSIONES Se identificaron ocho especies bacterianas: Bacillus brevis, Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia pseudotuberculosis, Weeksella virosa, Flavobacterium odoratu, Burkholderia cepacia, Pseudomonas stutzeri. Bacillus brevis, Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas aeruginosa, Flavobacterium odoratu, Burkholderia cepacia, Pseudomonas stutzeri, han sido reportadas por su capacidad de degradar diferentes xenobioticos. 8 Los géneros identificados son pobladores frecuentes de suelos y aguas. REFERENCIAS Alexander, M. 1980. Introducción a la microbiología del suelo. 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