Informe HRM

Análisis de Variación génica
mediante el método HRM (High
Resolution Melting)
Fecha de creación
28/09/2012
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HRM
Estudio realizado por:
FRANCISCA GALLEGOa Y ROSA ARJONAb
a)Técnico superior especialista en RT-QPCR;
b)Técnico de Laboratorio
Unitat Cientificotècnica de Suport
Vall d’Hebron Institut de Recerca (VHIR)
Hospital Universitari Vall d’Hebron
28 de septiembre de 2012
Análisis de Variación génica
mediante el método HRM (High
Resolution Melting)
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28/09/2012
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Introducción
El método denominado de curvas de disociación de alta resolución (High Resolution
Melting, HRM) es un método simple, rápido y de bajo coste que se usa para la
identificación de variaciones en secuencias de ácidos nucleicos (por ej. SNP, mutaciones,
metilación). El método se basa en la caracterización de los productos de la PCR de acuerdo
al comportamiento de disociación de hebras, o dicho de otra manera, se basa en las
características de desnaturalización térmica de los amplicones y suministra información con
un rendimiento nunca antes alcanzado por el análisis de la curva de disociación clásica de
ADN. Las variaciones en las secuencias son detectadas tanto por un cambio en la Tm como
por un cambio en la forma de la curva de disociación. Esto es posible gracias a la
introducción de fluorocromos de unión a doble cadena de DNA de tercera generación y a la
incorporación de instrumentos de PCR a tiempo real con un sistema de control de
temperatura preciso y una capacidad de captura de datos avanzada. Los datos son
analizados y manipulados con programas diseñados específicamente para el análisis de
HRM.
Los aspectos más importantes a considerar en un análisis de HRM son:
1.- Química- El análisis de HRM utiliza fluorocromos de tercera generación. Son
fluorocromos que presentan una baja toxicidad en las reacciones de amplificación y por
tanto pueden ser usados a mayores concentraciones que los convencionales para conseguir
una mayor saturación de las muestras de ADN de doble cadena. No interfieren con la
reacción de la PCR.
2.- Instrumentos- El análisis de HRM requiere instrumentos que recolecten datos de
fluorescencia a una resolución de temperatura muy fina.
3.- Software- El análisis de HRM requiere un programa más sofisticado que use nuevos
algoritmos.
En el presente trabajo presentamos los resultados de un estudio de genotipado realizado en
la UCTS con la plataforma de PCR a Tiempo Real LightCycler480 de ROCHE utilizando
el reactivo LightCycler480 High Resolution Melting Master para la detección de cuatro
clases de SNPs humanos.
Objetivo
El objetivo principal del presente estudio es poner a disposición de los investigadores el
bagaje experimental adquirido por personal técnico de la UCTS durante la realización de un
estudio de genotipado mediante la técnica de HRM (High Resolution Melting) realizada
con la plataforma LightCycler480 de ROCHE.
Pretendemos que con esta información los investigadores puedan extraer un código de
buenas prácticas para la realización de experimentos HRM.
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Diseño Experimental
Para la realización del presente estudio se ha seguido el flujo de trabajo descrito por
ROCHE en la nota técnica Nº.1: High Resolution Melting Optimization Strategies:
1.- Elección de SNPs.
2.- Diseño de Cebadores.
3.- Elección de la fuente de DNA.
4.- Comprobación de la especificidad y optimización de la Tm de las diferentes parejas de
cebadores mediante PCR convencional y Bioanalyzer.
5.- Optimización de la mezcla de reacción PCR-HRM.
6.- Optimización del programa de PCR y disociación.
7.- Análisis de los datos experimentales utilizando un software apropiado y Validación de
la técnica.
1.- Elección de SNPs.
El objetivo de este ensayo es reproducir la detección de 4 tipos de SNPs conocidos
mediante HRM con el uso de herramientas de la UCTS que están a disposición de los
investigadores.
Con el fin de simplificar la puesta a punto de un ensayo de genotipado mediante HRM se
hizo una búsqueda bibliográfica para la selección de cuatro SNPs que ejemplifican cada
uno de los 4 tipos existentes descritos en la literatura (Tabla 1)
Tabla 1  Clasificación y frecuencia de SNPs. Un ejemplo de cada tipo.
Tipo
SNP
Cambio de base
Frecuencia
Ejemplo
SNP
de
1
C>T, T>C, G>A, A>G
64%
Rs12913832
A/G
2
C>A, A>C, G>T, T>G
20%
Rs12896399
G/T
3
C>G, G>C
9%
Rs35731153
C/G
4
A>T, T>A
7%
RS641805
A/T
Mutación
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2.- Diseño de Cebadores.
Las secuencias de los cebadores para la detección de los cuatro SNPs seleccionados fueron
diseñadas utilizando el programa Primer Express de Life Technologies (Applied
Biosystems). De acuerdo con los prerrequisitos de la PCR a tiempo real, los cebadores
fueron diseñados para tener una temperatura de anillamiento de alrededor de 60ºC, un
porcentaje en el contenido de C-G de entre 30%-80% (excepto uno de los cebadores que
contiene 28.1% C-G) y amplificar amplicones menores de 150 bp.
Además, y siguiendo las recomendaciones de expertos en HRM (soporte técnico de Roche),
con el fin de aumentar la probabilidad de identificar una pareja válida y robusta para el
genotipado, se diseñaron dos parejas de cebadores para los tipos de SNPs I (cebadores 1/2 y
3/4), II (cebadores 9/10 y 11/12) III (cebadores 5/6 y 7/8) y IV (cebadores 15/16 y 17/18).
Se testó, además, una pareja extra de cebadores de secuencias conocidas y publicadas para
el SNP tipo IV (cebadores 13/14). Los cebadores fueron resuspendidos en el volumen de
agua calculada con la hoja de cálculo de IDT technology, con el fin de obtener una
concentración de 50 µM. La concentración de trabajo fue de 5 µM y la concentración final
de los cebadores en la mezcla de PCR fue 0.3 µM. En contra de lo recomendado por Roche
y con el fin de minimizar costes se usaron cebadores no purificados mediante HPLC.
Los detalles de la secuencia de cada pareja de cebadores y el tamaño del amplicón
resultante en cada caso se recogen en la Tabla 2.
Tabla 2  Secuencias de cebadores para el genotipado mediante HRM de cuatro tipos de
SNPs.
SNP
Rs12913832
Rs12896399
Rs35731153
RS641805
Tipo
SNP
1
2
3
4
Mutación
A/G
G/T
C/G
A/T
Secuencia de Cebadores
Tamaño
Amplicón
(bp)
1-Rv= 5´TCGGCCCCTGATGATGATAG 3´
2-FW= 5´ATGGCTCTCTGTGTCTGATCCAA 3´
90
3-Rv= 5´CTCGGCCCCTGATGATGATA 3´
4-FW= 5´ TTCATGGCTCTCTGTGTCTGATC 3´
94
9-Rv= 5´ TACTTAGCCCTGGGTCTTGATGTT 3´
10-FW=5´CAATTCTTTGTTCTTTAGGTCAGTATATTTTG 3´
97
11-Rv= 5´ GTATTGATGAGGAAGGTTAATCTGCTGTG 3´
12-FW= 5´AGCTAAAAGTTGTTATTTATCTGAAAATTCAA 3´
139
5-Rv= 5´GTGACGGCAGGGAAGT 3´
6-FW= 5´GCATCTTCATCAGGACCTACT 3
89
7-Rv= 5´GCTAGCATTGCAGATGGT 3´
8-FW= 5´ATCTTCATCAGGACCTACTTGAG 3
99
15-Rv= 5´ ACTACCAGAAATGTTAGTGAAAGTTTGC 3´
16-FW= 5´ GTCTAAACAAATAGACTGGCGCATTAC 3´
101
17-Rv= 5´ TGTTTCTTTCTGTCTTGAGCAATACCT 3´
18-FW= 5´ GCGCATTACTTTTGGCTTTTCT 3´
121
13-Rv= 5´ACATTCATCCTTACATGGCACCA 3´
14-FW= 5´AACTTGGCTTTAATGGACCTCCA 3´
101
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3.- Elección de la fuente de DNA.
Se utilizó un DNA genómico humano comercial (ROCHE) para el testado de la
especificidad y optimización de la temperatura de anillamiento (Tm) de cada una de las dos
parejas de cebadores diseñadas para cada tipo de SNP. Este DNA se utilizó también para la
optimización de la mezcla de reacción (ver detalles en el punto 5).
Para el análisis completo de HRM con una pareja válida de cebadores para cada SNP se
utilizaron muestras de DNA genómico pertenecientes al panel comercial HRC-5 del banco
de células Europeo ECACC, que representa una población control de 96 donadores de
sangre Caucasianos de origen UK. Se utilizaron 30 ng de cada muestra de DNA como
molde en la PCR.
4.- Comprobación de la especificidad y optimización de la Tm de las diferentes parejas
de cebadores mediante PCR convencional y Bioanalyzer.
La temperatura de anillamiento es el parámetro con mayor influencia sobre la eficiencia y
especificidad de la reacción de PCR. Reacciones eficientes y robustas generan datos
reproducibles. La determinación de la temperatura de anillamiento se realizó mediante PCR
convencional y la especificad de cada pareja de cebadores se comprobó con el Bioanalyzer
utilizando chips de DNA 1000. La Tabla 3 muestra el programa universal de temperaturas
de PCR utilizado.
Tabla 3  Programa Universal de temperaturas de PCR
Tª
Time
Pre-Incubation
95ºC
10 min
Amplification
(X40)
95ºC
60ºC
15 seg
1 min
5.- Optimización de la mezcla de reacción PCR-HRM.
La mezcla de reacción HRM se optimizó utilizando el reactivo LightCycler480 High
Resolution Melting Master, una mezcla de reacción específicamente desarrollada para
producir resultados óptimos de HRM con la plataforma de PCR a tiempo real
LightCycler480. Todas las variantes se amplificaron en un formato de placas blancas de
384 pocillos (Roche) con las mismas condiciones de mezcla de PCR siguiendo las
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instrucciones recomendadas por el producto. Para más detalles sobre la mezcla de reacción
ver Tabla 4.
Las sales afectan al comportamiento de disociación, de manera que es importante que la
concentración de buffer, Mg2+ y otras sales en la mezcla de reacción sean tan uniformes
como sea posible en todas las muestras. Para asegurar la especificidad y robustez de la PCR
llevamos a cabo una titulación para determinar la concentración óptima de MgCl2 en la
reacción. Para ello se utilizó un rango de concentraciones finales de MgCl2 entre 1.5 y 3.5
mM, partiendo de una solución stock de concentración 25 mM suministrada
individualmente con el kit de master mix.
Tabla 4  Mezcla de reacción PCR_HRM
Componentes
Volumen
Master Mix Resolight Melting Master (2X)
MgCl2 (25mM)
Primer Fw (5 µM)
Primer Rv (5 µM)
DNA (10 ng/µl)
H2O
Volumen Final
10 µl
1,2 µl
1,2 µl
3 µl
3 µl
20 µl
Concentración
Final
1X
1.5-3.5 mM
0,3 µM
0,3 µM
30 ng
-
6.- Optimización del programa de PCR y de disociación.
En la Tabla 5 se muestra el programa de temperatura PCR-HRM recomendado para la
realización de un ensayo de genotipado en el instrumento LightCycler480 utilizando la
LightCycler480 High Resolution Melting Master Mix.
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Tabla 5  Programa de Temperatura
Tª
Time
Pre-Incubation
95ºC
10 min none
Ramp
rate
(ºC/s)
4,8
Amplification
(X40)
95ºC
60ºC
15 seg
1 min
none
Single
4,8
2,5
High Resolution Melting
95ºC
40ºC
65ºC
95ºC
1 min
1 min
1 seg
-
none
none
none
Continous
4,8
2,5
1
0
40ºC
10 seg
none
2,5
Cooling
Adquisition
Mode
Adquisition
(per ºC)
25
7.- Análisis de Datos y Validación con la tecnología Sanger.
El análisis de los datos de amplificación y la especificidad del producto se realizó con el
programa LightCycler 480 específico de la plataforma que lleva el mismo nombre y el
análisis de curva de disociación de alta resolución mediante el módulo Gene Scanning
versión 1.2 que ofrece el mismo programa. Previo al análisis de HRM hay que revisar
siempre los datos de la amplificación. Para conseguir un análisis óptimo de HRM:
a) todas las curvas de amplificación deben producir un valor de Cp < 30
b) todas las curvas deben alcanzar una fase plató similar,
c) entre las muestras, el valor de Cp no debe variar más de 5 unidades de Cp
(correspondientes a aproximadamente una dilución 1:100).
A continuación, la aplicación Gene Scanning analiza las curvas de disociación de la
siguiente manera (Figura 1):
1) Normalización de los datos crudos de curvas de disociación, estableciendo valores
uniformes de fluorescencias inicial (“pre-melt”) y final (“post-melt”) de todas las
muestras;
2) “Temperature shift”: mueve las curvas normalizadas a lo largo del eje de
temperaturas, para equiparar el punto en el cual el dsDNA en cada muestra está
totalmente desnaturalizado;
3) “Difference Plot”: Sustrae a partir de una curva de referencia para mostrar de forma
más clara las diferencias en la forma de las curvas de disociación entre las muestras
y las traza.
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En el gráfico de diferencias resultante, las muestras forman grupos en función de las formas
de sus curvas de disociación.
Normalización
Temperature Shift
Difference Plot
Figura 1  El módulo Gene Scanning del programa LighCycler480 permite analizar
curvas de disociación de alta resolución o HRM.
Si bien la aplicación Gene Scanning puede detectar cualquier variación de secuencia entre
diferentes muestras, no determina en cambio cuál es exactamente la base que está presente
en los respectivos alelos. Por tanto, a veces se requiere de la secuenciación de un amplicón
de cada grupo establecido por HRM para definir las variaciones. En el presente trabajo se
ha utilizado la secuenciación Sanger para la validación del genotipado por HRM. Para
analizar la relación existente entre las dos tecnologías se han empleado tablas de
contingencia.
Resultados y Discusión
1. Comprobación de la especificidad de producto y optimización de la Tm.
Para la determinación de la Tm óptima se testó primero la temperatura de 60ºC para
amplificar mediante PCR convencional 30 ng de DNA genómico humano (Roche) con cada
una de las parejas de cebadores diseñadas para la detección de los diferentes tipos de SNP.
La calidad del producto de PCR resultante se determinó mediante gel de agarosa al 4%
(Figura 2 A) y mediante Bioanalyzer utilizando chips de DNA 1000 (Figura 2 B).
En el gel de agarosa se aprecia una banda del tamaño esperado (Tabla 2) resultante de la
amplificación con los cebadores 1/2, 3/4, 7/8, 9/10, 11/12, 15/16 y 17/18; múltiples bandas
resultantes de la amplificación con los cebadores 5/6 y ninguna banda resultante de la
amplificación con los cebadores 13/14. La verificación de este resultado mediante un chip
DNA-1000 reveló la presencia de dos picos resultantes de la amplificación con los
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cebadores 5/6, 7/8 y 9/10. Este dato es indicativo de que el Bioanalyzer es más sensible que
el gel de agarosa, de acuerdo con las especificaciones técnicas de este equipo. Con el fin de
corroborar este resultado se repitió la amplificación en las mismas condiciones con los
cebadores 5/6, 7/8, 9/10 y 13/14, de la que se obtuvo una única banda con los cebadores 5/6
y 9/10. Por ello consideramos que los picos extra que se observaron anteriormente con
estos cebadores son posiblemente producto de un artefacto. Los cebadores 7/8 y 13/14
tampoco generaron un amplicón único al variar la temperatura de anillamiento a 59 y 58ºC
(no se muestran datos). La Figura 3 muestra el análisis por Bioanalyzer (chips DNA-1000)
de los amplicones obtenidos con los cebadores 1/2, 9/10, 5/6 y 15/16, seleccionados para el
análisis completo de HRM
Figura 2  Verificación de la calidad de amplicones mediante A) Gel de agarosa y B) gel
de un Bioanalyzer con Chips de DNA 1000, C) Electroferogramas resultantes del Chip de
DNA 1000
A)
B)
bp
10bp Ladder
10bp Ladder NTC1/2 NTC3/4 NTC5/6 NTC7/8 NTC9/10 NTC11/12 NTC13/14 NTC15/16 NTC17/18
0.5ug
2ug 1/2
15/16
17/18
7/8 9/10 11/12 13/14
3/4
5/6
4% Gel agarosa
TM=60ºC
9/10
5/6
1/2
3/4
7/8
13/14
17/18
15/16
11/12
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C)
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Figura 3  Análisis por Bioanalyzer (chips DNA-1000) de los amplicones obtenidos con
los cebadores seleccionados para el análisis completo de HRM.
bp
1/2
9/10 5/6 15/16
Una vez hecha la comprobación mediante PCR convencional de la especificidad y
optimización de la Tm con cada uno de los cebadores diseñados, escogimos para la
realización del análisis completo de HRM las parejas de cebadores 1/2, 9/10, 5/6 y 15/16
que constituyen un ejemplo de cada uno de los tipos de SNPs I, II, III y IV,
respectivamente. En la Tabla 6 se muestra las secuencias de los cebadores seleccionados
para el análisis completo de HRM y la Tm de trabajo.
Tabla 6  Secuencias de los cebadores seleccionados para el análisis completo de HRM y
la Tm de trabajo.
SNP
Tipo
SNP
Mutación
Secuencia de Cebadores
Tm
(ºC)
Rs12913832
I
A/G
1-Rv= 5´TCGGCCCCTGATGATGATAG 3´
2-FW= 5´ATGGCTCTCTGTGTCTGATCCAA 3´
60
Rs12896399
II
G/T
9-Rv= 5´ TACTTAGCCCTGGGTCTTGATGTT 3´
10-FW=5´CAATTCTTTGTTCTTTAGGTCAGTATATTTTG
3´
60
Rs35731153
III
C/G
5-Rv= 5´GTGACGGCAGGGAAGT 3´
6-FW= 5´GCATCTTCATCAGGACCTACT 3
60
RS641805
IV
A/T
15-Rv= 5´ ACTACCAGAAATGTTAGTGAAAGTTTGC 3´
16-FW= 5´ GTCTAAACAAATAGACTGGCGCATTAC 3´
60
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2. Titulación de MgCl2.
Teniendo en cuenta que las sales pueden afectar al comportamiento de disociación, el
siguiente paso fue la determinación de la concentración óptima de MgCl2 titulando
concentraciones de entre 1 mM y 4 mM en la reacción de PCR con las parejas de
cebadores 1/2, 5/6, 9/10 y 15/16. La verificación de la calidad de los amplicones se puede
llevar a cabo mediante un gel de agarosa o mediante análisis de curva de disociación.
Debido a la posibilidad de monitorizar la cinética de la amplificación en un instrumento de
PCR a tiempo real, se utilizó preferentemente la plataforma LightCycler480 en lugar de un
termociclador convencional para verificar la calidad de los amplicones mediante el análisis
de curva de disociación. Se escogió como mejor concentración de MgCl2 la que dio lugar a
un amplicón con un valor de Cp bajo con una fase plató elevada, teniendo en cuenta que un
valor de Cp menor de 30 ciclos es indicativo de que hay una cantidad apropiada de muestra
y una eficiencia de amplificación idónea.
De las amplificaciones resultantes de la titulación de MgCl2 concluimos que la
concentración que ofrece un valor de Cp por debajo de 30 con la fase plató más elevada es
de 2 mM en todas las parejas de cebadores testadas. La Figura 4 muestra el perfil de curvas
de amplificación con el correspondiente valor de Cp y las curvas de disociación obtenidas
con cada una de las parejas de cebadores.
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Figura 4  Titulación típica de MgCl2. La concentración óptima para todos los casos
es de 2 mM debido al valor más bajo de Cp y la fase plató más elevada.
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3. Análisis de HRM y validación mediante la tecnología Sanger.
Una vez optimizada la Tm y la mezcla de reacción se procedió a la realización de la PCR a
tiempo real y posterior análisis de HRM de 96 muestras de DNA con cada una de las
parejas de cebadores seleccionadas.
Se aplicaron los siguientes tipos de análisis que ofrece el programa LightCycler 480 para la
validación de los datos:
1.- Abs Quant/2nd Derivative Max
Este tipo de análisis está indicado para testar los valores de Cp y las curvas de
amplificación.
De acuerdo con el gráfico de la Figura 5, todas las muestras amplificadas con las parejas de
cebadores 1/2, 5/6, 9/10 y 15/16 dieron valores de Cp < 30. Además, entre las muestras, el
valor de Cp no varió más de 5 unidades.
23.70 ± 0.054
26.05 ± 0.047
24.35 ± 0.039
24.03 ± 0.077
Figura 5  Valores de Cp de 96 muestras de DNA con las parejas de cebadores 1/2, 9/10,
5/6 y 15/16.
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Hay que mencionar la presencia de producto amplificado también en los NTCs con las
parejas de cebadores 1/2, 5/6, 9/10 y 15/16. Mientras que esta contaminación estaba
siempre presente en los NTCs con la pareja de cebadores 5/6, sólo aparecía a veces en los
NTCs con el resto de cebadores. Un ejemplo de ello lo muestran los gráficos de la Figura 6.
Es conocido que la aparición de producto amplificado en las muestras NTCs es indicativo
de la contaminación por DNA o de la formación de dímeros de cebadores en las reacciones
de PCR. Para obtener más detalle acerca del tipo de contaminación observada procedimos
al análisis de curvas de disociación clásicas que ofrece el software LightCycler 480
denominado Tm calling (ver apartado 2)
En cualquier caso, asumimos que la presencia de estos productos inespecíficos no afecta a
la valoración final del ensayo dado que la aparición de dicha contaminación se produce
siempre en el valor de Cp 35, más allá de nuestro Cp límite de 30.
Figura 6  Aparición ocasional de producto inespecífico en las muestras NTCs a un valor
de Cp=35.
2.- Tm calling
Este tipo de análisis está indicado para corroborar la especificidad de los productos
amplificados obtenidos así como para informar de la presencia o ausencia de posibles
contaminantes.
En todas las muestras problema amplificadas con las parejas de cebadores 1/2, 5/6, 9/10 y
15/16 se obtuvo un único producto de PCR con Tm de entre 78-84ºC. En la figura 7 se
detalla la Tm obtenida con cada pareja de cebadores.
En cuanto a las muestras NTCs, la presencia de producto amplificado con las parejas de
cebadores 1/2, 9/10 y 15/16 tenía siempre el mismo valor de Tm que los productos
amplificados en las muestras problema, lo que hace pensar en la posibilidad de que se trate
de contaminación por producto de PCR procedente de reacciones previas y no en la
formación de dímeros de cebadores. Se descartó que la contaminación fuera debida a la
contaminación por DNA de algunos de los reactivos de la mezcla de PCR, ya que se
tomaron todas las precauciones posibles, inclusive la compra de novo de los cebadores. En
cuanto al producto amplificado detectado en las muestras NTCs con la pareja de cebadores
5/6, el valor de Tm=76ºC apuntaba a que se trata de dímeros de cebador. No obstante, cabe
destacar en este último caso que la presencia de dímeros de cebadores en sólo las muestras
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NTCs y no en las muestras problema indica que la amplificación del DNA problema por la
polimerasa se ve favorecida frente a los dímeros de cebadores, evitando así el uso de los
mismos con los que interactúa en ausencia de DNA de la muestra.
P1-2
P5-6
Tm = 81.50 ± 0.184
Tm = 83.61 ± 0.104
P15-16
Tm = 79.11 ± 0.59
P9-10
Tm = 78.96 ± 0.37
Figura 7  Análisis de la especificidad de producto mediante el tipo de análisis “Tm
calling” del software LightCycler 480.
Las pequeñas variaciones en la Tm de un mismo producto de PCR que se aprecian entre las
diferentes muestras pueden ser debidas a las variaciones en la secuencia del amplicón
resultante causadas por el SNP.
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3.- Gene Scanning, para el análisis PCR-HRM.
La Figura 8 muestra el análisis de curva de disociación de alta resolución, mediante la
aplicación Gene Scanning, de las muestras amplificadas con las diferentes parejas de
cebadores: 1/2 (para la detección del SNP tipo I), 9/10 (para la detección tipo II), 5/6 (para
la detección del SNP tipo III), y 15/16 (para la detección del SNP tipo IV). Además, se
contrasta este resultado con la secuenciación mediante Sanger del producto amplificado por
HRM. La secuenciación se realizó utilizando uno de los cebadores y sólo en caso de dudas
se utilizó el cebador contrario para la confirmación de la secuencia. Además, la
secuenciación se llevó a cabo sin previa purificación del producto amplificado,
comprobando de esta manera que el fluorocromo 480 ResoLight contenido en la master
mix no interfiere con el proceso de secuenciación.
Concretamente:
SNP de tipo I: A/G
Para la detección del SNP de tipo I A/G mediante HRM se procesaron 96 muestras a la vez,
resultando dos grupos de muestras, el grupo 1 y el grupo 2, cada uno con una forma de
curvas de disociación característica y diferente entre sí (apartado A-1 de la Figura 8). De la
validación por Sanger de estas muestras con el cebador en sentido directo, un 3% (3/96) de
muestras fueron homocigotos AA, un 66,6% (64/96) fueron homocigotos GG y un 30%
(29/96) fueron heterocigotos A/G. Concretamente, dentro del grupo 1 detectado por HRM
había muestras pertenecientes a los tres genotipos y dentro del grupo 2 detectado por HRM
había muestras pertenecientes a los genotipos GG y AG (apartado B-1 de la Figura 8).
SNP de tipo II: G/T
Para la detección del SNP de tipo II G/T mediante HRM se procesaron las muestras en tres
tandas de 30 y una de 6, resultando dos grupos de muestras en la tanda 1 y tres grupos de
muestras en el resto de tandas (apartado A-2 del gráfico X). La validación por Sanger de
estas muestras con el cebador en sentido directo produjo un 25% (24/96) homocigotos GG,
20% (19/96) homocigotos TT y 55% (53/96) heterocigotos GT. (apartado B-2 de la Figura
8).
SNP de tipo III: C/G
De la detección del SNP de tipo III mediante HRM en las 96 muestras a la vez se
obtuvieron dos grupos, cada uno con una forma de curva de disociación característica (A-3
del gráfico X). La validación por Sanger de estas muestras con el cebador en sentido directo
coincidió con el análisis HRM, detectándose un 98% (94/96) homocigotos CC y 2% (2/96)
homocigotos GG (apartado B-3 de la Figura 8). La secuenciación de las dos únicas
muestras homocigotos GG más 10 muestras de la otra variante se corroboró con el cebador
antisentido.
SNP de tipo IV: A/T
Para la detección del SNP de tipo IV A/T mediante HRM se procesaron las muestras en dos
tandas de 30 y una de 36, resultando dos grupos de muestras en las tres tandas analizadas.
(A-4 de la Figura 8). La validación por Sanger de estas muestras con el cebador en sentido
directo produjo un 9.4% (9/96) homocigotos AA, 38.5% (37/96) fueron homocigotos TT y
52% (50/96) heterocigotos AT. (apartado B-4 de la Figura 8).
Análisis de Variación génica
mediante el método HRM (High
Resolution Melting)
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Figura 8: A.- Detección mediante HRM del: A-1) SNP tipo I; A-2) SNP tipo II; A-3) SNP
tipo III y A-4) SNP tipo IV; B.- Comparación del genotipado mediante HRM versus
secuenciación Sanger del: B-1) SNP tipo I; B-2) SNP tipo II; B-3) SNP tipo III y B-4) SNP
tipo IV.
B-1) Sanger del SNP tipo I:
SNP clase I: G/A
80
70
60
San g er
A-1) HRM del SNP tipo I:
G/A
G/A
GG
AA
AG
50
40
30
20
10
0
1
HRM
2
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Análisis de Variación génica
mediante el método HRM (High
Resolution Melting)
B-2) Sanger del SNP tipo II:
G/T
SNP clase II: G/T
Tanda de m uestras 1
Sanger
A-2) HRM del SNP tipo II:
G/T
16
14
12
10
8
6
4
2
0
CC
CA
AA
1
2
Grupos HRM
SNP clase II: G/T
Tanda de m ue stras 2
20
18
16
Sanger
14
TT
12
GT
10
8
GG
6
4
2
0
1
2
3
Grupos HRM
SNP clase II: G/T
Tande de m uestras III
20
18
16
Sanger
14
CC
12
CA
10
8
AA
6
4
2
0
1
2
3
Grupos HRM
SNP clase II:G/T
Tanda de m uestras IV
3,5
Sanger
3
CC
2,5
2
CA
1,5
AA
1
0,5
0
1
2
3
HRM
B-3) Sanger del SNP tipo III:
G/C
SNP clase III:G/C
100
80
Sa n g e r
A-3) HRM del SNP tipo III:
G/C
60
GG
40
CC
20
0
1
2
HRM
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Análisis de Variación génica
mediante el método HRM (High
Resolution Melting)
A-4) HRM del SNP SNP tipo IV:
A/T
B-4) Sanger del SNP tipo IV:
A/T
SNP clase IV: A/T
Tanda de muestras I
18
Sanger
16
14
12
TT
10
AT
8
6
4
AA
2
0
1
2
HRM
SNP clase IV: A/T
Tanda de muestras II
16
14
Sanger
12
10
TT
8
AT
6
AA
4
2
0
1
2
HRM
SNP clase IV: A/T
Tanda de muestras III
Sanger
20
15
TT
10
AT
AA
5
0
1
2
HRM
Diferenciación entre variantes genotípicas
Con el fin de diferenciar entre las tres variantes genotípicas para los SNPs de tipo I, tipo II
y tipo IV, se repitió el genotipado mediante HRM de 10 muestras con cada una de las
parejas de cebadores correspondientes a los tres tipos de SNPs y se añadió en todas ellas un
50% de DNA homocigoto conocido. En el caso de los SNPs de tipo I y II se consiguieron
diferenciar los tres genotipos esperados, sin embargo para la detección del SNP tipo IV no
fue posible dicha discriminación. La figura 9-A) muestra un ejemplo del electroferograma
de las secuencias Sanger de cada genotipo para el SNP tipo I, indicado con una flecha; los
grupos asignados mediante HRM de las 10 muestras amplificadas sin y con DNA Spike
para la detección del SNP-I; y la comparación entre ambas tecnologías para dicho SNP-I.
La figura 9-B), muestra lo mismo para la detección del SNP tipo II.
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Figura 9-A)
Diferenciación de las variantes genotípicas para el SNP tipo I: A/G
AA
AG
B8
GG
D5
Resultado
Sanger
Muestras sin Spiking
F1
Muestras con Spiking
Con Spiking
Sin Spiking
GG
GG
AG
AA
AA
AG
GG
GG
GG
GG
SNP Clase I: A/G
Muestras Spiking con DNA Homocigoto AA
SNP Clase I: A/G
Muestras sin Spiking
2,5
2
6
5
GG
4
3
AA
AG
2
1
Sanger
Sanger
8
7
GG
1,5
AA
1
AG
0,5
0
0
1
2
HRM
1
2
HRM
3
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Resolution Melting)
Figura 9-B)
D ife re nci ació n d e la s varian tes g e no típ ica s p a ra el SN P tip o II: G/T
CC
CA
AA
Rv_H11
Rv_H7
Rv_H9
Resu ltado
Sa ng er
Mu estras Sin Spik ing
Mues tras Con Spik ing
AA
CA
CC
CA
CC
CC
AA
AA
AA
CC
SNP tipo II: G/T
Muestras sin Spiking
SNP tipo II: G/T
Muestras con Spiking
8
7
5
TT
4
GT
3
GG
2
1
Sanger
Sanger
6
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
TT
GT
GG
0
1
2
HRM
1
2
HRM
3
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Conclusiones
HRM es una técnica simple, fácilmente accesible y de bajo coste que sirve para analizar de
forma rápida múltiples variantes genéticas. No obstante, el cuidado en la preparación de la
muestra y el planteamiento del diseño experimental, en especial el diseño de cebadores, son
cruciales para la obtención de resultados robustos y reproducibles.
De la experiencia adquirida en la realización de este análisis, consideramos que para la
realización de un estudio de genotipado mediante HRM son cruciales los siguientes puntos:
1.- Testado de más de una pareja de cebadores por SNP
2.- Mismo método de extracción de DNA de todas las muestras
3.- Triplicados de las muestras
Está descrito que aunque el genotipado de SNPs mediante HRM es posible en
aproximadamente un 90% de los casos amplificando productos cortos de PCR, en el caso
de algunos SNPs los amplicones procedentes de las diferentes variantes homocigotas a
veces generan curvas de disociación con formas tan similares que son difíciles de distinguir
entre sí (Liew et al. 2004). En nuestra experiencia, incluso las variantes heterocigotas son a
veces difíciles de distinguir respecto a las variantes homocigotas. En cualquier caso, hemos
podido comprobar que la adición en todas las muestras de una cantidad conocida de ADN
tipo salvaje (“spiking”) ofrece una solución a dicho problema, asegurando una clara
discriminación entre las diferentes variantes genotípicas.
Además hemos podido comprobar que:
1.- Los cebadores no purificados por HPLC son óptimos para análisis de HRM.
2.- No es necesario purificar el producto HRM, obtenido con el reactivo LightCycler480
High Resolution Melting Master Mix (Roche), para la validación por Sanger.
3.- La adición a las muestras de una cierta cantidad de ADN de tipo salvaje claramente
mejora la discriminación de las diferentes variantes genotípicas.
Bibliografía
High Resolution Melting: Optimization Strategies. Technical Note No.1. ROCHE
A practical guide to High Resolution Melt Analysis Genotyping. Technical Note 6004.
2010 Bio-Rad Laboratories.
Beginners Guide to High Resolution Melt (HRM) analysis
M. Liew, R. Pryor, R. Palais, C. Meadows, M. Erali, E. Lyon, C. Wittwer, Genptyping of
single-nucleotide polymorphisms by high-resolution melting of small amplicons, Clin.
Chem. 50(7) (2004) 1156-64.