BD Mueller Hinton Chocolate Agar

INSTRUCCIONES DE USO –
MEDIOS EN PLACA LISTOS
PARA USAR
PA-254035.05
Rev.: Sep 2011
BD Mueller Hinton Chocolate Agar
USO PREVISTO
BD Mueller Hinton Chocolate Agar (agar chocolate Mueller Hilton) se utiliza para el
aislamiento y cultivo de bacterias exigentes a partir de muestras clínicas. También se puede
utilizar para las pruebas de sensibilidad de Neisseria gonorrhoeae.
PRINCIPIOS Y EXPLICACION DEL PROCEDIMIENTO
Método microbiológico.
Dado que los laboratorios de microbiología clínica utilizaban a principios de los años 60 una
amplia variedad de procedimientos para determinar la sensibilidad de bacterias a antibióticos y
otros agentes quimioterapéuticos, Bauer, Kirby y otros desarrollaron un procedimiento
estandarizado en el que se seleccionó como medio de prueba el agar Mueller Hinton, un
medio originalmente diseñado para el aislamiento de gonococos1-4. Un estudio colectivo
internacional posterior confirmó el valor del agar Mueller Hinton Agar para este propósito por la
reproducibilidad relativamente buena del medio, la sencillez de su fórmula y la riqueza de los
datos experimentales que habían sido acumulados utilizando este medio5.
Según CLSI, el medio recomendado para la prueba de sensibilidad de difusión en disco de
Streptococcus pneumoniae es el agar Mueller Hinton con 5% de sangre de carnero. El medio
recomendado para Haemophilus influenzae es el agar de medio de prueba Haemophilus
(HTM). Los criterios de interpretación se proporcionan en CLSI Document M100 (M2), que se
incluye con CLSI Document M2, Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility
Tests, 7th ed.; Approved Standard6. El medio recomendado para Neisseria gonorrhoeae es
agar GC con un suplemento de crecimiento definido. Según otros datos, el agar Mueller Hinton
con hemina e Iso-VitaleX puede utilizarse para las pruebas de sensibilidad sistemática de N.
gonorrhoeae ante penicilina y estroptomicina.7
El agar Mueller Hinton Agar, cuando se suplementa con sangre calentada o hemoglobina y
factores de crecimiento (por ejemplo, BD IsoVitaleX) se ha recomendado como medio no
selectivo para el aislamiento de Neisseria y Haemophilus8.
En BD Mueller Hinton Chocolate Agar, el extracto de carne bovina y peptona de caseína
proporcionan los nutrientes. El almidón absorbe los compuestos tóxicos tales como los ácidos
grasos procedentes de las torundas de algodón. La hemoglobina proporciona el factor X. BD
IsoVitaleX suministra vitaminas y factores de crecimiento, incluido el factor V (NAD) que es
necesario para el crecimiento de Haemophilus influenzae.
REACTIVOS
BD Mueller Hinton Chocolate Agar
Fórmula* por litro de agua purificada
Extracto de carne bovina
2,0 g
Hidrolizado ácido de caseína
17,5
Almidón
1,5
Hemoglobina
10,0
10,0 mL
IsoVitaleX
Agar
17,0 g
pH 7,3 ± 0,2
* Ajustada y/o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento.
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BD IsoVitalex Enrichment contiene los siguientes factores de crecimiento (fórmula* por litro de
agua purificada):
Vitamina B 12
L-glutamina
Adenina
Clorhidrato de guanina
Ácido p-aminobenzoico
Nicotinamida adenina dinucleótido (NAD)
Pirofosfato de tiamina
Nitrato férrico
Clorhidrato de tiamina
Hidrocloruro de cisteína
L-cistina
Glucosa
0,01 g
10,0
1,0
0,03
0,013
0,25
0,1
0,02
0,003
25,9
1,1
100,0
* Ajustada y/o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento.
PRECAUCIONES
. Solamente para uso profesional.
No utilizar las placas si muestran evidencia de contaminación microbiana, decoloración,
deshidratación, agrietamiento o cualquier otro signo de deterioro. La reducción excesiva de este
medio debido a la deshidratación puede causar resultados de sensibilidad falsos.
Consultar los procedimientos de manipulación aséptica, riesgos biólogicos y desecho del
producto usado en el documento INSTRUCCIONES GENERALES DE USO.
ALMACENAMIENTO Y VIDA UTIL
Al recibir las placas, almacenarlas en un lugar oscuro a una temperatura entre 2 y 8 °C,
envueltas en su envase original, hasta justo antes de usarlas. Evitar la congelación y el
calentamiento excesivo. Las placas pueden inocularse hasta su fecha de caducidad (ver la
etiqueta en el paquete) e incubarse durante los períodos de incubación recomendados.
Las placas de grupos de 10 placas ya abiertos pueden usarse durante una semana siempre que
se almacenen en un lugar limpio a una temperatura entre 2 y 8 °C.
CONTROL DE CALIDAD DEL USUARIO
Inocular muestras representativas con las cepas siguientes (para obtener los detalles, véase el
documento INSTRUCCIONES GENERALES DE USO). Incubar las placas a una temperatura
de 35 ± 2 °C en una atmósfera aerobia con dióxido de carbono. Efectuar lectura de las placas
después de 18 – 24 h y 42 – 48 h de incubación.
Cepas
Resultados del crecimiento
Haemophilus influenzae ATCC 10211
Crecimiento de bueno a excelente
Neisseria gonorrhoeae ATCC 43069
Crecimiento de aceptable a excelente
Neisseria meningitidis ATCC 13090
Crecimiento de bueno a excelente
Streptococcus pneumoniae ATCC 6305
Crecimiento de bueno a excelente
Sin inocular
Marrón chocolate, opaco,
posiblemente poco homogéneo
Para inoculación e incubación de pruebas de sensibilidad, véase Procedimiento de análisis.
Cepa de prueba
Disco de prueba de
Tamaño de
zona* (mm)
sensibilidad
Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226
Penicilina P-10
33 – 40
Estreptomicina SPT-100
25 – 31
* Tamaños de zona basados en resultados de al menos 3 lotes diferentes de BD Mueller Hinton
Chocolate Agar
PROCEDIMIENTO
Materiales suministrados
BD Mueller Hinton Chocolate Agar (placas Stacker de 90 mm). Controladas
microbiológicamente.
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Materiales no suministrados
Medios de cultivo auxiliar, reactivos y equipo de laboratorio que se requiera.
Tipos de muestras
BD Mueller Hinton Chocolate Agar se puede utilizar para todo tipo de muestras clínicas
potencialmente infectadas con organismos exigentes, en especial (pero no exclusivamente) las
muestras de zonas corporales esencialmente estériles (por ejemplo, líquido cefalorraquídeo,
abscesos) y como medio de subcultivo de hemocultivos. Se utiliza principalmente para el
aislamiento no selectivo de Neisseria, Haemophilus y otras bacterias que pueden no crecer en
los medios de agar sangre utilizados normalmente, tal como el agar Columbia con sangre de
carnero al 5%. (Véase también CARACTERISTICAS DE RENDIMIENTO Y LIMITACIONES
DEL PROCEDIMIENTO).
El uso de este medio para pruebas de sensibilidad sistemáticas de Neissseria gonorrhoeae con
penicilina G y estreptomicina requiere el uso de cultivos puros. ¡No inocular la muestra para
realizar pruebas de sensibilidad directas!
Recogida y transporte de las muestras
Neisseria gonorrhoeae, N. meningitidis, Haemophilus y otros organismos exigentes son
sensibles a las condiciones ambientales adversas. Por consiguiente, se deben utilizar medios
de transporte adecuados para todas las muestras. Las muestras deben ser enviadas al
laboratorio tan pronto como sea posible y no deben transcurrir más de 24 horas, incluso si se
utilizan medios de transporte. La temperatura de transporte óptima es de 20 – 25 °C. ¡No
refrigerar!9,10
Procedimiento de análisis
Para el aislamiento de organismos exigentes, extender las muestras tan pronto como se reciban
en el laboratorio. La placa de extensión se utiliza principalmente para aislar cultivos puros de las
muestras que contienen flora mixta.
Si, por el contrario, el material se cultiva directamente empleando una torunda, hacerla girar en
una sección pequeña cercana al borde, extendiendo luego para hacer el aislamiento a partir de
esta área inoculada.
Si la muestra se ha obtenido de una zona corporal con flora normal, también debe inocularse en
los medios selectivos adecuados, según el agente patógeno que se desee aislar. Para
Neisseria gonorrhoeae, se debe incluir una placa BD Martin-Lewis Agar, modified o BD GCLect Agar y, para Haemophilus, una placa BD Chocolate Agar with IsoVitaleX and
Bacitracin.
Incubar las placas a una temperatura de 35 ± 2 °C en una atmósfera aerobia con dióxido de
carbono. Efectuar lectura de las placas después de 18 – 24 h y 42 – 48 h de incubación.
Para pruebas de sensibilidad sistemáticas de N. gonorrhoeae, el aislado, que debe ser un
cultivo puro, se suspende en BD Trypticase Soy Broth para lograr el equivalente del patrón de
turbidez 0,5 de McFarland. En un plazo de 15 min después de ajustar la turbidez del inóculo,
sumergir una torunda estéril en el inóculo diluido correctamente y hacerla rodar con firmeza
varias veces contra la pared interna superior del tubo para exprimir el exceso de líquido.
Inocular toda la superficie del agar de la placa tres veces, girando la placa 60 grados cada vez
para obtener una inoculación uniforme.
Aplicar los discos mediante un dispensador de discos antimicrobianos, empleando precauciones
asépticas. Depositar los discos de modo que los centros queden a no menos de 24 mm de
distancia. Es preferible depositar los discos de penicilina de manera que no queden a menos de
10 mm del borde de la placa de Petri. Una vez colocados los discos sobre el agar, presionarlos
con una aguja o pinza estéril hasta obtener un contacto completo con el medio. Este paso no es
necesario si los discos se colocan con el dispensador de autoapisonamiento de 6 u 8 posiciones
BD Sensi-Disc.
15 minutos o menos después de aplicar los discos, invertir las placas e incubarlas en una
atmósfera aerobia enriquecida con dióxido de carbono al 5% a 35 – 37 °C durante
20 – 24 horas.
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Resultados
Morfología típica de colonias en BD Mueller Hinton Chocolate Agar:
Haemophilus influenzae
Neisseria gonorrhoeae
Neisseria meningitidis
Streptococcus pneumoniae
Pequeñas, húmedas, nacaradas con un olor de "ratón"
característico
Pequeñas, de color blanco grisáceo a incoloro, mucoides
Medianas a grandes, gris azulado, mucoides
Colonias pequeñas, planas o más grandes, mucoides
verdosas, las colonias circundantes pueden ser verdosas
Pruebas de sensibilidad: Se debe efectuar la lectura de las zonas desde la parte superior de la
placa. La sensibilidad a la penicilina debe confirmarse con una prueba de beta-lactamasa, por
ej., la prueba BD Cefinase.
CARACTERISTICAS DE RENDIMIENTO Y LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
BD Mueller Hinton Chocolate Agar es un medio no selectivo enriquecido en el que crecen
bacterias exigentes y no exigentes, incluida la flora normal. Por consiguiente, se recomienda
inocular las muestras también en medios selectivos adecuados.
El término “bacterias exigentes” se refiere a las bacterias que no crecen o no crecen bien en los
medios de aislamiento primario utilizados normalmente con sangre de carnero: por ej.,
Haemophilus, Neisseria patógena y muchos otros organismos. Consultar las referencias para
obtener las descripciones detalladas acerca del tipo de muestras que deben inocularse en este
medio y el tipo de organismos para los que se utiliza este medio para aislamiento10,11.
No se ha probado si este medio favorece el crecimiento de estreptococos con variaciones en la
nutrición.
Son muy elevados el número y los tipos de especies bacterianas que se comportan como
agentes infecciosos. Por consiguiente, antes de utilizar sistemáticamente este medio para
microorganismos aislados con poca frecuencia o descubiertos recientemente, primero debe
probarse su idoneidad para lograr cultivos puros del organismo en cuestión.
Los tamaños de zona de sensibilidad encontrados en este medio no presentan una plena
concordancia con las mencionadas en CLSI Standard M26 reseñadas con el uso de agar
chocolate GC con un suplemento de crecimiento definido.
REFERENCIAS
1. Bauer, A.W., W.M.M. Kirby, J.C. Sherris, and M. Turck. 1966. Antibiotic susceptibility
testing by a standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 45: 493-496.
2. Ryan, K.J., F.D. Schoenknecht, and W.M.M. Kirby. 1970. Disc sensitivity testing. Hospital
Practice 5:91-100.
3. Mueller, J.H., and J. Hinton. 1941. A protein-free medium for primary isolation of the
gonococcus and meningococcus. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 48: 330-333.
4. Barry, A.L., F. Garcia, and L.D. Thrupp. 1970. An improved single-disk method for testing
the antibiotic susceptibility of rapidly-growing pathogens. Am. J. Clin. Pathol. 53: 149-158.
5. Ericsson, H.M., and J.C. Sherris. 1971. Antibiotic sensitivity testing. Report of an
international collaborative study. Acta Pathol. Microbiol. Scand. Sec. B, Suppl. 217.
6. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly NCCLS). Approved standard: M2.
Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. CLSI, Wayne, PA,
USA.Search for latest version at www.clsi.org
7. Berger, U. 1992. Neisseriaceae. In: Mikrobiologische Diagnostik (F. Burkhardt, ed.). Thieme
Verlag, Stuttgart, Germany.
8. Nash, P., and M.M. Krenz. Culture media. In: Manual of clinical microbiology, (Balows, A., et
al., eds.). 5th edition. American Society for Microbiology, Washington, D.C., USA.
9. Miller, J.M., and H.T. Holmes. 1995. Specimen collection, transport, and storage. In: Murray,
P. R., E. J. Baron, M. A. Pfaller, F. C. Tenover, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical
microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C.
PA-254035.05
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10. Forbes, B.A., and P.A. Granato. 1995. Processing specimens for bacteria. In: P.R. Murray,
E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken (ed.), Manual of clinical
microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C.
11. P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken (ed.). 1995. Manual of
clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C.
ENVASE/DISPONIBILIDAD
BD Mueller Hinton Chocolate Agar
Nº de cat. 254035
Medios en placa listos para usar, 20 placas
Nº de cat. 254082
Medios en placa listos para usar, 120 placas
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