Aspectos técnicos para establecer el límite de la detección mediante amplificación por PCR Martha Graciela Rocha Munive Centro Nacional de Investigación y capacitación ambiental Instituto Nacional de Ecología Necesidad de un muestreo específicamente diseñado para detectar OGMs Protocolos existentes: USDA: “Sampling and testing recommendations for the detection of Cry9c protein in hybrid seed corn” Normas internacionales como ISO542 o ISO6644 Normas del ISTA (International Seed Testing Association) Los anteriores asumen homogeneidad de las muestras. “Kernel lot distribution assessment (KeLDA)” Fases en la detección Toma de muestras en el campo Manejo de la muestra Homogeneización Toma de submuestra* Extracción de ADN Toma de submuestra * DETECCIÓN Amplificación por PCR LABORATORIO *Estas deben ser representativas de todo el lote “Polymerase Chain Reaction” o PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) Es una técnica que permite obtener fragmentos de ADN in vitro, a partir de un molde o patrón conocido (en este caso una secuencia insertada en un OGM) Monitoreo y detección de OGMs Posibles errores en las diferentes fases del muestreo Tamaños de muestra pequeños Falta de homogeneización de la muestra Extracción Sub-muestra analítica Homogeneización de la muestra Si se analizan granos para poder analizar al mismo tiempo el mayor número de individuos posibles, estos deben molerse y homogeneizarse. Harina Homogeneización de la muestra, toma de la submuestra Harina 1 g contiene 73,000 partículas Realizar extracción de ADN por duplicado Usando la aproximación normal a la distribución binomial, se pueden asignar probabilidades de acuerdo al número de partículas que se tienen Ejemplo: Si el contenido de OGM del campo es del 0.01%, la probabilidad de que 2g contengan 0.01% ± 0.005, es de p=0.943 Para 200mg, p=0.4543 Para 100mg, p=0.3308 Fase de sub-muestreo de ADN para la reacción de PCR Reacción PCR PCR ADN molde iniciador Taq polimerasa dNTP MgCl2 Una reacción típica de PCR emplea 100ng de ADN, que corresponden a 37,000 copias del genoma del maíz •Si la concentración es 0.1% (1/1000), hay 37 copias de genoma GM •Si la concentración es 0.01% (1/10000), hay 3.7 copias de genoma GM Importancia del número de copias del genoma!!! Criterios para la evaluación de métodos Precisión Exactitud Congruencia – repetibilidad : independiente del método intra - laboratorio inter - laboratorio Sensibilidad Límite de detección (LOD) Límite de cuantificación (LOQ) Especificidad Aplicabilidad Matriz Concentraciones Sensibilidad El número de moléculas que se requieren para que el método detecte al analito Se espera que las pruebas de detección de OGMs sean altamente sensibles Límite de detección La concentración mínima a la cual se puede determinar el analito de manera confiable. Generalmente se expresa como la concentración del analito a la cual el método lo puede detectar en un 95% de los casos. Límite de cuantificación Es la mínima cantidad o concentración de analito que se puede cuantificar con precisión y exactitud, de manera reproducible de acuerdo a una validación intra o interlaboratorio. Límites reconocidos Límite de detección— 0.01% Límite de cuantificación—0.1% usando PCR en tiempo real Recientemente se reportan valores de LOD de hasta 0.0025%. Determinación empírica del límite de detección % OGM Resultado 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Frecuencia Detectada 0.02 + + + + + + + + + + 10 de 10 0.01 + + + + + + + + + + 10 de 10 0.005 + + - + + + + + + + 9 de 10 0.0025 - + + + + - + + - - 6 de 10 0.0012 - - - - - - - - - - 0 de 10 Las muestras deben analizarse como muestras ciegas Determinación empírica del límite de detección 0 0.01% Controls 0.005% 1 2 Samples 1 2 3 4 5 0.02% 0.01% 0.005% 0.0025% 0.00125% 3 4 5 Las muestras deben analizarse junto con las concentraciones al LOD 0% 0.1% 0.01% 0.01% #1 #2 #3 0% 0.1% 0.01% 0.01% #1 #2 #3 35S NOS Otras fases críticas en la eficiencia del método Extracción ADN Rendimiento de extracción Pureza del ADN Calidad para amplificación Ausencia de inhibidores de PCR Otras fases críticas en la eficiencia del método Optimización de la reacción de amplificación Selección de iniciadores óptimos Condiciones de amplificación más eficientes Uso de controles adecuados Uso de enzimas de alta eficiencia de amplificación Conociendo el LOD se puede planear el muestreo mas apropiado Un LOD de la PCR permite emplear muestras grandes, de hasta 10,000 granos Se pueden hacer agrupamientos de las muestras Suponer una frecuencia de 0.1% de OGM en la parcela (1/1000) Tamaño de muestra = 1000 granos 37% probabilidad de no encontrar el positivo (falsos negativos) Tamaño de muestra = 10,000 granos 99.99% probabilidad de detectar el OGM. Como asegurar la certeza de los resultados: Obtener muestras representativas del lugar donde se requiere hacer la detección Obtener muestras representativas y homogeneas del material para realizar la extracción de ADN Optimizar los métodos de extracción de ADN Obtener el número suficiente de copias de ADN para poner a la reacción de amplificación Optimizar los protocolos de amplificación por PCR Establecer y optimizar los límites de la detección Fases en la detección Toma de muestras en el campo Manejo de la muestra Homogeneización Toma de submuestra* Extracción de ADN Toma de submuestra * DETECCIÓN Amplificación por PCR LABORATORIO *Estas deben ser representativas de todo el lote Regresemos al muestreo en campo… Una vez establecido el LOD, se requiere determinar el “umbral de tolerancia” para la presencia en el campo: Si se puede detectar 1/10,000 podemos tener un umbral de 0.01% Un umbral más conservador 1/1000, permite minimizar costos y esfuerzo de colecta, permite cuantificar con precisión