PLATELIA™ CANDIDA Ag 96 PRUEBAS 62798 PLATELIA™ CÁNDIDA AG ES UN ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO TIPO SANDWICH REALIZADO EN MICROPLACA PARA LA DETECCIÓN DEL ANTÍGENO MANANO DE CÁNDIDA EN SUERO. 1- USO PREVISTO Platelia™ Cándida Ag es un ensayo inmunoenzimático tipo sandwich realizado en microplaca para la detección del antígeno manano circulante de Cándida en muestras de suero. 2- INDICACIONES DE USO Platelia™ Cándida Ag (ref. 62798) es una prueba que, en combinación con Platelia™ Cándida Ab/Ac/Ak (ref. 62799), permite un diagnóstico más temprano y mejora la sensibilidad del diagnóstico de candidiasis invasiva como parte de un método diagnóstico completo que integra datos clínicos y micológicos además de la evaluación de los factores de riesgo intrínsecos e iatrogénicos 12. Este uso combinado también forma parte de un sistema de seguimiento clínico y en laboratorio del paciente como ayuda a la toma de decisiones sobre el tratamiento. 3- RESUMEN Y EXPLICACIÓN Las infecciones por Cándida son la forma más frecuente de infección fúngica nosocomial 2. Las formas invasivas representan las infecciones más graves, con tasas de mortalidad que varían entre el 30 % y el 70 % en los individuos inmunodeprimidos 10. El diagnóstico de infecciones invasivas por Cándida es difícil de establecer debido a que los síntomas clínicos son poco específicos y a que los cultivos son poco sensibles, a pesar de los importantes avances conseguidos recientemente en este campo. El diagnóstico de candidiasis invasiva, que conduce al inicio del tratamiento adecuado, suele basarse en una combinación de consideraciones clínicas, micológicas y de factores de riesgo 7. En este contexto, el diagnóstico de la candidiasis sistémica debe incluir siempre técnicas serológicas además de estudios micológicos directos. La detección de antígenos circulantes en el suero parece mejorar el diagnóstico de la infección por Cándida, especialmente en individuos inmunodeprimidos. El manano, uno de los diversos antígenos del género Cándida, es un polisacárido ligado en forma no covalente a la pared celular de la levadura y representa más del 7 % del peso en seco de la C. albicans 3. Este antígeno parece ser uno de los principales marcadores de la candidiasis invasiva 6. 4- PRINCIPIO DEL PROCEDIMIENTO Platelia™ Cándida Ag es un ensayo inmunoenzimático tipo sándwich realizado en microplaca en una sola fase que permite la detección cuantitativa o cualitativa del antígeno manano circulante en el suero humano. El ensayo usa el anticuerpo monoclonal de rata EBCA 1, que se dirije contra los α 1,5 oligomanósidos de la Cándida y se ha caracterizado en estudios anteriores 1, 5, 11. El anticuerpo monoclonal se usa para : 42 • recubrir los pocillos de la microplaca y unirse al antígeno manano • detectar el antígeno unido a la microplaca sensibilizada (reactivo conjugado: anticuerpo monoclonal unido a peroxidasa). Las muestras de suero se someten a un tratamiento térmico en presencia de EDTA para disociar los complejos inmunes y precipitar las proteínas séricas que podrían interferir con la prueba. Las muestras de suero tratadas y el conjugado se añaden a los pocillos recubiertos con anticuerpo monoclonal y se incuban. Se forma un complejo anticuerpo monoclonal– manano– anticuerpo monoclonal/ peroxidasa en presencia del antígeno manano. Las tiras se lavan para eliminar todo el material que no se haya ligado. A continuación se añade la solución de sustrato, que reaccionará con los complejos ligados al pocillo y dará lugar a una reacción de color azul. La reacción enzimática se para al añadir ácido, que cambia el color de azul a amarillo. La absorbancia (densidad óptica) de las muestras, controles y puntos de rango se determina con un espectrofotómetro configurado a una longitud de onda de 450 y 620 nm. La prueba puede realizarse según dos modos: • Modo cuantitativo: estableciendo una curva de calibración a partir de 4 puntos de rango: 2,0, 1,0, 0,5 y 0,25 ng/mL. Los resultados de las muestras se muestran en ng de manano por mL de suero. • Modo cualitativo: sólo se usan los puntos de rango de 0,25 ng/mL y 0,5 ng/mL; la comparación entre la DO de las muestras analizadas y la DO de los 2 puntos de rango permite expresar los resultados como suero negativo, intermedio o positivo. 5- REACTIVOS Platelia™ Cándida Ag: nº de producto 62798 (96 pruebas) Almacene el kit entre +2ºC y +8ºC. Antes de usarlos, deje que todos los reactivos alcancen la temperatura ambiente (entre +18ºC y +25ºC). Después del uso, vuelva a poner todos los reactivos a una temperatura entre +2ºC y +8ºC. Vuelva a poner las tiras o placas no usadas en la bolsa y ciérrela. No saque el desecante. Las tiras deberían usarse en un plazo de 5 semanas después de abrir y volver a cerrar la bolsa. Una vez diluida, la solución de lavado puede guardarse durante 14 días entre +2ºC y +8ºC. Los demás reactivos son estables hasta la fecha de caducidad, incluso una vez abiertos. Se suministra suficiente cantidad de reactivos para realizar 96 pruebas en un máximo de 6 tandas. 43 Componente R1 R2 R3 Contenidos Microwell Strip Plate Placa de tiras de micropocillos : - 96 pocillos (12 tiras de 8 pocillos cada una) recubiertos con anticuerpo monoclonal antimanano EBCA 1 Concentrated Solución de lavado concentrada (10x) : Washing - Tampón Tris-NaCl (pH 7,4) Solution (10x) - 1 % Tween® 20 - Conservante: 0,01 % timerosal Negative Suero de control negativo : Control - Suero humano de control negativo para Serum manano, usado como control negativo y diluyente para el suero estándar durante la preparación de los puntos de rango 1,0, 0,5 y 0,25 ng/mL en la prueba cuantitativa y para la preparación del suero calibrador en la prueba cualitativa (véase el apartado 10, “Procedimiento") - Negativo en anticuerpos antiVIH-1, antiVIH-2 y antiVHC, así como en antígeno HBs - Conservante: < 0,1 % azida sódica Cantidad 1 placa/ 12 x 8 pocillos 1 x 100 mL 1 x 10 mL R4 Calibrator Serum Suero calibrador : - Suero humano con 2,0 ng/mL de manano, usado para la preparación de los puntos de rango 1,0, 0,5 y 0,25 ng/mL en la prueba cuantitativa y para la preparación del suero calibrador en la prueba cualitativa (véase el apartado 10, “Procedimiento”) - Negativo en anticuerpos antiVIH-1, antiVIH-2 y antiVHC, así como en antígeno HBs - Conservante: < 0,1 % azida sódica 2 x 2 mL R5 Positive Control Serum Suero de control positivo : - Suero humano con entre 0,5 y 1,5 ng de manano - Negativo en anticuerpos antiVIH-1, antiVIH-2 y antiVHC, así como en antígeno HBs - Conservante: < 0,1 % azida sódica 1 x 2 mL R6 Conjugate Conjugado (listo para usar) : - Anticuerpo monoclonal antimanano con peroxidasa - Conservante: 0,01 % timerosal 1 x 8 mL 44 Componente R7 Serum Treatment Solution R8 TMB Substrate Buffer R9 R10 Contenidos Cantidad Solución de tratamiento del suero (lista para usar) : - Solución ácida EDTA sin conservante Tampón sustrato TMB (listo para usar) : - Solución de ácido cítrico y acetato sódico con pH 5,2 - 0,009 % de peróxido de hidrógeno - 4 % de dimetilsulfóxido (DMSO) 1 x 10,5 mL Chromogen: Solución cromógena de TMB (concentrada) : TMB - Solución al 90 % de dimetilsulfóxido (DMSO) Solution con 0,6 % de tetrametilbencidina (TMB)* Stopping Solution Solución de interrupción (lista para usar) : - Ácido sulfúrico (H2SO4) 1,5 N Plate sealers Tapas para placa : - Láminas adhesivas para microplacas 1 x 60 mL 1 x 1 mL 1 x 12 mL 1 x 4 láminas * Nota: La TMB (tetrametilbencidina) es un cromógeno no carcinógeno y no mutágeno para la peroxidasa 6- ADVERTENCIAS PARA EL USUARIO 1. Para uso diagnóstico in vitro. 2. Para uso profesional exclusivamente. 3. No se recomienda utilizar este kit con muestras que no sean de suero humano. 4. Se ha analizado el material de origen humano utilizado en la preparación de los reactivos y ha resultado negativo en anticuerpos antiVIH-1, antiVIH-2 y antiVHC, así como en antígeno HBs. Sin embargo, dado que ningún método puede garantizar por completo la ausencia de agentes infecciosos, todos los reactivos y muestras de pacientes deberán manipularse como si pudieran transmitir infecciones. Todas las pruebas deberán realizarse tomando las precauciones recomendadas para patógenos de transmisión sanguínea. 5. Utilice ropa protectora y guantes desechables cuando manipule reactivos del kit y muestras de pacientes. Lávese las manos a conciencia después de realizar la prueba. 6. No pipetee con la boca. 7. No fume, beba ni coma en zonas donde se manipulen muestras o reactivos del kit. 8. Evite las salpicaduras de muestras o de soluciones que las contengan. 45 9. Los derrames biológicos que no contengan ácido deberán limpiarse a fondo con un desinfectante eficaz. Pueden usarse desinfectantes como: solución de lejía al 10 % (solución al 0,5 % de hipoclorito sódico), etanol al 70 % o Wescodyne™ al 0,5 % (lista no exhaustiva). Los derrames que contengan ácido deberán limpiarse o neutralizarse con bicarbonato sódico antes de limpiarlos con un desinfectante químico. Los materiales usados para limpiar derrames deberán desecharse como residuos biopeligrosos. ATENCIÓN : No introduzca soluciones con lejía en el autoclave. 10. Deseche todas las muestras y materiales utilizados para realizar la prueba como si tuvieran un agente infeccioso. Deberán cumplirse todos los requisitos vigentes sobre desecho de residuos. 11. Algunos reactivos contienen azida sódica como conservante. La azida sódica puede formar azidas de plomo o cúpricas en las cañerías del laboratorio. Estas azidas son explosivas. Para evitar la acumulación de azidas, aclare abundantemente las cañerías con agua cuando deseche por el desagüe soluciones que contengan azida, previa inactivación de éstas. 12. ATENCIÓN : Ácido sulfúrico (H2SO4) 1,5 N y DMSO (dimetilsulfóxido) al 90 % R36/38: Irrita los ojos y la piel. Xi-irritante S2-26-30: Manténgase fuera del alcance de los niños. En caso de contacto con los ojos, lávense inmediata y abundantemente con agua y acúdase a un médico. No añadir nunca agua a este producto 13. Evite el contacto del tampón sustrato TMB, la solución cromógena de TMB y la solución de interrupción con los ojos, la piel y las mucosas (riesgo de intoxicación, irritación y quemaduras). 14. Ficha de seguridad del material disponible previa petición. 7- PRECAUCIONES PARA EL USUARIO 1. LAS MUESTRAS DE SUERO CONGELADAS QUE HAYAN ESTADO ALMACENADAS EN CONDICIONES DESCONOCIDAS PUEDEN OFRECER RESULTADOS POSITIVOS FALSOS DEBIDO A LA CONTAMINACIÓN CON HONGOS O BACTERIAS. 2. No use el kit ni ninguno de sus reactivos después de la fecha de caducidad indicada. 3. Con la excepción de la solución de lavado concentrada (R2) y de la solución de interrupción (R10), no mezcle reactivos de otros kits que tengan números de lote distintos. 46 4. Antes de usar los reactivos, deje que se ajusten a la temperatura ambiente durante 15 minutos. 5. Mezcle bien mientras reconstituye los reactivos, con cuidado de evitar la contaminación microbiana. 6. No lleve a cabo la prueba en presencia de vapores reactivos (ácidos, álcalis, aldehídos) o polvo, que podrían alterar la actividad enzimática del conjugado. 7. Utilice recipientes de polipropileno limpios y desechables para preparar la solución sustrato cromógena de reacción. Si tuvieran que usarse artículos de vidrio, éstos deberán lavarse primero en ácido clorhídrico 1 N, aclararse con agua destilada y secarse. 8. Para el pipeteado manual de controles y muestras, utilice puntas de pipeta individuales para evitar arrastrar las muestras. 9. Para asegurarse de que los pocillos se han lavado bien, respete el número recomendado de ciclos de lavado y asegúrese de que los pocillos se llenen y vacíen completamente. No deberá hacerse el lavado manualmente con un bote blando. 10. No permita que la microplaca se seque entre el final del ciclo de lavado y la adición de los reactivos. 11. No utilice el mismo envase para las soluciones de conjugado y de sustrato. 12. No permita que la solución de conjugado o la solución sustrato cromógena de reacción entren en contacto con metal o con iones metálicos. 13. Evite la exposición de la solución cromógena de TMB o de la solución sustrato cromógena de reacción a una luz fuerte durante el almacenamiento o la incubación. No permita que las soluciones cromógenas entren en contacto con un agente oxidante. 14. Evite el contacto de la solución de interrupción con todo agente oxidante. No permita que la solución de interrupción entre en contacto con metal o con iones metálicos. 15. Limite la exposición de las soluciones (sueros, solución de tratamiento del suero, conjugado) o de los recipientes abiertos (placas, tubos, pipetas) al aire. 16. No devuelva el conjugado no usado a su recipiente original. 17. La solución sustrato cromógena de reacción debe ser incolora. La aparición del color azul después de la dilución indica que el reactivo está contaminado y no debe usarse. Deséchelo y prepare un reactivo nuevo. 47 8- PREPARACIÓN Y ALMACENAMIENTO DE LOS REACTIVOS Placa de tiras de micropocillos (R1) Una vez abierta la bolsa de la placa, las tiras de micropocillos son estables durante 5 semanas si se almacenan entre +2ºC y +8ºC en su bolsa original cuidadosamente cerrada y con el desecante dentro. Solución de lavado (R2) Prepare la solución de lavado funcional según sea necesario añadiendo una parte de solución de lavado concentrada a 9 partes de agua estéril desionizada o destilada. Prepare una cantidad suficiente de solución de lavado funcional para completar la prueba (80 mL para una tira = 8 mL de R2 + 72 mL de agua destilada). La solución de lavado funcional puede almacenarse entre +2ºC y +8ºC durante 14 días. Una vez abierta, la solución de lavado concentrada es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta si se almacena entre +2ºC y +25ºC y no se produce contaminación. Solución sustrato cromógena de reacción (R8+R9) Prepare la solución sustrato cromógena de reacción añadiendo una parte de solución cromógena de TMB (R9) a 50 partes de tampón sustrato TMB (R8). Prepare 2 mL de solución sustrato cromógena de reacción por tira: 40 µL de R9 + 2 mL de R8. La solución es estable durante 6 horas si se almacena en un lugar oscuro y a temperatura ambiente (entre +18ºC y +25ºC). Una vez abiertos, los reactivos R8 y R9 son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta si se almacenan entre +2ºC y +8ºC y no se produce contaminación. Suero de control negativo (R3), suero calibrador (R4), suero de control positivo (R5), conjugado (R6), solución de tratamiento del suero (R7) y solución de interrupción (R10) Una vez abiertos, los reactivos R3, R4, R5, R6 y R10 son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta si se almacenan entre +2ºC y +8ºC y no se produce contaminación. 9- RECOGIDA DE MUESTRAS Extraiga las muestras de sangre según los procedimientos estándar de laboratorio. La prueba se realiza al suero. Las muestras de suero no deberán estar contaminadas por esporas fúngicas ni bacterias. Transporte y almacene las muestras en tubos sellados y sin contacto con el aire. Las muestras pueden almacenarse entre +2ºC y +8ºC durante 24 horas antes de realizar la prueba. Para un almacenamiento más prolongado, almacene el suero a -70ºC. 48 Las muestras de suero pueden someterse como máximo a 3 ciclos de congelación y descongelación. Las muestras previamente congeladas deben mezclarse bien después de la descongelación y antes de la prueba. Las muestras con 90 g/L de albúmina o 200 mg/L de bilirrubina, las muestras lipémicas con el equivalente de 360 g/L de trioleina (triglicérido) y las muestras hemolizadas con 200 g/L de hemoglobina no afectan a los resultados. No descomplemente los sueros. 10- PROCEDIMIENTO Materiales suministrados Véase el apartado REACTIVOS. Materiales necesarios pero no suministrados 1. Agua estéril destilada o desionizada para diluir la solución de lavado concentrada. 2. Papel absorbente. 3. Guantes desechables. 4. Gafas protectoras. 5. Hipoclorito sódico (lejía) y bicarbonato sódico. 6. Pipetas o multipipetas, ajustables o fijas, para medir y dispensar 50 µL, 100 µL, 300 µL y 1000 µL. 7. Tubos de polipropileno de 1,5 mL para microcentrifugadora con tapones herméticos y capacidad para soportar calentamiento a 120ºC (termobloque) o 100ºC (baño María): • Tubos con tapón de rosca: tubos cónicos de 1,5 mL (ref. Bio-Rad: 224-0010) o equivalentes. O BIEN • Tubos con tapón a presión: microtubos de ensayo EZ de 1,5 mL (ref. Bio-Rad: 223-9480) o equivalentes. • Fiadores de tapón de microtubos: ref. VWR: 6054001 o equivalentes. Estos fiadores sellan de forma segura los tubos con tapón a presión, impidiendo que se abran durante los cambios de temperatura y presión, y permiten sacar fácilmente los tubos del termobloque o del baño María. 8. Centrifugadora de laboratorio para tubos de polipropileno de 1,5 mL capaz de centrifugar a 10 000 g. 49 9. Si se usa un termobloque para el tratamiento de los sueros: • Termobloque. Se recomiendan los siguientes modelos de termobloque: - Modelo de 1 bloque: ref. Grant: QBD1 (ref. VWR: 460-0074) - Modelo de 2 bloques: ref. Grant: QBD2 (ref. VWR: 460-0076) • Bloque para termobloque: ambos termobloques (QBD1 y QBD2) deben usarse con bloques QB-E1 de Grant (ref. VWR: 460-8517) Si se usa el baño María para el tratamiento de los sueros: 10. 11. 12. 13. 14. • Rack de microcentrifugadora redondo y flotante válido para vaso de precipitados de 1 L. • Baño María a 100ºC Agitador vórtex. Incubadora para microplacas a 3 ºC ± 1ºC Lavadora para microplacas semiautomática o automática. Lector de microplacas equipado con filtros de 450 nm y 620 nm. Recipiente para residuos contaminados. Comentarios sobre el procedimiento Para validar los resultados de la prueba, deberán analizarse los controles negativos y positivos y los puntos de rango con cada ejecución. Preparación de los puntos de rango Modo cuantitativo : Para 1 serie Para 6 series (*) R3 Suero de control negativo R4 Suero calibrador con 2 ng/mL R3 Suero de control negativo R4 Suero calibrador con 2 ng/mL Punto de 2 ng/mL - 300 µL - 2000 µL Punto de 1 ng/mL 150 µL 150 µL 1000 µL 1000 µL 225 µL 75 µL 1500 µL 500 µL 262,5 µL 37,5 µL 1750 µL 250 µL Punto de 0,5 ng/mL Punto de 0,25 ng/mL (*) Puede prepararse por adelantado cantidad de reactivo suficiente para 6 series: por cada punto de rango, divida el reactivo en porciones de 300 µL y guárdelo a -20ºC. Antes de usarlos, deje que los reactivos alcancen la temperatura ambiente (entre 18ºC y +25ºC). 50 Modo cualitativo : Prepare los puntos de rango de 0,5 ng/mL (suero calibrador) y 0,25 ng/mL según se indicaba en la tabla anterior. Tratamiento de los sueros Todos los sueros de control: negativo (R3), positivo (R5) y los puntos de rango de 2,0, 1,0, 0,5 y 0,25 ng/mL deben procesarse a la vez que las muestras : 1. Pipetee 300 µL de cada suero, control y punto de rango a tubos distintos de polipropileno de 1,5 mL. 2. Añada 100 µL de solución de tratamiento del suero (R7) a cada tubo. 3. Mezcle bien el contenido de los tubos agitándolos vigorosamente o con un vórtex. Cierre herméticamente el tubo para evitar que se abra durante el calentamiento. No perfore el tapón. 4. Con termobloque : Caliente los tubos durante 6 minutos en un termobloque a 120ºC. Los tubos deben colocarse en el bloque sólo cuando se haya alcanzado la temperatura indicada (*) O BIEN Al baño María: : Si se usa el baño María, caliente los tubos durante 3 minutos a 100ºC. Los tubos deben ponerse al baño María sólo cuando se haya alcanzado la temperatura indicada (*) 5. Saque con cuidado los tubos calientes del bloque o del baño María y métalos en una centrifugadora. Centrifugue los tubos a 10 000 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se usa para detectar el antígeno manano. 6. Analice los sobrenadantes usando el siguiente procedimiento. Una vez aplicado el tratamiento del suero, deberá realizarse la prueba lo antes posible. Si el análisis de los resultados indica que es necesario volver a realizar el análisis, deberá tratarse para ello otra porción de suero. (*) Para el éxito de la prueba es fundamental cumplir de manera estricta la temperatura y los tiempos indicados, así como el uso de los materiales recomendados. No confíe en la temperatura mostrada por el aparato: compruebe que la temperatura cumple con las especificaciones. Para ello, use un termómetro calibrado introducido en un tubo con aceite mineral. Dentro del tubo se alcanzará una temperatura de 120ºC en el termobloque y de 100ºC en el baño María. 51 Nota : - Todas las muestras de suero tratadas siguiendo este procedimiento pueden usarse para realizar la prueba Platelia™ Aspergillus EIA, ya que el procedimiento de tratamiento del suero es idéntico para ambas pruebas. - No guarde los sueros (controles, puntos de rango y muestras) después del tratamiento. Procedimiento de ensayo inmunoenzimático Siga estrictamente el protocolo propuesto. Cumpla las buenas prácticas de laboratorio. 1. Antes de usar los reactivos, deje que se ajusten a la temperatura ambiente (entre +18ºC y +25ºC) durante 15 minutos. 2. Prepare la solución de lavado funcional, la solución sustrato cromógena de reacción, los controles negativo y positivo y los puntos de rango. 3. Prepare un diagrama para la identificación de los sueros, controles y puntos de rango en la microplaca. Modo cuantitativo : Los sueros de control y los puntos de rango (0,25, 0,50, 1,0 y 2,0 ng/mL) pueden colocarse según este plan : • A1: suero de control negativo (R3) • B1: punto de rango de 0,25 ng/mL • C1: punto de rango de 0,50 ng/mL • D1: punto de rango de 1,0 ng/mL • E1: punto de rango de 2,0 ng/mL (R4) • F1: suero de control positivo (R5) • G1: suero de control positivo (R5) Modo cualitativo : Los sueros de control y los puntos de rango de 0,50 y 0,25 ng/mL pueden colocarse según este plan : • A1: suero de control negativo (R3) • B1: punto de rango de 0,25 ng/mL • C1: punto de rango de 0,5 ng/mL (suero calibrador) • D1: punto de rango de 0,5 ng/mL (suero calibrador) • E1: suero de control positivo (R5) 4. Saque el soporte de placas y las tiras de micropocillos (R1) de la bolsa de la placa. Vuelva a meter las tiras que no vayan a usarse en la bolsa con el desecante y cierre la bolsa. 5. Mezcle el contenido del frasco de conjugado (R6) poniéndolo boca abajo antes de usarlo. Añada 50 µL de conjugado a cada pocillo. 52 A continuación, añada 50 µL de sobrenadante de suero tratado a cada pocillo, de la forma indicada anteriormente. No añada las muestras de suero a los pocillos antes que el conjugado. 6. Cubra la placa con una tapa para placas (o de alguna otra forma que impida la evaporación) asegurándose de que toda la superficie quede cubierta y hermética. 7. Incube la microplaca en una incubadora para microplacas en seco durante 90 ± 5 minutos a 37ºC (±1ºC). 8. Quite la tapa para placas. Aspire el contenido de todos los pocillos a un contenedor para residuos que contenga hipoclorito sódico. Lave la placa 5 veces usando al menos 370 µL de solución de lavado funcional. Después del último lavado, ponga la microplaca boca abajo y golpéela suavemente sobre papel absorbente para eliminar el líquido restante. 9. Añada rápidamente 200 µL de solución sustrato cromógena de reacción (R8+R9) a cada pocillo, evitando la exposición a la luz fuerte. 10. Incube la microplaca en la oscuridad durante 30 ± 5 minutos a temperatura ambiente (entre +18ºC y +30ºC). No utilice película adhesiva durante esta fase de incubación. 11. Añada 100 µL de solución de interrupción (R10) a cada pocillo, siguiendo el mismo orden que cuando añadió la solución sustrato cromógena de reacción. Mezcle bien. 12. Seque completamente la base de cada placa. 13. Lea la densidad óptica de cada pocillo a 450 nm (filtro de referencia de 620/630 nm). Las microplacas deberán leerse en un plazo de 30 minutos después de añadir la solución de interrupción. 11- CONTROL DE CALIDAD (CRITERIOS DE VALIDEZ) Modo cuantitativo Use los sueros de control y los puntos de rango en cada microplaca y en cada prueba. Deberán cumplirse los siguientes criterios para validar el procedimiento de la prueba: • Valor de densidad óptica: 0,300 < DO del punto de rango de 0,5 ng/mL < 1,100 • Relaciones: DO (punto de rango de 2,0 ng/mL) / DO (punto de rango de 0,5 ng/mL) > 2,1 DO (punto de rango de 1,0 ng/mL) / DO (punto de rango de 0,5 ng/mL) > 1,25 DO (punto de rango de 0,25 ng/mL) / DO (punto de rango de 0,5 ng/mL) < 0,85 DO (R3) / DO (punto de rango de 0,25 ng/mL) ≤ 0,80 53 • Concentración de manano : Concentración de R5 igual a la concentración indicada en el vial ± 20%. Modo cualitativo • Cálculo de los valores de corte (CO) Sume los valores de DO obtenidos en cada pocillo con el punto de rango de 0,5 ng/mL y divida entre 2. • Criterios de validez 0,300 < CO < 1,100 DO R5 > CO DO R3 < 0,7 CO DO del punto de rango de 0,25 ng/mL < 0,85 CO 12- INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS MODO CUANTITATIVO Establecimiento de la curva estándar La curva estándar se representa con 4 puntos de rango (2,0, 1,0, 0,5 y 0,25 ng/mL) preparados a partir del suero calibrador R4. Los controles positivo (R5) y negativo (R3) no se incluyen en la curva. Para lograr mayor precisión, trace una curva sigmoidea con extrapolación representando la concentración de manano en ng/mL en el eje x (escala logarítmica) y la densidad óptica en el eje y (escala lineal). Si el lector de placas no permite este tipo de representación, trace una curva que conecte los distintos puntos de rango. Determinación de la concentración de manano en los sueros analizados Puede usarse la curva de calibración para determinar la concentración de antígeno manano (en ng/mL) para cada muestra analizada. Interpretación de los resultados • Los sueros con una concentración de manano inferior a 0,25 ng/mL (C < 0,25) se consideran “negativos” en presencia de antígeno manano. • Los sueros con una concentración de manano entre 0,25 y 0,5 ng/mL (0,25 ≤ C < 0,5) se consideran “intermedios” en presencia de antígeno manano. • Los sueros con una concentración de manano igual o superior a 0,5 ng/mL (C ≥ 0,5) se consideran “positivos” en presencia de antígeno manano. 54 • Los puntos de rango usados para trazar la curva de calibración no permiten determinar de forma precisa las concentraciones superiores a 2,5 ng/mL. La prueba deberá repetirse después de diluir el suero a 1/5 en suero negativo (R3) para obtener una determinación más precisa de la concentración de los sueros fuertemente positivos. Nota : Platelia™ Cándida Ag está pensado para ser usado como ayuda en el diagnóstico de la candidiasis invasiva. Los resultados positivos obtenidos con Platelia™ Cándida Ag deberán tomarse en consideración junto a otros procedimientos diagnósticos, tales como cultivos microbiológicos, examen histológico de muestras para biopsia y pruebas radiográficas. Se recomienda realizar pruebas diagnósticas regulares a pacientes de alto riesgo para aumentar la sensibilidad y la positividad temprana de la prueba. MODO CUALITATIVO Interpretación de los resultados Interpretación de los resultados • DO de la muestra < DO del punto de rango de 0,25 ng/mL: los sueros se consideran “negativos” en presencia de antígeno manano. • DO del punto de rango de 0,25 ng/mL ≤ DO de la muestra < CO: los sueros se consideran “intermedios” en presencia de antígeno manano. • DO de la muestra ≥ CO: los sueros se consideran “positivos” en presencia de antígeno manano. Nota : Platelia™ Cándida Ag está pensado para ser usado como ayuda en el diagnóstico de la candidiasis invasiva. Los resultados positivos obtenidos con Platelia™ Cándida Ag deberán tomarse en consideración junto a otros procedimientos diagnósticos, tales como cultivos microbiológicos, examen histológico de muestras para biopsia y pruebas radiográficas. Se recomienda realizar pruebas diagnósticas regulares a pacientes de alto riesgo para aumentar la sensibilidad y la positividad temprana de la prueba. Nota : Es posible calcular un índice (I) para determinar la intensidad de los resultados positivos: I= DO del suero positivo / CO Este índice permite expresar los resultados en modo semicuantitativo. 55 13- LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO 1. Una prueba negativa no descarta el diagnóstico de candidiasis invasiva dada la bajísima concentración y la rápida eliminación del manano durante la infección. 2. Una prueba negativa en antígeno manano deberá interpretarse también junto con los resultados de pruebas de detección de anticuerpos antimanano: incluso en el caso de la candidiasis invasiva, es más difícil detectar el antígeno en pacientes que han dado positivo en anticuerpos antimanano (véase el apartado 14, “Características específicas de rendimiento”). 3. El rendimiento en la detección del antígeno manano en suero está relacionado con la frecuencia de las pruebas realizadas al paciente 4. Se recomienda realizar un seguimiento de los pacientes de alto riesgo y pruebas diagnósticas de anticuerpos antimanano para aumentar la sensibilidad y la positividad temprana de la prueba. 4. Deben seguirse el procedimiento de Platelia ™ Cándida Ag y su interpretación de resultados cuando se analice la presencia de antígeno manano en muestras. Se recomienda al usuario del kit que lea el prospecto atentamente antes de realizar la prueba. En especial, deberá seguirse el procedimiento de la prueba atentamente en lo referente al pipeteado de muestras y reactivos, el lavado de placas y los tiempos de las fases de incubación. 5. De no añadirse las muestras o reactivos según se especifica en el procedimiento podría obtenerse un resultado negativo falso. Deberían considerarse la posibilidad de repetir las pruebas con muestras adicionales cuando exista sospecha clínica de candidiasis invasiva o de un error de procedimiento. 6. Es posible que los pocillos con muestras de pacientes negativas se contaminen con pocillos con muestras de pacientes positivas si el contenido de un pocillo pasa a otro debido a una manipulación brusca de la microplaca o a una mala técnica de pipeteado al añadir los reactivos. 7. Se ha informado de una reacción cruzada en pacientes que han recibido una transfusión de ciertos lotes de expansores del plasma con hidroxietil almidón (como Hesteril 6 %), usados en el tratamiento de insuficiencia circulatoria: hipovolemia, shock hemorrágico, shock séptico. 56 14- CARACTERÍSTICAS ESPECÍFICAS DE RENDIMIENTO 14.1 MODO CUANTITATIVO A) Estudios de reproducibilidad • Variabilidad intraensayo : Se analizaron cuatro sueros (uno negativo, uno intermedio a 0,48 ng/mL y dos sueros positivos con concentraciones de 0,69 ng/mL y 1,39 ng/mL) en 30 repeticiones. Los coeficientes de variación fueron del 3,1%, 6,9%, 9,1% y 7,0%, respectivamente. • Variabilidad interensayo : Se analizaron ocho sueros negativos y cuatro sueros positivos en cinco series realizadas en un periodo de cinco semanas. Los coeficientes de variación fueron inferiores al 20 % para las concentraciones de sueros positivos e inferiores al 13 % para la DO de los sueros negativos. B) Pruebas clínicas ESPECIFICIDAD Los resultados de especificidad se resumen en la siguiente tabla : Concentración (ng/mL) C < 0,25 0,25 ≤ C < 0,5 No hospitalizado Número de pacientes (nº de sueros) 184 (184) 183 (99,5%) 1 (0,5%) Hospitalizado, no colonizado, con : 151 (200) 140 (92,8%) 7 (4,6%) Categoría de paciente C ≥ 0,5 4 (2,6%) - enfermedad de Crohn 52 (52) 49 (98,1%) 3 (1,9%) - colitis ulcerosa 43 (43) 41 (95,4%) 1 (2,3%) 1 (2,3%) - aspergilosis 26 (35) 23 (88,5%) 1 (3,8%) 2 (7,7%) - neumocistosis 4 (4) 4 (100%) - criptococosis 13 (13) 12 (92,3%) Hospitalizado, colonizado por Candida 41 (160) 35 (85,3%) 1 (7,7%) 4 (9,8%) 2 (4,9%) 57 SENSIBILIDAD Se realizaron pruebas clínicas en tres hospitales universitarios de Francia para evaluar la sensibilidad de Platelia™ Cándida Ag. El estudio se realizó de manera retrospectiva usando un total de 366 muestras de suero extraídas a 106 pacientes de distintas unidades del hospital: quirófano, hematología, cuidados intensivos, quemados... Se aislaron levaduras de Cándida de cultivos de sangre o muestras profundas de estos pacientes 8, 9. En esta población de pacientes, la sensibilidad general de Platelia™ Cándida Ag fue del 51,5 % (excepto en el 6,6 % de los pacientes, cuyos sueros tenían una concentración de antígeno manano entre 0,25 y 0,5 ng/mL y se consideran intermedios en presencia de antígeno manano) : Sensibilidad Número de pacientes (nº de sueros) C ≥ 0,5 C ≥ 0,5 y 0,25 ≤ C < 0,5 C. tropicalis 10 (72) 70,0 % 70,0 % C. glabrata 12 (31) 58,3 % 58,3 % C. albicans 64 (208) 52,5 % 60,3 % 2 (5) 50,0 % 50,0 % C. parapsilosis 10 (29) 37,5 % 57,5 % C. krusei 8 (21) 20,0 % 20,0 % Especie de Cándida aislada C. kefyr La sensibilidad depende del número y la frecuencia de las muestras 13. Estos estudios clínicos demostraron también la utilidad de combinar la detección del antígeno manano con Platelia ™ Cándida Ag y de los anticuerpos antimanano con Platelia™ Cándida Ab/Ac/Ak. Los pacientes pueden clasificarse en 2 poblaciones considerablemente distintas entre sí (prueba de chi cuadrado, p < 0,0005), como indican los resultados de la siguiente tabla : • Pacientes negativos en anticuerpos antimanano: la sensibilidad de Platelia ™ Cándida Ag es del 78,8 % en casos de infección por C. albicans y del 66,6 % en casos de infección por varias especies de Cándida. • Pacientes positivos en anticuerpos antimanano: es más difícil detectar el antígeno manano. 58 Sensibilidad de Platelia™ Candida Ag Especie infecciosa (nº de pacientes) Pacientes negativos en anticuerpos antimanano Pacientes positivos en anticuerpos antimanano Todos los pacientes Varias especies de Cándida (106) 66,6 % 17,5 % 51,5 % C. albicans (64) 78,8 % 16,1 % 52,5 % La interpretación de las pruebas realizadas con Platelia™ Cándida Ag debe por tanto incluir información sobre la situación inmune del paciente respecto al manano de la Cándida. La detección serológica combinada del antígeno manano y de los anticuerpos antimanano demuestra una sensibilidad del 84,8 % (exceptuando el 6,6 % de los pacientes con una concentración intermedia de antígeno manano). Sin embargo, algunos pacientes muestran una respuesta positiva a ambos marcadores en distintos momentos durante el mismo episodio o infección. La prognosis de la infección puede estar relacionada con el equilibrio entre mananemia y la respuesta del anticuerpo antimanano 13. 14.2 MODO CUALITATIVO A) Estudios de reproducibilidad • Variabilidad intraensayo : Se analizaron cuatro sueros (uno negativo, uno intermedio índice = 0,95 y dos sueros positivos índice = 1,24 y 2,00) en 30 repeticiones. Los coeficientes de variación porcentuales (%CV) fueron de 3,1 %, 7,2 %, 5,9 % y 5,9 %. • Variabilidad interensayo : Se analizaron diez sueros positivos y cuatro sueros intermedios en seis series. Los coeficientes de variación porcentuales (%CV) fueron < 15 % para las concentraciones de sueros positivos e intermedios. B) Pruebas clínicas ESPECIFICIDAD - SENSIBILIDAD Teniendo en cuenta que en el modo cuantitativo las concentraciones iguales o superiores a 0,5 ng/mL corresponden a los sueros positivos y las inferiores a 0,25 ng/mL corresponden a los sueros negativos, las características de rendimiento de la prueba en modo cualitativo son equivalentes a las descritas en el apartado “Modo cuantitativo”. 59 15- CONTROL DE CALIDAD DEL FABRICANTE Todos los reactivos que fabricamos se preparan siguiendo nuestro sistema de calidad, que comienza en el momento de la recepción de la materia prima y va hasta la comercialización final del producto. Cada lote es sometido a un control de calidad y únicamente sale al mercado si cumple con los criterios de aceptación. En nuestra compañía se mantienen los registros relacionados con la producción y control de todos y cada uno de los lotes. 60 16- BIBLIOGRAPHY 1. FAILLE, C., D. W. MACKENZIE, J. C. MICHALSKI, and D. POULAIN. 1992. Evaluation of an enzyme immunoassay using neoglycolipids constructed from Candida albicans oligomannosides to define the specificity of anti- mannan antibodies. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 11: p. 438-46. 2. FRIDKIN, S. K. and W. R. JARVIS. 1996. Epidemiology of nosocomial fungal infections. Clin. Microbiol. Rev. 9: p. 499-511. 3. FUKAZAWA, Y. 1989. Antigenic structure of Candida albicans. Immunochemical basis of the serologic specificity of the mannans in yeasts. Immunol. Ser. 47: p. 37-62. 4. HERENT, P., D. STYNEN, F. HERNANDO, J. FRUIT, and D. POULAIN. 1992. Retrospective evaluation of two latex agglutination tests for detection of circulating antigens during invasive candidosis. J. Clin. Microbiol. 30: p. 2158-64. 5. JACQUINOT, P. M., Y. PLANCKE, B. SENDID, G. STRECKER, and D. POULAIN. 1998. Nature of Candida albicans-derived carbohydrate antigen recognized by a monoclonal antibody in patient sera and distribution over Candida species. FEMS Microbiol. Lett. 169: p. 131-8. 6. PONTON, J., M. MORAGUES, and G. QUINDOS. 2002. Non-CultureBased Diagnostics, p. 395-425. In R. Calderone (ed.), Candida and Candidiasis. ASM Press, Washington, D.C. 7. RUHNKE, M. and G. MASCHMEYER. 2002. Management of mycoses in patients with hematologic disease and cancer - review of the literature. Eur. J. Med. Res. 7: p. 227-235. 8. SENDID, B., J. L. POIROT, M. TABOURET, A. BONNIN, D. CAILLOT, D. CAMUS, and D. POULAIN. 2002. Combined detection of mannanaemia and antimannan antibodies as a strategy for the diagnosis of systemic infection caused by pathogenic Candida species. J. Med. Microbiol. 51: p. 433-442. 9. SENDID, B., M. TABOURET, J. L. POIROT, D. MATHIEU, J. FRUIT, and D. POULAIN. 1999. New enzyme immunoassays for sensitive detection of circulating Candida albicans mannan and antimannan antibodies: useful combined test for diagnosis of systemic candidiasis. J. Clin. Microbiol. 37: p. 1510-1517. 19 10. TIRABOSCHI, I. N., J. E. BENNETT, C. A. KAUFFMAN, J. H. REX, C. GIRMENIA, J. D. SOBEL, and F. MENICHETTI. 2000. Deep Candida infections in the neutropenic and non-neutropenic host: an ISHAM symposium. Med. Mycol. 38 Suppl 1: p. 199-204. 11. TRINEL, P. A., C. FAILLE, P. M. JACQUINOT, J. C. CAILLIEZ, and D. POULAIN. 1992. Mapping of Candida albicans oligomannosidic epitopes by using monoclonal antibodies. Infect. Immun. 60: p. 384551. 12. VERWEIJ, P. E., D. POULAIN, T. OBAYASHI, T. F. PATTERSON, D. W. DENNING, and J. PONTON. 1998. Current trends in the detection of antigenaemia, metabolites and cell wall markers for the diagnosis and therapeutic monitoring of fungal infections. Med. Mycol. 36 Suppl 1: p. 146-155. 13. YERA, H., B. SENDID, N. FRANCOIS, D. CAMUS, and D. POULAIN. 2001. Contribution of serological tests and blood culture to the early diagnosis of systemic candidiasis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 20: p. 864-870. 20 102 103 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax.: +33 (0) 1 47 41 91 33 03/2008 code: 880018