AVANCES EN EL DIAGNÓSTICO DE LA ENFEMEDAD D E CARRION Gladys Ventura AVANCES EN EL DIAGNOSTICO DE LA ENFERMEDAD DE CARRION Bartonella bacilliformis ORDEN: FAMILIA: GENERO: ESPECIE : Rickettsiales Bartonellaceae Bartonella bacilliformis • Bacteria pleomorfica, Gram. negativa • Mide aproximadamente 3 micras de largo y 0.25 a 0.3 micras de diámetro • B. bacilliformis presenta flagelo, mientras que B. quintana y B hensenlae presentan pilli DIAGNOSTICO DE LA ENFERMEDAD DE CARRION DIAGNOSTICO DIRECTO AISLAMIENTO DEL AGENTE ETIOLOGICO DIAGNOSTICO Bacteriológico Frotis Sanguíneo Cultivos Molecular DIAGNOSTICO DIRECTO: FROTIS SANGUINEO Caracterización Bacteriológica Aislamiento del agente etiológico Tiempo Desarrollo Tº Crecimiento Nutrientes pH colonias • Bartonella bacilliformis como todas las células contiene ácidos nucleicos dentro de su estructura. TIPIFICACION PCR - RFLP Carril 1 : Marcador de Peso 300 pb 180 pb Molecular, carril 2 : Producto de amplificación del gen citrato sintetasa, carril 3 : Digestión del producto de amplificación con TaqI, carril 4 : Digestión del producto de amplificación con HinfI 80 pb 150 pb 50 pb Bartonella henselae Carril 1 : Marcador de Peso Molecular, carril 2 : Producto de amplificación 280 del gen citrato sintetasa, carril 3 : Digestión del producto de amplificación 170 140 con TaqI, carril 4 : Digestión del producto de amplificación con HinfI 70 100 SECUENCIAMIENTO • Diversidad Genética de B bacilliformis SITUACION ACTUAL El diagnóstico se basa principalmente en el examen directo de frotis, sin embargo éste presenta baja sensibilidad. Las pruebas serológicas presentan el mismo problema de sensibilidad y adicionalmente baja especificidad. Por otro lado, el desarrollo de este microorganismo in Vitro es muy lento (5 a 45 días). Es necesario tener una método de diagnóstico rápido de alta sensibilidad y especificidad. PCR para la detección de B bacilliformis en muestra de sangre. PCR La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una prueba moderna de diagnóstico consiste en la amplificación específica de fragmentos de ADN de los patógenos mediante el uso de ADN polimerasa termoestables in vitro,. Existe varios PCR propuestas para el diagnóstico de la Bartonelosis: • Amplificación del gen citrato sintetasa (gtlA) • del gen de la proteína de división celular FtsZ • del gen 16S rRNA • del gen de la riboflavina ribC •del gen que codifica a la proteína de estrés térmico de 60 kDa Sin embargo, estas no están diseñadas para el diagnóstico específico de la Bartonellosis por B. bacilliformis en muestras clínicas. Diseño de Primers Locus de invasión ialAB Mapa del locus ialAB y ubicación de los primers diseñados. Las flechas representan la parte codante de los factores de invasión ial e indican la orientación de los genes. MUESTRAS • 200 uL de sangre con anticoagulante EDTA o una gota de sangre impregnada en papel filtro PURIFICACION DE LAS MUESTRAS • usando kit basado en columnas de silica Etapa de la purificación: 1. Lisis de la muestra (proteinasa K, detergentes) 2. Unión del ADN a las columnas de silica 3. Lavado contaminantes de las columnas 4. Obtención del ADN Se añade 2 mL de esta purificación a cada reacción de PCR COMPONENTES DEL PCR •Buffer de amplificación •Nucleótidos •Cloruro de Magnesio •Primer o iniciadores •DNA Polimerasa termoestable •ADN a amplificarse Procedimiento para realizar PCR Área limpia •Almacenamiento de reactivos de PCR •Preparación de mezcla madre y tubos de reacción Área semi-sucia •Extracción de ADN de la muestra •Incorporación de ADN a tubos de reacción •Colocar tubos de reacción en termociclador Área sucia •Electroforesis de productos de amplificación en geles de agarosa •Tinción de geles de agarosa •Visualización bajo luz ultravioleta Condiciones de amplificación: •La temperatura óptima de hibridación de los oligonucleótidos fue 49 °C •Los ciclos de temperatura para la amplificación óptima fueron: 1.Denaturación inicial a 95°C por 10 minutos, 2. 35 Ciclos: Denaturación a 95°C por 30 segundos Hibridación a 49°C por 30 segundos Extensión a 72°C por 45 segundos 3.Extensión final de 72°C por 5 minutos. SENSIBILIDAD ESPECIFICIDAD DEL PCR PM 1 2 3 4 620 pb Especificidad de PCR con primers dirigidos al gen ialB. Carril 1: B. bacilliformis, carril 2: B. hensenlae, carril 3: B. vinsonii, y carril 4: control negativo. PM marcador de peso molecular /HindIII/EcoRI. RESULTADOS Se evaluaron: Muestras de pacientes con síntomas compatibles a bartonellosis provenientes de áreas endémicas y muestras de personas sanas provenientes de áreas no endémica. 50 muestras de sangre positivas al cultivo o frotis 80 muestras de sangre negativas al cultivo o frotis RESULTADOS •Especificidad: no amplifican B. hensenlae, B. vinsonii, Rickettsia, Vibrio, Salmonella, Shigella y E. coli. Su sensibilidad diagnóstica evaluada de manera preliminar alcanza a detectar el 100% de muestras con frotis positivo o cultivo positivo (50 muestras pacientes con síntomas compatibles con bartonelosis y 80 negativas) •Sensibilidad diagnóstica: 3 genomas. En el estudio de validación se detecta el triple de casos que frotis y cultivo. PCR :VENTAJAS • Resultados en 48 h • Útil en caso de brotes • Costo aceptable EL ROL DEL CNSP- INS FORTALECIMIENTO CONTROL DE CALIDAD SUPERVISION VIGILANCIA INVESTIGACION REGIONES ENDEMICAS DE LA ENFERMEDAD DE CARRIÒN 1 9 Frotis Cultivo FUENTE: FUENTE: CNSP / INS CONTROL CALIDAD LAMINAS CONCORDANCIA DEL DIAGNOSTICO DIRECTO 2003 100 100 97 80 60 47.2 40 BAGUA (I, II, III, IV) ANCASH (IV) LA LIBERTAD (IV) 10 LA LIBERTAD (III) 0 9.2 LA LIBERTAD (II) 20 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 98 PIURA (III) MA DRE DE DIO S ( III) CHA CHA PO Y A S (I, II) 87.2 LA MBA Y EQ UE (I,II) 99.2 97.2 100 99.1 100 99.2 100 LA LIBERTA D ( II) 90 LA LIBERTA D ( I) A NCA SH (III) A NCA SH ( II) A NCA SH ( I) BAG UA (III) BA G UA ( II) BA G UA ( I) JA EN ( II) J AEN ( I) CONTROL CALIDAD LAMINAS CONCORDANCIA DEL DIAGNOSTICO DIRECTO 2004 92 98 71.3 57.1 CAPACITACION DE LABORATORIOS DE LA RED REGION 1998 1999 LIMA-SUR X ANCASH X CUSCO X 2000 2001 2002 X X PIURA X JUNIN X HUANUCO X AYACUCHO X 2003 2004 X X X CAJAMARCA X X LA LIBERTAD X X LAMBAYEQUE X X SAN MARTIN X AMAZONAS X IQUITOS X MADRE DE DIOS X