crecimiento diaúxico

MICROBIOLOGIA
GENERAL
TRABAJO PRACTICO Nº 2
CRECIMIENTO MICROBIANO
CURVA DE CRECIMIENTO
Bibliografía
Capítulos 5 y 6
Objetivos
Analizar el crecimiento bacteriano en distintas condiciones de
cultivo y utilizando distintas técnicas de uso frecuente en el
laboratorio de microbiología.
¾Analizar el crecimiento bacteriano midiendo la densidad
óptica y mediante el recuento de colonias a distintos tiempos
de incubación.
¾Graficar los datos experimentales a fin de obtener la curva
de crecimiento para cada cultivo.
¾Curva de crecimiento diaúxica.
¾Correlacionar temporalmente el crecimiento diaúxico con
los eventos que ocurren a nivel molecular en la regulación del
operón lac.
Crecimiento microbiano
Temperatura
Oxígeno
pH
Osm.
Aw
Presión
Radiación
-Macro y micro
nutrientes
Condiciones
Ambientales
Prod. de E
Nutrientes
-Aportados por el
medio de cultivo
Síntesis
macromolé
macromoléculas
Crecimiento
celular
Divisió
División celular
Crecimiento de la población
Curva de crecimiento
Las cuatro fases de la curva
de crecimiento
Fase de crecimiento
exponencial
Parámetros matemáticos para
evaluar el crecimiento microbiano
Tasa de crecimiento (k):
Tiempo de generación (g):
Ejemplo:
Cultivo bacteriano que pasa de 1 x 103 a 1 x 109 en 10 horas.
Calcular k y g.
Medición del
crecimiento microbiano
Diauxie (crecimiento diaúxico)
• Patrón de crecimiento microbiano bifásico que tiene lugar
cuando hay presentes dos sustratos diferentes que
pueden ser utilizados como fuente de carbono (por
ejemplo, glucosa y lactosa).
• Este tipo de crecimiento microbiano es debido a la
utilización secuencial de las distintas fuentes de carbono.
• El metabolismo del microorganismo es selectivo para uno
de los sustratos: primero utiliza el sustrato que permite un
crecimiento más rápido y cuando este se agota comienza
a metabolizar el otro.
Curva de crecimiento diaúxica
glucosa + lactosa: primero utiliza la glucosa y luego
lactosa; notar la fase lag interna o intermedia.
Jacques Lucien Monod (February 9, 1910 – May 31,
1976).
J. L. Monod acuñó el término francés “diauxie” en el año
1941 para describir el crecimiento de Escherichia coli y
Bacillus subtilis en un medio definido conteniendo una
mezcla de distintos azúcares.
Posteriormente, basándose en el modelo de crecimiento
diaúxico de E. coli propuso el modelo de regulación de
expresión del operón lac.
Recibió el premio Nobel de
Fisiología o Medicina en 1965
(compartido con François
Jacob y Andre Lwoff).
Transcripción: “the players”
-RNA polimerasa
-Promotor
-Proteínas reguladoras--reguladores positivos y negativos
-Secuencia Shine-Dalgarno sobre el transcripto (traducción)
Inducción / inhibición
• Aumento/reducción de la expresión génica como
consecuencia de un cambio en el ambiente (por
ejemplo; nutrientes en el medio, temperatura,
osmolaridad, fase de crecimiento).
– Sustrato-----> expresión de las proteínas requeridas para
el metabolismo (por ejemplo, lactosa).
– Concentración de un metabolito esencial (por ejemplo.
Fe+3; aminoácidos) regula la expresión de las proteínas
necesarias para incorporarlos o sintetizarlos. Reducción
o inhibición de la expresión cuando la concentración es
alta e inducción cuando es baja.
– Expresión de factores de virulencia inducida por
contacto con el hospedador.
Regulación coordinada
• La expresión de varios genes puede ser controlada
en forma simultánea.
• Operón: dos o más genes que se transcriben a partir
del mismo promotor y cuya expresión es controlada por
las mismas proteínas reguladoras.
• Regulón: set de genes (y/o operónes) que se
transcriben a partir de distintos promotores, pero su
expresión es controlada por las mismas proteínas
reguladoras.
Gen, operón, regulón…...
Operón:
lac, trp
Regulón:
fur
Ejemplo: operón lac
Regulación transcripcional
Genes: metabolismo lactosa
Operador: sitio donde se une la proteína reguladora, en este caso
el producto del gen lacI; generalmente se superpone con el promotor
impidiendo de esta manera la unión de la ARN polimerasa.
Ejemplo: operón lac
Elementos regulatorios
• Proteínas de control negativo
(inhibidores): reducción de la
transcripción.
• Proteínas de control positivo
(activadores): inducción de la
transcripción.
Elementos regulatorios
• Dos proteínas reguladoras alostéricas
regulan la expresión del operón lac:
LacI ------ alolactosa: regulador negativo
CRP ------ AMPc: regulador positivo
Control negativo
Control Negativo: la unión de la proteína inhibitoria LacI asegura la
inhibición de la expresión del operón lac cuando no hay lactosa
disponible.
-La unión de LacI al operador (O) bloquea la unión de la ARN polimerasa
al promotor (P) inhibiendo la transcripción del operón lac.
-La proteína LacI (codificada por el gen lacI) tiene 4 subunidades
idénticas. La unión a LacI al efector alostérico alolactosa (derivada de la
lactosa) disminuye la afinidad de unión de LacI al operador (O).
-LacI se une al sitio O cuando no hay lactosa presente (y, por lo tanto,
tampoco alolactosa). Resultado, no hay transcripción del operón lac.
-Cuando hay lactosa disponible, la alolactosa se une a LacI produciendo
un cambio conformacional de la proteína regulatoria y esta ya no se une
al sitio operador. Resultado, se transcribe el operón lac.
alolactosa
galactosa-(β1-4)-glucosa
galactosa-(β1-6)-glucosa
La lactosa, una vez en el citoplasma bacteriano, es
transformada en alolactosa por la β-galactosidasa.
Control positivo
Control positivo: asegura que la transcripción del operón lac
se mantenga en un nivel muy bajo (basal) cuando hay
glucosa disponible.
•
La proteína reguladora, CRP (Catabolite Regulatory Protein; or the
Catabolite Activator Protein or CAP) es un regulador global que
afecta la expresión de varios promotores. Su unión depende de la
concentración del efector, AMPc.
•
La concentración de AMPc es baja cuando hay glucosa disponible
(el transporte de glucosa inhibe la enzima adenilato ciclasa, PTS
transport system), y alta cuando no hay glucosa.
•
La unión del complejo proteína CRP:AMPc facilita la unión de la
ARN polimerasa y la iniciación de la transcripción de varios
operónes, incluido el operón lac, que codifican para las proteínas
necesarias para el metabolismo de distintos azúcares.
Sistema de fosfotransferencia dependiente de fosfoenolpiruvato (PTS)
-El transporte de glucosa modula la concentración interna de AMPc.
-El complejo CRP:AMPc activa la expresión del operón lac (y otros).
-Azúcares incluídos: glucosa, fructosa, manosa, galactitol, manitol, sorbitol,
xilitol y N-acetilglucosamina.
El operón lac y sus elementos de control
Resumiendo