Determinación del origen y el modo de reproducción de genotipos

Resumen: A-009
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2005
Determinación del origen y el modo de reproducción de
genotipos tetraploides de Paspalum simplex
Tcach, Mauricio - Acuña, Carlos A. - Martínez, Eric J. - Quarin, Camilo L.
Cátedra de Genética y Fitotecnia, FCA-UNNE, IBONE-CONICET
Sargento Cabral 2131. C.C. 209. (3400) Corrientes, Argentina
E-mail: eric@agr.unne.edu.ar TE: ++ 54-3783-426218
ANTECEDENTES
La apomixis es un modo de clonación natural por semillas de mucho interés para la agricultura. Los estudios de
segregación genética requieren contar con progenies obtenidas mediante cruzamientos entre individuos sexuales y
apomícticos dentro un mismo nivel de ploidía. Paspalum es un género de gramíneas donde la reproducción apomíctica
está ampliamente difundida. Sin embargo, muchas especies contienen citotipos diploides que son de reproducción
sexual mientras que las razas poliploides de la misma especie son apomícticas.
Paspalum simplex Morong es una especie de gramínea perteneciente al subgénero Anachyris de Paspalum. La misma
posee citotipos diploides (2n=2x=20) y triploides (2n=3x=30) de reproducción sexual (Espinoza y Quarin 1997, Urbani
y col. 2002) y citotipos triploides, tetraploides (2n=4x=40) y hexaploides (2n=6x=60) que se reproducen por apomixis
(Nath y col. 1970, Caponio y Quarin 1987, Urbani y col. 2002).
Con el objetivo de obtener genotipos autotetraploides sexuales de P. simplex, para utilizarlos en cruzamientos con
tetraploides apomícticos naturales, se realizaron duplicaciones cromosómicas de diploides sexuales, mediante el uso de
la colchicina (Cáceres y col. 1999). Los autores obtuvieron dos genotipos autotetraploides, uno de los cuales (11B1a)
fue clasificado como 100% sexual, a partir del empleo de la metodología de medición del contenido de ADN nuclear
de núcleos polares de sacos embrionarios. Sin embargo, análisis llevados a cabo recientemente, a partir de la utilización
de un marcador molecular específico de la apomixis, demostraron que dicha planta amplificaba el marcador ligado a
apomixis (datos inéditos). Por lo tanto, se planteó la duda si efectivamente 11B1a es una planta 100% sexual o si en
realidad se trata de un genotipo apomíctico facultativo con un alto nivel de sexualidad. Estos resultados generaron la
necesidad de volver a determinar el modo de reproducción del genotipo 11B1a, a través del uso de dos metodologías
diferentes, con la finalidad de establecer fehacientemente su modo de reproducción. Por otra parte, a partir de la
generación de progenies originadas por autofecundación de 11B1a se realizó una selección de individuos tetraploides
que se reproduzcan exclusivamente en forma sexual.
Los objetivos de este trabajo fueron: 1) establecer en Paspalum simplex, mediante prueba de progenie con marcadores
moleculares, el sistema reproductivo que dió origen a individuos tetraploides obtenidos por autofecundación de una
madre autotetraploide inducida, y 2) determinar el modo de reproducción de dichas progenies, por medio de análisis
embriológico y el empleo de un marcador molecular 100% ligado a la apomixis en dicha especie.
MATERIALES Y MÉTODOS
La especie utilizada fue Paspalum simplex tetraploide (2n=4x=40). Se trabajó con un genotipo autotetraploide inducido
(11B1a), obtenido a partir de un diploide duplicado con colchicina (Cáceres y col. 1999), y 9 progenies originadas por
autopolinización.
Determinación del origen reproductivo:
Se utilizó la metodología de las huellas genéticas, mediante el empleo de marcadores moleculares, para determinar si las
progenies de 11B1a se generaron a partir de un proceso sexual o por apomixis (asexual). Para ello, se recurrió al uso de
los RAPDs (Random amplified polymorphic DNA) sobre la base de la metodología descrita por Martínez y col. (2003).
Los productos de amplificación por PCR (Polymerase chain reaction) fueron separados electroforéticamente, tanto en
geles de agarosa al 2% como de poliacrilamida al 6%. Se realizó un primer ensayo con iniciadores (“primers”) al azar
(serie 5 y 8 de la Universidad Británica de Columbia), empleando la madre 11B1a y dos progenies tomadas al azar, con
el objeto de seleccionar aquellos primers que mostrasen patrones de bandas claras y polimórficas. Luego, los primers
seleccionados fueron evaluados con la totalidad de los descendientes. El origen reproductivo (sexualidad o apomixis)
fue determinado comparando los patrones de bandas amplificadas por la madre y cada una de sus progenies. Se
consideró de origen sexual a los individuos que mostraron bandas polimórficas (diferentes) con respecto a la madre, y
de origen apomíctico cuando la totalidad de las bandas amplificadas por la madre fueron compartidas por el hijo.
Determinación del modo de reproducción:
Se emplearon técnicas embriológicas y moleculares. En el primer caso se utilizó la técnica descripta por Herr (1971).
Para ello, se fijaron unas 40 a 60 espiguillas en antesis, luego se procedió a la disección de los ovarios, tratados con
ácido láctico durante 24 hs y posterior transferencia a una solución clarificadora (ácido láctico, hidrato de cloral, fenol,
aceite de clavo y xilol, 2:2:2:2:1) por otras 24 hs más. Los ovarios clarificados fueron montados en un portaobjeto y
observados con un microscopio con contraste de interferencia diferencial (DIC). La gran similitud morfológica y
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constitutiva que existe entre los sacos embrionarios meióticos y apospóricos de P. simplex no permitió distinguirlos
claramente. Por lo tanto, se empleó una clasificación indirecta, de acuerdo al número de sacos por óvulo, para poder
saber si la planta se reproduce en forma sexual o por apomixis. En los óvulos donde se observó un solo saco
embrionario, se consideró que pudo haberse originado de una megáspora reducida (sexual) o por aposporia (asexual).
Sin embargo, cuando los óvulos poseen sacos múltiples, al menos uno o más de esos sacos se originaron por aposporia.
Los individuos que solamente mostraron óvulos con sacos únicos fueron considerados de reproducción sexual; mientras
que los que poseían óvulos con sacos múltiples fueron clasificados como apomícticos.
Para confirmar la clasificación reproductiva obtenida previamente se utilizó un marcador de SCAR (Sequence
Characterized Amplified Regions), completamente ligado a la apomixis en P. simplex (Pupilli comun. pers.). Para la
obtención del SCAR se utilizó la metodología descripta por Paran y Michelmore (1993).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Determinación del origen reproductivo:
Un total de 47 primers de RAPD al azar fueron ensayados originalmente. Siete de ellos fueron seleccionados, por haber
mostrado un patrón de bandas claras y polimórficas, y evaluados con todos los descendientes. De los 133 marcadores
evaluados, 64 mostraron al menos una banda polimórfica entre todos los individuos analizados (Tabla 1).
Tabla 1. Resumen de la prueba de progenie realizada con marcadores moleculares de RAPD, entre una madre
autotetraploide inducida (11B1a) de P. simplex y 9 progenies obtenidas por autopolinización.
Tipo
Nº Primers
Nº Primers
N° Marcadores
Nº Marcadores
Nº Marcadores
de gel
ensayados
seleccionados
evaluados
monomórficos
polimórficos
Agarosa
22
2
17
7
10
Poliacrilamida
25
5
116
62
54
Total
47
7
133
69
64
En la Tabla 2 se observan los marcadores detectados en la madre 11B1a y en cada uno de sus descendientes; como así
también el nivel de polimorfismo encontrado en relación a la madre. Las 9 progenies mostraron un nivel significativo
de marcadores polimórficos con respecto a su progenitor. El número de marcadores polimórficos varió desde un
mínimo de 17 en C1-3 a 39 en C1-4 (Tabla 2). En la Figura 1 se observan los patrones de amplificación de tres de los
siete primers evaluados y las bandas que resultaron ser polimórficas. El alto nivel de polimorfismo encontrado en todos
los descendientes, con respecto a su progenitor, demuestra claramente que todos ellos se originaron a través de un
proceso de reproducción sexual.
Tabla 2. Análisis de los marcadores de RAPD obtenidos por amplificación del ADN genómico de
Paspalum simplex 11B1a y sus 9 progenies, a partir del ensayo de 7 primers. Los polimorfismos
detectados son marcadores presentes en la madre y ausentes en los descendientes o viceversa.
Genotipo
Nº marcadores detectados Nº total de marcadores Nº total de marcadores
evaluados
polimórficos
agarosa
poliacrilamida
11B1a
9
95
104
-
C1-1
11
87
98
29
C1-2
9
93
102
34
C1-3
11
82
93
17
C1-4
9
86
95
39
C1-5
9
89
98
36
C1-6
10
91
101
34
C1-B1
10
94
104
32
C1-B2
8
90
98
25
C1-B3
7
91
98
36
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Determinación del modo de reproducción:
En la Tabla 3 se resume la clasificación reproductiva obtenida para el genotipo 11B1a y su progenie. Los individuos
clasificados como sexuales (C1-2, C1-4 y C1-B2) no mostraron ningún óvulo con sacos múltiples y tampoco
amplificaron el SCAR ligado a apomixis. Sin embargo, todos los individuos clasificados como apomícticos mostraron,
en un número variable (entre 17,2% y 28,6%), sacos embrionarios múltiples y a su vez amplificaron el SCAR ligado al
carácter. Esto demuestra que el criterio que habíamos adoptado para la clasificación reproductiva, en función a la
presencia o ausencia de sacos múltiples, fue el correcto.
Tabla 3. Determinación del modo de reproducción de una planta autotetraploide inducida de P. simplex (11B1a) y de 9
de sus progenies, obtenidas por autofecundación, mediante el análisis del tipo de saco embrionario presente en ovarios
en antesis y la amplificación de un marcador de SCAR 100% ligado a apomixis.
Genotipo N° Espiguillas
%
%
%
%
Amplificación
Modo de
Evaluadas
Sacos
Sacos
Sacos
Sacos
SCAR 650 pb
reproducción
únicos
múltiples inmaduros abortados
11B1a
63
65,1
28,6
0
6,3
+
Apomixis
C1-1
53
79,2
18,9
0
1,9
+
Apomixis
C1-2
40
84,4
0
3,1
12,5
-
Sexual
C1-3
46
67,4
26,1
4,3
2,2
+
Apomixis
C1-4
32
78,1
0
9,4
12,5
-
Sexual
C1-5
47
66
34
0
0
+
Apomixis
C1-6
40
54,4
27,3
11,4
6,8
+
Apomixis
C1-B1
47
76,6
23,4
0
0
+
Apomixis
C1-B2
41
83,3
0
2,4
14,3
-
Sexual
C1-B3
64
82,2
17,2
0
0
+
Apomixis
CONCLUSIONES
Los resultados demostraron que el genotipo autotetraploide inducido 11B1a es apomíctico facultativo, con un alto nivel
de expresión sexual, y que además segrega para apomixis. Sin embargo, todos los descendientes obtenidos por
autopolinización se originaron en forma sexual. Esto plantea la duda si esta planta es capaz de generar descendientes
por apomixis, es decir si funciona la partenogénesis, para lo cual será necesario analizar una progenie más numerosa.
Por último, este estudio permitió seleccionar tres genotipos tetraploides sexuales, los cuales están siendo evaluados más
extensivamente para confirmar definitivamente su condición de individuos con reproducción exclusivamente por vía
sexual.
BIBLIOGRAFÍA
Cáceres M.E., Pupilli F., Quarin C.L. y S. Arcioni (1999) Feulgen-DNA densitometry of embryo sacs permits
discrimination between sexual and apomictic plants in Paspalum simplex. Euphytica 110: 161-167.
Caponio I. y C.L. Quarin (1987). El sistema genético de Paspalum simplex y de un híbrido interespecífico con P.
dilatatum. Kurtziana 19: 35-45.
Espinoza, F. y C. L. Quarin (1997) Relación genómica entre citotipos diploides de Paspalum simplex y Paspalum
procurrens (Poaceae, Gramineae). Darwiniana 35: 29-36.
Herr, J.M. (1971). A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms. Amer. J. Bot.
58:785-790.
Martínez E.J., Ortiz J.P.A., Hopp H.E. y C.L. Quarin (2003) Genetic characterization of apospory in tetraploid
Paspalum notatum based on the identification of linked molecular markers. Mol. Breed. 12: 319-327.
Nath J., Swaminathan M.S. y K.L. Mehra (1970) Cytological Studies in the Tribe Paniceae, Gramineae. Cytologia 35:
111-131.
Paran I. y R.W. Michelmore (1993) Development of reliable PCR-based markers linked to downy mildew resistance
genes in lettuce. Theor. Appl. Genet. 85: 985-993.
Urbani M.H., Quarin C.L., Espinoza, F., Penteado M.I.O. y I.F. Rodrigues (2002) Cytogeography and reproduction of
the Paspalum simplex polyploid complex. Plant Syst. Evol. 236: 99-105.
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UBC 402
(A)
λ
11B1a C1-1 C1-2
C1-3 C1-4
C1-5
C1-6 C1B1
2
4
UBC 704
1
2
3
4
5
6
C1B2 C1B3
UBC 705
7
8
9 10
1
3
5
6
7
8
9
10
(B)
Figura 1. Patrón de bandas generadas por la amplificación del ADN genómico de un individuo autotetraploide
inducido de Paspalum simplex (11B1a) y 9 progenies obtenidas por autopolinización. (A) Patrón de bandas
observado, producto de la amplificación del primer de RAPD UBC 402 y su posterior separación electroforética en
gel de agarosa al 2%. Las cabezas de flechas señalan las bandas polimórficas. λ = marcador de peso molecular
Lambda EcoRI/HindIII. (B) Patrón de bandas observado, producto de la amplificación de los primers de RAPD UBC
704 y UBC 705, separados en gel de poliacrilamida al 6%. Las cabezas de flechas indican las bandas polimórficas.
1= 11B1a, 2= C1-1, 3= C1-2, 4= C1-3, 5= C1-4, 6= C1-5, 7= C1-6, 8= C1-B1, 9= C1-B2, 10= C1-B3.