IA-MBA-PT- 002 Determinación de Listeria

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14/06/11
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IA-MBA-PT- 005
Determinación de Listeria monocytogenes en
productos cárnicos listos para consumir y muestras
de superficie por PCR
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Elaborado por: Jefe de Sección
Revisado por: Coordinador Técnico de Sección
Aprobado por: Jefe de Sección
1. Objetivo
Disponer de un método para detectar la presencia de Listeria monocytogenes.
2. Alcance
Para aplicar en muestras de productos cárnicos listos para consumir y muestras de superficie.
3. Responsabilidad y Autoridad
El Jefe de Sección: Velar por el cumplimiento de las normas establecidas en este procedimiento.
Coordinador Técnico de Sección: Velar por el cumplimiento de las normas establecidas en este
procedimiento
Analista de laboratorio: Realizar el ensayo según lo descrito en este procedimiento.
4. Definiciones
No aplica
5. Abreviaturas y/o siglas
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa
6. Referencias y o Bibliografía
IA- IA-MBA-PT- 002 Determinación de Listeria monocytogenes en productos cárnicos listos para
consumir y muestras de superficie.
IA-MBA-PE-009-RE-011 Hoja de trabajo: Análisis de Listeria monocytogenes
SEG-PE- 005 Control de medios de cultivo
IA-MBA-PE- 015 Control de calidad de reactivos
IA-MBA-PE-009 Manejo de la muestra.
USDA/FSIS Microbiology Laboratory Guidebook Online, MLG 8.07 revisión 07 y MLG 8A.04 revisión
04 (03/08/09)
®
Instructivo Guía DuPont Qualicon BAX System
7. Descripción del procedimiento
7.1 Fundamento teórico
El método consiste en el enriquecimiento de la muestra en caldo UVM y caldo MOPS – BLEB
posteriormente se realiza la prueba de PCR por medio del Sistema BAX. Las muestras positivas se
cultivan en un medio selectivo y se confirman, por medio de pruebas bioquímicas, pruebas
diferenciales (motilidad, hemólisis) y prueba del ARN Ribosomal.
7.2 Equipo, materiales, medios de cultivo y reactivos
7.2.1 Equipo
Balanza sensibilidad ± 0,1g
Homogenizador o Stomacher
Incubadora de 30 ºC ± 1ºC
Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no
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Incubadora de 35 ºC  2 ºC
®
Sistema BAX (Ciclador/detector, computadora e impresora)
Calentadores para blocks
Block de enfriamiento para lisis a 4 ºC ± 2 ºC
Block de calentamiento a 55 ºC ± 2 ºC
Block de calentamiento a 95 ºC ± 3 ºC
Block de enfriamiento para PCR a 4 ºC ± 2 °C
Bandeja para tubos de PCR
Gradilla para tubos de PCR
Pipeta repetidora de 20 µ l -200 µl
Pipeta repetidora de 5 µ l -50 µl
Pipeta repetidora multicanal de 5 µl -50 µl
Abridor de tubos PCR
Abridor tubos Simport T100-4G para lisis
7.2.2 Materiales
Bolsas plásticas estériles 7 pulg x 12 pulg (ancho x largo) LABPLAS EPR 7012
Bolsas plásticas estériles con esponja LABPLAS KSS21100
Pipetas de vidrio de 1 ml, 2 ml
Asas bacteriológicas
Aplicador es con algodón estéril
Marcadores de tinta permanente
Desinfectante Virkon S
Solución de cloro al 1%
Solución de etanol al 70 %
Guantes de nitrilo libre de talco
Puntas para micropipeta 20 µl -200 µl
Puntas para pipetas repetidoras de 20 µl -200 µ l
Puntas para pipetas repetidoras de 5 µl -50 µl
Jeringa dosificadora de 5 ml
Biotubo para lisis Simport T 100-4G
Tapas para Biotubo para lisis Simport T100-35
7.2.3 Medios de Cultivo
Caldo UVM
Acido Morfolin propano sulfonico + Caldo Buferado Enriquecimiento Listeria (MOPS-BLEB)
Agar Oxford Modificado (MOX)
7.2.4 Kit
®
BAX Assay for Screening L. monocytogenes (Qualicon D11000157) a 4 °C ± 2 °C
7.2.5 Cepas de referencia
Listeria monocytogenes ATCC 19111
Listeria innocua ATCC 33090
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7.3
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Procedimiento
Día 1
7.3.1 Procesar y enriquecer la muestra de acuerdo al procedimiento IA-MBA-PT- 002 sección 7.31 al
punto 7.3.7
Día 2
7.3.2
Transferir 0.1 ml  0.02 ml de caldo UVM a tubos con 10 ml  0,5 ml de MOPS-BLEB.
Incubar los tubos MOPS-BLEB inoculados a 35 °C  2 °C por 18-24 horas.
7.3.3
Con una asa bacteriológica rayar aproximadamente 0,1 ml de UVM la superficie de una placa
de MOX. Alternativamente se puede introducir un aplicador con algodón estéril el UVM y rayar
el 25% al 50 % de la superficie de MOX y con un asa bacteriológica estéril rayar la superficie
del plato restante para aislar colonias de la superficie previamente inoculada. Incubar a 35 °C
 2 °C por 26  2 horas.
Día 3
®
7.3.4
Hacer la prueba de PCR BAX Listeria monocytogenes siguiendo instrucciones del fabricante.
7.3.5
Confirmación de resultados
BAX positivos: Con una asa bacteriológica rayar
aproximadamente 0.1 ml de MOPS-BLEB la superficie de una placa de MOX. Alternativamente
se puede introducir un aplicador con algodón estéril el MOPS-BLEB y rayar el 25 al 50 % de
la superficie de MOX y con un asa bacteriológica estéril rayar la superficie del plato superficie
del plato restante para aislar colonias de la superficie previamente inoculada. Incubar a 35 °C
2 °C un mínimo de 24 horas.
7.3.6
Hacer aislamiento e identificación siguiendo procedimiento IA-MBA-PT- 002 sección 7.3.10,
7.3.21 y del 7.3.23 al 7.3.28.
7.4
7.4.1
Interpretación de resultados
Muestras que dan negativo a la prueba BAX y son negativas en el MOX de 24 horas del primer
enriquecimiento se reportarán como negativas. Si la prueba BAX es negativa pero el cultivo en
MOX presenta colonias típicas o la prueba de BAX es positiva, indeterminada o presenta un
resultado invalido, se debe continuar con el cultivo de las muestras.
7.4.2 Basado en el análisis de las causas, los resultados indeterminados o inválidos en las muestras
analizadas se procede a:
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- Repetir la prueba del BAX a partir de la muestra lisada.
®
-Preparar nuevos tubos de BAX y repetir el análisis de PCR.
Si el control positivo da un resultado negativo, en la prueba de PCR BAX, se debe:
a) Hacer el análisis de nuevo a partir de la muestra de reserva desde la preparación de la
muestra y el enriquecimiento.
b) O rayar el MOPS-BLEB,
de los controles y las muestras, en MOX
y seguir
procedimiento IA-MBA-PT- 002 a partir sección 7.3.10.
Si por alguna razón no se pueda hacer uso del BAX (interrupción fluido eléctrico o fallo del
equipo) se debe seguir procedimiento IA-MBA-PT- 002 Determinación de Listeria
monocytogenes en productos cárnicos listos para consumir y muestras de superficie, a
partir de la sección 7.3.10.
7.5 Control de Calidad
7.5.1 Cada lote de reactivos y los kit BAX para Listeria monocytogenes se les hará control de
calidad por medio de cepas de referencia siguiendo procedimiento IA-MBA- PE-015 Control de
Calidad de Reactivos.
7.5.2
El control de calidad de los medios de cultivo utilizados se debe llevar a cabo de acuerdo al
procedimiento SEG-PE-005 Control de medios de cultivo.
7.6 Puntos Críticos de Control
Control de las temperaturas de los incubadores: se debe mantener el registro de la temperatura óptima
de cada incubador, así como las medidas correctivas a seguir en caso de alguna variable.
8. Anexos
No aplica
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