1314456007.Trabajo practico 1

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FITOQUIMICA
TP N 1: CÉLULA VEGETAL
INTRODUCCIÓN
Las células vegetales presentan una pared celular celulósica, rígida que evita
cambios de forma y posición que las diferencian de las células animales; contienen
plastidios, estructuras que sintetizan y almacenan alimentos siendo los más comunes los
cloroplastos y casi todas las células vegetales poseen vacuolas, que tienen la función de
transportar y almacenar nutrientes, agua y productos de desecho.
La célula vegetal típica presenta, por fuera de la membrana plasmática, la pared
celular, compuesta fundamentalmente por celulosa (polímero compuesto por moléculas de
glucosa). Las moléculas de celulosa se unen en fibrillas, que constituyen el bastidor
estructural de la pared. Muchas células vegetales forman una pared celular primaria
mientras crece la célula, y otra secundaria formada en el interior de la primaria al final del
crecimiento. Ambas paredes, primaria y secundaria son atravesadas por las vías de
transporte de sustancia llamadas plasmodesmos. La pared celular encierra el contenido vivo
de la célula, llamado protoplasto.
Con el paso del tiempo esta pared puede sufrir una serie de cambios producto del
metabolismo y el envejecimiento, manifestándose con deposiciones de diversas sustancias
tales como lignina, grasas (suberina, cutina, ceras), taninos, etc., que pueden ser
reconocidas mediante pruebas químicas. La pared celular delimita a la célula vegetal,
determina su forma y confina al protoplasto. Este está formado por citoplasma, que a su vez
contiene orgánulos, vacuolas y núcleo.
Otra característica típica de la célula vegetal es la presencia de plastidios, los cuales
pueden ser pigmentados (cloroplastos y cromoplastos) o no pigmentados (leucoplastos). La
clorofila es el pigmento fundamental de los cloroplastos, mientras que los carotenos dan la
coloración rojiza o anarajada de los cromoplastos; dentro de los plastidios no pigmentados
se encuentran los elaioplastos, que almacenan grasas (lípidos) y los amiloplastos, que
almacenan almidón; éstos últimos pueden tener formas diversas e incluso pueden tener
valor taxonómico. También las paredes celulares estas compuestas por ligninas, que
aumentan la rigidez, y las ceras que reducen la pérdida de agua.
Las vacuolas, son muy importantes en la célula vegetal; su contenido acuoso se
denomina jugo celular, y es variable de una célula a otra. El jugo vacuolar puede contener
ácidos orgánicos tales como oxálico, málico, cítrico, algunas veces en forma de sales de
diversos tipos. El oxalato de calcio puede precipitar en forma de estrellas (drusas) o en forma
de agujas (rafidios) que constituyen sustancias ergásticas. Las vacuolas pueden contener
también taninos, mucílagos, proteínas, aceites, pigmentos (antocianinas), etc., estos materiales
pueden ser sustancias de reserva o residuos metabólicos.
En el caso de las plantas, la remoción de la pared celular es el primer paso, y crucial,
requerido antes de la introducción del ADN directamente a través de la membrana
plasmática. Los biólogos moleculares producen protoplastos cuando preparan para la
transformación a diversos tipos vegetales. A continuación de la producción de protoplastos,
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la membrana celular puede hacerse permeable al ADN usando electroporación (mediante
un campo eléctrico) o polietilenglicol. Los protoplastos fueron asimismo empleados (con
un éxito mucho más limitado) para hacer fusión de protoplastos, en la cual los protoplastos
de distintas especies vegetales son tratadas de tal manera que ambas se fusionan, resultando
en células híbridas de especies cruzadas.
OBJETIVOS:
 Obtener protoplastos a partir de diferentes órganos de diversas especies vegetales
mediante degradación enzimática de los distintos componentes de la pared celular.
 Evaluar el rendimiento de protoplastos viables.
 Distinguir diferentes tipos de paredes celulares mediante técnicas histoquímicas.
 Observar plastidos y sustancias ergásticas de muestras vegetales.
PROCEDIMIENTO
A. Preparar 100 ml de una solución 0,5 M de sorbitol (solución isotónica). Llevar a pH
de 6-7 con gotas de NaOH 0,1 N.
B. Pesar 0,1 g de pectinasa (Macerozyme R-10 de Rizopus sp, Yakult, 400-800 U/g1) y
0,2 g de celulasa (Celulasa “Onozuka” RS, de Trichoderma viride, 2 U/mg)2.
Colocar ambas enzimas en el mismo recipiente.
C. Agregar 10 ml de la solución de sorbitol 0,5 M, pH 6-7 a la mezcla enzimática
inmediatamente antes de usar ya que las enzimas son inestables y pierden actividad
con la temperatura y el tiempo. Concentraciones finales de enzima: pectinasa 1% y
celulasa 2%.
D. Proseguir la técnica de acuerdo al Protocolo para la obtención de protoplastos que se
detalla a continuación:
1) Lavarse las manos. Tomar el material vegetal (una o dos hojas, o bien láminas de
raíces o tubérculos) de las especies de partida y enjuagarlas abundantemente con
agua corriente y luego secarlas. Raspar ligeramente la cara abaxial de las hojas con
aguja, bisturí u hoja de afeitar. Cortar las hojas o láminas en cuadrados de
aproximadamente 1 cm de lado y ubicarlos en la tapa de una caja de Petri en
cantidad suficiente para cubrirla.
2) Agregar 10 ml de la solución enzimática recientemente preparada en la caja de Petri
y con la ayuda de pinzas, poner a flotar los fragmentos de la muestra en la superficie
de la solución enzimática. En el caso de las hojas, ubicar la epidermis abaxial
Unidades definidas como: una unidad libera 1.0 mol de ácido galacturónico a partir de ácido
poligalacturónico por min a pH4.0 a 25ºC.
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Unidades definidas como: una unidad libera 1.0 mol de glucosa a partidr de carboximetilcelulosa sódica
por min a 40ºC, pH 4.5.
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(inferior) en contacto con la solución digestiva. Los pedacitos del tejido vegetal
pueden superponerse un poco.
3) Sellar la caja de Petri con parafilm o cinta y llevarla a estufa (37 ºC) mantener con
agitación suave durante 30 minutos.
4) Preparar una muestra control con el material vegetal y 10 ml de sorbitol 0,5 M sin
las enzimas.
5) Realizar observaciones microscópicas de las muestras con y sin digestión
enzimática: tomar un pequeño volumen de la suspensión de la caja de Petri y
colocarla entre porta y cubreobjetos y buscar protoplastos en todos los campos
microscópicos.
6) Para limpiar los protoplastos de restos celulares y de otras impurezas, una vez
obtenidos filtrar el preparado por gasa y centrifugar a baja velocidad (500 – 1000
rpm). Descartar el sobrenadante y resuspender los protoplastos en 2 ml de sorbitol
0,5 M (sin enzimas). Repetir el lavado 2 veces y resuspender finalmente en 1 ml de
la solución isotónica.
E. Evaluar el rendimiento de protoplastos viables. A un pequeño volumen de la
suspensión agregar gotas de solución acuosa de Rojo Neutro 0,1 %. El rojo neutro
es útil para coloraciones vitales ya que es captado por las células (específicamente
por los lisosomas y endosomas) y solo las células viables son capaces de retener el
colorante. Luego de algunos minutos realizar un recuento de células viables y noviables en cámara cuentaglóbulos y calcular el porcentaje.
F. Realizar cortes a mano alzada del material en estudio y realizar una coloración
diferencial para observar paredes celulares celulósicas y lignificadas con la
coloración doble Safranina-Verde Rápido de la siguiente manera:
1) Tratar los cortes con hipoclorito de sodio al 50 % durante algunos minutos hasta
clarificar y luego lavar 5-6 veces con agua destilada.
2) Pasar los cortes a alcohol 70 %.
3) Colorear con Safranina a saturación en alcohol 80 % durante 10 minutos.
4) Realizar un pasaje rápido por alcohol 96°.
5) Colorear con Verde Rápido a saturación en alcohol 100° (2 cambios).
6) Observar al microscopio las células que presentan distintos tipos de pared celular,
drusas, rafidios, gránulos de almidón, cloroplastos, etc.