UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2003 Resumen: A-006 Transmisión de marcadores moleculares ligados a la aposporia en Paspalum notatum. Martínez, Eric J. - Acuña, Carlos - Coenes, Daniel - Fortes, Nidia B. - Quarin, Camilo L. Cátedra de Genética y Fitotecnia - Facultad de Cs. Agrarias - UNNE. - IBONE-CONICET Sargento Cabral 2131 - CC 209 - (3400) Corrientes - Argentina. Tel./Fax: +54 (03783) 426218 E-mail: eric@agr.unne.edu.ar ANTECEDENTES La apomixis es un sistema de reproducción asexual por medio de semillas (Nogler 1984) que permite la clonación natural de un genotipo determinado. La aposporia es una variante de la apomixis gametofítica que involucra la formación de sacos embrionarios no reducidos (2n) a partir de células de la nucela del óvulo. Los embriones se originan por partenogénesis de la ovocélula no reducida. Es un carácter regulado genéticamente y en algunas gramíneas se determinó que posee un control monogénico y dominante (Savidan 1982; do Valle y col. 1994; Sherwood y col. 1994, Ozias-Akins y col. 1998, Martínez y col. 2001). En los últimos años se han detectado varios marcadores moleculares ligados a la apomixis apospórica en Cenchrus ciliare (Gustine y col. 1997), Pennisetum squamulatum (Ozias-Akins y col. 1993, 1998), Brachiaria (Pessino y col. 1997 y 1998) y Paspalum (Martínez 2001; Pupilli y col. 2001). La ausencia de apomixis a nivel diploide es un aspecto que aún no ha sido del todo dilucidado. Aún no se sabe si se debe a un problema de ausencia del factor(es) necesario/s para su expresión o al hecho de que existe algún mecanismo que condiciona la expresión del carácter. Se ha propuesto que el factor que controla la apomixis estaría asociado a un gen letal para los gametos monoploides (n=x) y por lo tanto no se podría transmitir en los gametos del nivel diploide (Nogler 1982). Sin embargo, la simple duplicación cromosómica de plantas diploides sexuales de Paspalum originó plantas tetraploides con reproducción apomíctica facultativa (Quarin y Hanna 1980; Quarin y col. 2001). El objetivo de este trabajo fue analizar la transmisión del carácter aposporia en cruzamientos que involucren plantas diploides y tetraploides sexuales y un padre triploide apomíctico, con la finalidad de establecer la relación existente entre el nivel de ploidía y la expresión del carácter. MATERIALES Y METODOS Se utilizaron como progenitores femeninos cuatro genotipos diploides (2n=2x=20), dos tetraploides sexuales (2n=4x=40) y un tetraploide apomíctico facultativo. Un único genotipo triploide apomíctico (2n=3x=30) fue empleado como donador de polen. Los genotipos diploides y tetraploides sexuales como así también el tetraploide apomíctico facultativo carecen de ambos marcadores de RAPD ligados a la apomixis (datos previos propios). La Tabla 1 contiene las características reproductivas de cada uno de ellos y su origen. Tabla 1. Genotipos utilizados en los distintos cruzamientos de Paspalum notatum. Accesión 2n Reproducción Origen Q4084 #2 20 Sexual Argentina, Santa Fe, Cayasta (Planta #2) C4-55 20 Sexual Argentina, Corrientes (origen experimental) Q3658 20 Sexual USA, Georgia, Tifton (Planta # 2) Q4175 20 Sexual Argentina, Santa Fe, Dep. San Justo, 15 Km al oeste de La Criolla Q3686 30 Apomixis Argentina, Corrientes, 18 Km al norte de Sauce, Paso Mula Q3664 40 Apomixis facultativo USA, Georgia, Tifton (origen experimental) Q4188 40 Sexual Argentina, Corrientes (híbrido F1 # 31, entre Q3664 x Q3853) Q4205 40 Sexual Argentina, Corrientes (origen experimental, autofecundación Q3664) Se realizaron cruzamientos controlados de acuerdo a la técnica descrita por Burton (1948). Los cariopses obtenidos fueron sembrados en terrinas bajo invernáculo. Los plantines fueron transplantados a macetas y al mes llevados a tierra. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2003 Resumen: A-006 La metodología empleada consistió en lo siguiente: primero se emplearon dos marcadores de RAPD 100% ligados a la aposporia (Martínez 2001) para determinar la presencia de los mismos en las progenies. Para ello se efectuaron extracciones de ADN y amplificaciones por PCR de acuerdo a lo descrito por Martínez (2001). Una vez confirmada la presencia o ausencia de los respectivos marcadores en cada una de las progenies se realizaron recuentos cromosómicos de todas las plantas que poseían uno o los dos marcadores ligados a aposporia; como así también de algunas progenies que no lo poseían. Esto nos permitió saber el número cromosómico de los gametos aportados por el padre triploide apomíctico. Las plantas diploides y tetraploides sexuales normalmente aportan gametos reducidos con n=10 y 20 cromosomas respectivamente. Por último, se efectuó un análisis embriológico de las plantas que amplificaron los marcadores específicos de la aposporia para correlacionar la presencia de los mismos y la capacidad para formar sacos embrionarios apospóricos. Los recuentos cromosómicos fueron llevados a acabo de acuerdo a la metodología descrita por Quarin y col. (2001); mientras que el análisis embriológico se efectuó por medio la técnica de clarificado de ovarios de Herr (1971). RESULTADOS Y DISCUSION Se obtuvieron 7 progenies, de las cuales 4 de ellas fueron originadas por cruzamientos entre plantas diploides sexuales (Q4084 #2, C4-55, Q3658 y Q4175) como progenitores femeninos y un triploide apomíctico (Q3686) como donador de polen. Las restantes progenies se obtuvieron al utilizar como madres dos plantas tetraploides sexuales (Q4188 y Q4205) y un tetraploide apomíctico facultativo (Q3664) con bajo nivel de expresión de la apomixis (Tabla 1). En general, los porcentajes de plantas obtenidas con relación al número de espiguillas polinizadas fueron muy bajos y variaron entre 0,2 y 2%. En el cruzamiento Q4084 #2 X Q3686 (diploide X triploide) se obtuvieron 10 plantas de las cuales dos amplificaron ambos marcadores ligados a aposporia (Figura 1) y resultaron ser triploides 2n=30 (Tabla 2). Estos triploides probablemente se originaron por la unión de gametos femeninos con n=10 cromosomas y gametos masculinos con n=20. El resto de las progenies de este cruzamiento tenían un número cromosómico 2n=20. El análisis embriológico efectuado en las dos progenies triploides que poseían ambos marcadores demostró que las mismas se reproducen por apomixis. Se observó un alto porcentaje de sacos embrionarios apospóricos (>95%) e incluso varios sacos por óvulo. En los restantes cruzamientos entre plantas diploides y el triploide apomíctico no se detectaron progenies con los marcadores y las mismas resultaron ser diploides (2n=20). En el cruzamiento entre Q3658 X Q3686 no se obtuvieron plantas para el análisis (Tabla 2). Se obtuvieron un total de 41 plantas del cruzamiento Q3664 X Q3686 (tetraploide X triploide). Una de las plantas amplificó el marcador UBC243-377 (Figura 1) pero no UBC259-1157 (Tabla 2). Lamentablemente esta planta murió al poco tiempo de ser llevada a campo y por eso no se pudo efectuar el recuento cromosómico y el análisis embriológico. Los recuentos cromosómicos efectuados al azar en 13 plantas de este cruzamiento nos permitieron detectar una planta con 36, una con 37, cuatro con 39 y siete con 40 cromosomas. Por tratarse de una madre tetraploide sexual, lo más probable es que la misma aportó gametos reducidos con n=20 cromosomas, mientras que el padre triploide debió haber aportado gametos con n=16, 17, 19 y 20 cromosomas. En el cruzamiento de Q4188 X Q3686 (tetraploide X triploide), sobre un total de 27 plantas obtenidas, no se observó ninguna progenie con los marcadores ligados a la aposporia (Tabla 2). Por último, en el cruzamiento entre Q4205 X Q3686 (tetraploide X triploide) se obtuvieron 45 progenies, de las cuales una amplificó ambos marcadores (Figura 1). Esta planta resultó tener 39 cromosomas y seguramente se formó por la unión de un gameto femenino con n=20 cromosomas y otro masculino con n=19. El análisis embriológico aún no pudo efectuarse por falta de floración durante su primer año de crecimiento. En recuentos cromosómicos efectuados al azar en 8 progenies de este cruzamiento se encontraron plantas con 2n= 36, 37, 38, 39 y 40 cromosomas. Hasta el momento, no se ha podido detectar ninguna planta que amplifique los marcadores ligados a aposporia y que provenga de gametos masculinos monoploides (n=x=10) o hipermonoploides (n=x+1, 2, etc.). Por lo tanto, en principio la hipótesis planteada por Nogler (1982) se estaría cumpliendo y la apomixis solo puede ser transmitida a partir de gametos diploides (n=2x). Un dato a tener en cuenta es el hecho que hasta el momento no se han podido detectar plantas triploides (2n=3x=30) que provengan de cruzamientos entre tetraploides sexuales X triploide apomíctico. Esto puede deberse a la existencia de un desbalance cromosómico del endosperma producido por la relación existente entre el aporte genómico materno y paterno. En los cruzamientos entre plantas tetraploides sexuales X triploide apomíctico la formación de un embrión triploide (n + 2n) produciría una relación en el endosperma de 4:1 entre los genomas materno y paterno. En un estudio previo en P. notatum, Quarin (1999) demostró que en los cruzamientos en los cuales se emplearon citotipos diploides o tetraploides sexuales como madre, era necesario que exista en el endosperma una relación materno:paterno de 2:1 para que se produzca semilla normalmente. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2003 Resumen: A-006 Tabla 2. Cruzamientos efectuados, plantas obtenidas y marcadores moleculares ligados a la aposporia detectados en las progenies de Paspalum notatum Espiguillas polinizadas Plantas obtenidas Q4084 #2 X Q3686 4890 10 2 2 C4-55 X Q3686 1956 4 0 0 Q3658 X Q3686 398 0 0 0 Q4175 X Q3686 1264 8 0 0 Q3664 X Q3686 2050 41 1 0 Q4188 X Q3686 1687 27 0 0 Q4205 X Q3686 5000 45 1 1 Cruzamiento Número de plantas con UBC243-377(1) UBC259-1157(1) (1) Marcadores de RAPD 100 % ligados a aposporia en Paspalum notatum (Martínez 2001) CONCLUSIONES Los resultados obtenidos hasta el momento son preliminares y por lo tanto no permiten sacar una conclusión definitiva sobre la factibilidad de transmisión del locus de la aposporia a partir de gametos monoploides o hipermonoploides. Si bien es cierto que hasta ahora no se han detectado plantas apomícticas originadas a partir de estos gametos, es necesario analizar un mayor número de progenies y realizar nuevas combinaciones que nos permitan obtener resultados concluyentes. Por otra parte, el mismo estudio también se está llevando a acabo en P. simplex con la finalidad comparar el comportamiento entre estas dos especies. BIBLIOGRAFIA Burton G.W. (1948) Artificial fog chamber facilitates Paspalum emasculation. J. Am. Soc. Agron. 40: 281-282. do Valle C.B., Glienke C. y G.O.C. Leguizamon (1994) Inheritance of apomixis in Brachiaria, a tropical forage grass. Apomixis Newsl. 7: 42-43. Gustine D.L., Sherwood R.T. y D.R. Huff (1997) Apospory-linked molecular markers in buffelgrass. Crop Sci. 37: 947951. Herr, J.M. (1971). A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms. Amer. J. Bot. 58:785-790. Martínez E.J. 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Patrón de amplificación del primer UBC243 de RAPD en cuatro progenies de Paspalum notatum. (A) Progenies originadas por cruzamiento entre dos plantas diploides (Q4084 #2 y C455) y un triploide apomíctico (Q3686). (B) Progenie obtenida por cruzamiento entre una planta tetraploide apomíctica facultativa (Q3664) y un triploide apomíctico (Q3686). (C) Progenie producto del cruzamiento entre una planta tetraploide sexual (Q4205) y un triploide apomíctico (Q3686). Las flechas indican la banda ligada a aposporia (UBC243-377) amplificada por el padre triploide apomíctico (Q3686) y los asteriscos las plantas que amplificaron dicha banda. 100 bp es el marcador de peso molecular.