Adapted “Immunohematology Lessons Book by Marcelo Russo in 2013-14” prohibited press counsil reproduction rules editor of biology Only ISFDYT| Biología 4to – 20:30-22:00 Mier| Arg |Salto SISTEMA DE GRUPO SANGUÍNEO Rh Las circunstancias sobre el descubrimiento del sistema 004(ISBT) llevan aún hoy un vigoroso debate, en 1939, Philip Levine y Rufus E. Stetson describen un caso de enfermedad hemolítica del recién nacido en 1937, (pueden acceder al Primer trabajo Rh) pero no le dieron un nombre al anticuerpo detectado, era una paciente Mary Seno, si le hubieran puesto nombre al anticuerpo, así se llamaría en la actualidad el sistema. El sistema recibe el nombre casi desde el relato de una fábula: “El conejo y el mono” de la mano de los autores del hallazgo: Karl Landsteiner y Alexander Wiener en 1940, ellos describen anticuerpos producidos en los conejillos de indias que habían sido inyectados con glóbulos rojos de monos Rhesus, de allí su nombre (Les dejo un link para que lo conozcáis: quiero conocer el Monito ). En un momento se sugirió que el sistema había sido descubierto antes por Buchbinder en 1933, Richard Rosenfield quién se encargó de precisar el primer modelo genético y acuño la terminología, dijo en los años 70´ que Buchbinder era un estudiante graduado en el laboratorio de Landsteiner y sugirió que algunos de los anticuerpos con especificidades por el sistema que fueran luego reportadas por Landsteiner y Wiener habían sido antes demostradas por este joven en 1933. Adjunto el artículo original “Genetic Model for the Rh Blood-Group System” Proc. Nat. Acad. Sci. USA Vol. 70, No. 5, pp. 1303-1307, May 1973”. En la actualidad se han propuesto todo tipo de teorías sobre la historia del sistema que tomo el cuarto lugar en el listado de la ISBT. Si miramos hacia atrás vemos a Wiener en 1941 describiendo un antígeno C (rhC) presente en la mayoría de los Rh+ dijo él; el mismo año Levine describió el c (hrc), un antigeno presente en la mayoría de los Rh– decía; luego Race, Wiener and Sonn en 1943, reportaron el descubrimiento del antígeno E (rh²) presente en algunos Rh + particularmente, dicen si son Rh+, C– encuentran el antígeno E. Fue Fisher quien postuló que C and c eran antitéticos y Adapted “Immunohematology Lessons Book by Marcelo Russo in 2013-14” prohibited press counsil reproduction rules editor of biology Only ISFDYT| Biología 4to – 20:30-22:00 Mier| Arg |Salto que esa relación era independiente de D y E. En 1945, Mourant reportó el e (hr²) y lo anticipó como antitético del E. En 1975 Race y Sanguer publicaron finalmente un resumen sobre los cuatro antígenos principales del sistema C c E e. Nunca se pudo verificar la existencia de un antitético del D. Fishe y Race en 1943 ya propusieron lo existencia de tres loci o genes separados, pero estrechamente ligados en haplotipos en el mismo cromosoma y heredados en grupos de tres. Tal vez el aporte hacia la comprensión de la herencia (genética) y también en la manufactura de múltiples anticuerpos monoclonales dirigidos hacia epítopes del sistema resultaron y resultan las contribuciones más trascendentes del sistema 004; seguro aquellos aspectos referidos a la función biológica, formas variables y su vínculo con circunstancias patológicas, los avances en materia desarrollo de pruebas automatizadas de genotipado extendido en donadores y pacientes, pero la importancia en esta bendecida latitud Sur -al menos en Argentina- sigue teniendo su anclaje en el episodio que dio a luz al conocimiento de la capacidad de los anticuerpos del sistema por dar lugar a reacciones transfusionales, les recuerdo que fue una mujer que padeció una reacción transfusional grave, cuando recibió una transfusión con la sangre de su marido después del alumbramiento de un niño muerto con eritroblastosis fetal. Es entonces citable todavía nuestra preocupación sobre la prevalencia de enfermedad hemolítica fetal y neonatal por Anti-D, sigue siendo la principal indicación de fototerapia o de transfusiones en los recién nacidos. Mucho menor frecuencia tienen las reacciones transfusionales tardías de moderada intensidad, porque los protocolos transfusionales incluyen de manera ampliada pruebas que alcanzan el uso de suero antiglobulina por diversos métodos, y generalmente se selecciona para pacientes D negativos células rojas también D ausentes, aunque será un capítulo aparte verificar las pautas correctas para la selección de los reactivos aptos para la tipificación de pacientes, en contraposición a los útiles en donadores o recién nacidos. Las mujeres en edad reproductiva y niñas deben recibir transfusiones idéntico antígenos Rhesus como C, C, E y e, además del antígeno K reza la norma Alemana vigente desde el año 2000 (Richtlinien zur Gewinnung von und Blut und zur Blutbestandteilen Anwendung von Blutprodukten) Más sobre la Norma Alemana… nunca un paciente con anti-D debe recibir hematíes D positivos. Es importante reflexionar que el profundo conocimiento sobre el sistema Rh, ha permitido la toma de conciencia en los colegas y hasta en los pacientes, pero no se ha extendido aún en Argentina el cribado sistemático en los Bancos de Adapted “Immunohematology Lessons Book by Marcelo Russo in 2013-14” prohibited press counsil reproduction rules editor of biology Only ISFDYT| Biología 4to – 20:30-22:00 Mier| Arg |Salto Sangre en forma exclusiva, siendo el sector privado (laboratorios de bioquímica) quienes mediante técnicas no subordinadas a las normas específicas llevan adelante muchas veces dicha práctica inmunohematológica, llegando los pacientes a la situación de parto, sin haber sido estudiados conforme las guías perinatológicas acordadas. Herencia genética y bioquímica del sistema Desde 1960 hasta mediados de los años 80, la Prof. Patricia Tippett de Londres, junto a Ruth Sanguer y otros, describieron la teoría sobre la existencia de dos genes estrechamente relacionados: RDH y RHCE, y la base de mosaico de epítopes* y formas variantes. Colin observó la presencia exclusiva del gen RHCE en los negativos. Los antígenos principalmente se encuentran en dos proteínas Rhesus «RhD» y «RHCE». En la nomenclatura de CD, se denominan CD240D y CD240CE. Son polipéptidos de paso múltiple, acilados, palmitilados no glicosilados, de 417 aminoácidos con sus terminales NH2 y COOH orientados al citoplasma. A diferencia de las proteínas de otros grupos sanguíneos, las proteínas Rhesus se expresan sólo en las membranas de las células rojas de la sangre y sus precursores inmediatos. Los progenitores hematopoyéticos aislados de sangre de cordón tras cultivo de 9 a 10 días y en los fetos de 6 semanas ya hay productos de RHD. El sistema es uno de los más polimórficos e inmunogénicos conocido hasta ahora, en los seres humanos. En los últimos 20 años una intensa investigación ha dado como resultado la clonación de los antígenos C o c, junto con E o e, y el antígeno D. Posiblemente son proteínas transportadoras de cationes (Amonio), pueden funcionar como canal de gases de CO2. La situación Rh null se acompaña en ocasiones bajo la forma de estomatocitos#. Menos expresión de los antígenos del sistema encontramos, en pacientes leucémicos, con metaplasia mieloide, mielofibrosis y policitemia. Los genes que gobiernan el Rh también dan lugar a esferocitosis hereditaria. Algunos sujetos con débil expresión Rh en el sudeste de Asia presentan ovalocitosis. *(referido a: parte de una molécula que actúa como determinante antigénico; una macromolécula puede contener muy diferentes epítopes, cada uno de ellos capaz de estimular la producción de un anticuerpo específico) # (referido a: Invaginación central con forma de boca de los glóbulos rojos, hiperhidratación + la resistencia osmótica decreciente + incremento sustancial de escape de cationes monovalentes, en comparación con los controles, y Adapted “Immunohematology Lessons Book by Marcelo Russo in 2013-14” prohibited press counsil reproduction rules editor of biology Only ISFDYT| Biología 4to – 20:30-22:00 Mier| Arg |Salto una menor importancia de la función del escape para bajar la temperatura. Los frotis sanguíneos muestran un elevado porcentaje de estomatocitos bien formados. Se observa macrocitosis, concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM) baja y un elevado número de reticulocitos. La electroforesis revela que la proteína de membrana estomatina está ausente o presenta niveles muy bajos (Más sobre estomatocitosis video). En la actualidad hay 54 antígenos listados por la ISBT en el sistema 004, y un total de 7 obsoletos: 004013 (RhA) 004014 (RhB) 004015 (RhC) 004016 (RhD) 004024 (ET) 004025 (LW) 004038 (Duclos). En la nomenclatura desde esta cátedra vamos a basarnos en la descrita por Rosenfield, también aceptada por la ISBT, esto es que los haplotipos más heredados son: CDe para los sujetos R y cde, para los sujetos r. La letra R se refiere a la presencia del antígeno D (Ro, R1, R2 y ocasionalmente Rz ) y la presencia de la letra r siempre se refiere a la ausencia del antígeno D. El número 1 o la marca (´) se refiere a la presencia del C. El número 2 o la marca (“) se refiere a la presencia de E. A los haplotipos muy poco frecuentes que tienen C y E se les asignan las letras finales del alfabeto (y, z). Para los sujetos Rh positivo será: CCDEE, CCDEe, CCDee, CcDEE, CcDEe, CcDee, ccDEE, ccDEe y ccDee y para los sujetos con Rh negativo: CCdEE, CCdEe, CCdee, CcdEE, CcdEe, Ccdee, ccdEE, ccdEe y ccdee. Las reglas elementales para generar el genotipo probable a partir del fenotipo son: Determinar inicialmente los cuatro antígenos principales (C, c, E, e) y establecer el estatus D positivo o negativo. Si el sujeto es D negativo, se acepta que es “d d”. En ausencia de C, se anota c en cada haplotipo (c/c), si es CC se coloca C en cada uno (C/C), y si tiene C y c, se coloca C en el primer cromosoma y c en el segundo (C/c). Se inscribe la D en el mismo cromosoma donde está C, por ejemplo para heterocigoto C c: CD/cd. En presencia o ausencia de E, se anota e en cada cromosoma (e/e); E en cada cromosoma (E/E); Ee se anota E en el primero y e en el segundo. Se ubica la E en el mismo cromosoma donde está D, a menos que ya existe una C, se coloca e, en el otro cromosoma. El fenotipo CDe es más común que cDE y CDE. En la tabla anterior vemos las frecuencias del haplotipo cada 100 individuos, quiero que presten atención a la posibilidad de tener que transfundir un sujeto de raza negra con hematíes provenientes de un donador de raza caucásica y que piensen el riesgo de inmunizarlo para el antígeno C. Adapted “Immunohematology Lessons Book by Marcelo Russo in 2013-14” prohibited press counsil reproduction rules editor of biology Only ISFDYT| Biología 4to – 20:30-22:00 Mier| Arg |Salto El número de copias por células de los antígenos, varían dentro de cada fenotipo la tabla verde a continuación nos muestra la dispersión entre diferentes fenotipos, este rasgo resulta de utilidad a la hora de pensar en pruebas de semicuantificación relativa de anticuerpos “titulación”. Es natural que si a un mismo espécimen de suero con idiotipo c, lo someto a titulación con las células DcE/DcE no resultará el mismo título que si lo hago con las células Dce/dce. Los antígenos del grupo sanguíneo del sistema Rh son productos directos de los genes RHD y RHCE (colectivamente denominados RH30 o RHCDE), homólogos, estrechamente vinculados que residen en el cromosoma en el brazo corto del cromosoma 1, región 3, banda 4 sub-banda 11 (1p34-34.11). Son 10 exones los que componen ambos genes, con una secuencia genómica de 60,00069,000 pb, con una composición idéntica en el 97.8 % de la secuencia, con orientación opuesta, enfrentados en su posición 3´y separados por el Gen SMP1 quien dará hibridez RHD/RHCE, 31 a 35 aminoácidos de diferencian RhD de RhCcEe. A consecuencia de la supresión del gen RHD o alteraciones de otros involucrados, el potente inmunógeno D, no se expresa en un segmento relativamente importante de la población; es decir, el fenotipo RhD negativo es aproximadamente de 10% de la población. RHCE existe en cuatro formas alélicas y cada alelo determina la expresión de dos antígenos o una combinación: Ce, ce, cE o CE (RHCE es el nombre colectivo de los cuatro alelos). Cada uno de los genes (RHD) gen duplicado y RHCE (ancestral) contiene 10 exones y la longitud de secuencia de ADN es de aproximadamente 75kb. Otros genes también participan de las formas D, la expresión de la glicoproteína accesoria RhAG cuyo gen responsable RHAG es similar a las RhD organizada en 10 exones, con 36% de homología con la secuencia RHCE , pero se encuentra en un lugar separado del cromosoma 6p11-21. Adapted “Immunohematology Lessons Book by Marcelo Russo in 2013-14” prohibited press counsil reproduction rules editor of biology Only ISFDYT| Biología 4to – 20:30-22:00 Mier| Arg |Salto Entre los productos químicos de de RHAG encontramos Banda 3 (AE1) vemos la expresión del antígeno Diego es una proteína de multipaso (14 veces) e interviene como intercambiador de aniones-solutos y CO2; la Glicoproteína Duffy (antígenos Fy, DARC); la Glicoproteína A y B (GPA, GPB) antígenos del sistema MNS, que participa de la glicosidación de la membrana desde el REL y Golgi; los productos antigénicos LW (Landsteiner-Wienner); una proteína de un solo paso también llamada ICAM-4 y la CD47 (IAP) proteína de paso múltiple que participa del transporte de calcio. Y otro gen SMP1 de 30,000 pb sin relación funcional con ambos genes, pequeña proteína de membrana que tiene 94% de homología Rh boxes da lugar a procesos de hibridización de la molécula RHD en RHCE y viceversa. Las proteínas del Rh están confinadas a los vertebrados superiores, sin embargo, se tiene identificado un gen parecido al RhAG en nemátodos y esponjas marinas. Se ha demostrado RhAg en el ratón, macaco, chimpancé, gorila, orangután, gibón, babón, monos del nuevo mundo. Como en los homólogos invertebrados, el RH parece provenir de una antigua duplicación del gen probablemente ocurrida hace 250 a 340 millones de años, que provocó la divergencia entre RHAG y RH para posteriormente continuar por distintas vías evolutivas. Un segundo evento de duplicación originó el gen RHCE, el cual se duplicó y generó al gen RHD. El primer evento ocurrió en un primate ancestral hace 5 a 12 millones de años. Basados en la tasa evolutiva de los genes RHAG y del RHD en diferentes especies, parece que el Gen RHAG es 2.6 veces más lento que el RHD, lo cual sugiere que el RHAG tiene mayor importancia funcional que las proteínas del RHD. El primer haplotipo fue cDe y los otros siete más comunes provinieron de este gen complejo en eventos genéticos simples o únicos. En los caucásicos el haplotipo cde es originado por deleción del gen RHD, mientras que el haplotipo Cde proviene de la conversión del gen RHD en los exones 1 y 2, reemplazando a los mismos exones del gen RHCE en los sitios de codificación de ce. Los restantes fenotipos son mutaciones puntuales (polimorfismo E/e) o la rara combinación de haplotipos. Los exones son críticos para los epítopes D1, D2, D5, D6-7 y D8. El gen RHD esta flanqueado a ambos lados por dos segmentos de ADN de 9000 pb, llamados caja Rhesus. Los exones 1 y 2 del gen RHCE codifican la expresión Cc. En sentido inverso la secuencia de codificación es CcE. Los productos químicos de ambos genes son proteínas integrales de Adapted “Immunohematology Lessons Book by Marcelo Russo in 2013-14” prohibited press counsil reproduction rules editor of biology Only ISFDYT| Biología 4to – 20:30-22:00 Mier| Arg |Salto membrana eritrocitaria, que muestra una topología de hélice de transmembrana; con un pasaje de 12 veces. Los 30 polipéptidos, sitios palmíticos y sus epítopes se definen por cinco aminoácidos específicos situados en los bucles extracelulares. Rh50 es N-glicosilasa en un sólo sitio con Asn37. El rol biológico del sistema, se asocia a la mantención de la integridad de la membrana eritrocitaria y una función de transporte de amonio. Además, en un estudio de las algas verdes mostraron que las proteínas Rh pueden funcionar como un canal de gases de CO2 La expresión de RHAG no se limita a los tejidos eritrocitarios, los productos homólogos se expresan en el riñón, hígado, piel, testículos y en el cerebro. La expresión de proteínas Rh y RhAg ocurren temprano, durante la diferenciación eritropoyética. Esto es comprobable viendo como el anti-D se une aproximadamente al 3% a la BFU-E (Unidad formadora eritroide), y el 68% a la CFU-E (unidades formadoras de colonias de eritrocitos) y a todas las células eritroides más maduras. Sin embargo, la unión de Anti-D a proeritroblastos, eritroblastos basófilos, policromatófilos eritroblastos y eritroblastos es respectivamente, 25%, 50%, 66%, y 75% en comparación con la proteína madura. RhAg es detectables en progenitores CD34 aislados de sangre de cordón umbilical, después del cultivo de 3 a 5 días, mientras que RhCcEe aparece después de 5 a 7 días y RhD aparece después de 9 a 11 días de cultivo. En el feto, los antígenos Rh se expresan en los glóbulos rojos a la 6° semana de gestación. La familia de proteínas Rh tienen aproximadamente un 20% de homología con la permeasa metilamina (MEP) y los transportes de amonio (AMT) de las levaduras, las bacterias y plantas simples. Los animales superiores usan nitrógeno y eliminan los amonios tóxicos a través del ciclo de la urea y de transporte, en forma de glutamina y alanina. El papel del complejo Rh como transportador de amonio está aún poco definido, pero es seguro que el complejo co-transporta amonio junto con otros cationes. Adapted “Immunohematology Lessons Book by Marcelo Russo in 2013-14” prohibited press counsil reproduction rules editor of biology Only ISFDYT| Biología 4to – 20:30-22:00 Mier| Arg |Salto Proteínas accesorias dependientes de RHAG La Glicoproteína LW también llamada ICAM-4 es una proteína de un solo paso (tipo I), con homología a las moléculas de adhesión intercelular (ICAM), que son ligandos para B2 integrinas (Imagen Daniels, 2002) LW se ha informado que es un ligando para la integrina LFA-1. La glicoproteína está ausente en los glóbulos rojos en sujetos LW (a-b-) y las personas Rhnull; mientras que en los primeros la expresión de los antígenos Rh es normal en los glóbulos rojos. Los Antígenos LW son más abundantes en sujetos D-positivos. Se interpreta que es posible que la glicoproteína LW interacciona preferentemente con el Rh, en comparación con RhCcEe; sin embargo, la naturaleza de tal interacción aún espera definición. Curiosamente, los antígenos LW se expresan igualmente bien en glóbulos rojos D positivos o negativos de los fetos y de los recién nacidos, y con más fuerza que en los glóbulos rojos adultos. La IAP es una integrina asociada a proteína, que está presente en la membrana del glóbulo rojo, donde pasa 5 veces y tiene 6 potenciales N-glucano. Lleva antígenos ABH, pero no es reconocida por dichos antígenos de grupo sanguíneo. Se produce como isoformas diferentes en los tejidos donde se une a B3 integrinas. La isoforma de IAP en los glóbulos rojos puede estar implicada posiblemente en el transporte de calcio, puesto que el transporte se reduce en las membranas de los glóbulos rojos Rhnull y D - pero se encuentra normal en la línea linfoblastoide de las personas. La Glicoforina también llamada GPB es una sialoglicoproteína de membrana de tipo I que tiene varios O-glicanos pero no N-glucano. El complejo de Rh parece ayudar a la expresión pero no es esencial para la inserción correcta de ésta a la membrana del glóbulo rojo. En los glóbulos rojos S-s-U- donde falta GPB, las proteínas del Rh son de apariencia normal, pero aumenta la glicosilación RhAg, lo que sugiere un ritmo más lento de migración a través del retículo endoplásmico y aparato de Golgi. La intaracción de RhAg y GPB es necesaria para la plena expresión del antígeno U y en menor medida S y s. La Glicoproteína Fy (Duffy, DARC) posee asociación con el complejo de Rh, la misma se muestra a través de los sujetos portadores del antígeno Fy5, que está ausente en los sujetos (a-b-) y Rhnull. Sin embargo, los glóbulos rojos Rhnull son Fya normal, y poseen Fyb, Fy3 y Fy6. La otra parte los Fy (a-b-) tienen antígenos Rh normales. Adapted “Immunohematology Lessons Book by Marcelo Russo in 2013-14” prohibited press counsil reproduction rules editor of biology Only ISFDYT| Biología 4to – 20:30-22:00 Mier| Arg |Salto La Banda 3 cuyo sinónimo es AE1 representa la función de intercambiador de aniones-soluto. La proteína pasa a través de la membrana de los glóbulos rojos de 12 a 14 veces y es el principal transportador aniónico. Esta proteína es aparentemente normal en los glóbulos rojos Rhnull; su reducción produce ovalocitosis. El defecto molecular que se presenta generalmente en Asia Oriental, se analiza por la supresión de un segmento de ADN, que codifica 9 aminoácidos situados en el límite de la N-terminal citoplasmático y en el dominio de la membrana de la Banda 3. El poliformismo RH C/c y RH E/e es causado por sustituciones de nucleótidos en RHCE, son en total 6 sustituciones de nucleótidos que causan 4 cambios de aminoácidos (Cys16Trp, IIe60Leu, Ser68Asn y Ser103Pro), están asociados con el poliformismo C/c sólo Ser103Pro). Sin embargo, la Pro102 parece ser una parte fundamental del antígeno c; por la presencia de 2 residuos adyacentes de prolina (102 y 103) se espera formar una estructura relativamente rígida, resistente a los cambios. Esto explica el número relativamente bajo de las variantes C, en comparación con otros antígenos Rh. Se acepta que una sola sustitución de nucleótido es suficiente para la expresión del poliformismo E/e (Pro226Ala). La presencia de Val en el residuo 245 en lugar de Leu, provoca una supresión de Arg en el aminoácido229 o la presencia de Cis (en lugar de Trp) en el aminoácido 16 de residuos, que afecta la expresión del antígeno “e”. Se han determinado la base molecular de los antígenos de E parcial en 4 categorías I, II y III, y el tipo de DVIII. En la tabla de la página anterior se ven los 8 haplotipos, 64 combinaciones posibles que dan lugar a 18 fenotipos probables. Antígeno G Las proteínas Rh y RhC llevan el antígeno G, que se asocia con residuos en el segundo bucle extracelular codificado por el exón 2. Este antígeno está casi invariablemente presente en los glóbulos rojos (GR) que poseen C o D. No fue detectado por todos los monoclonales anti-G. Por lo tanto, parece que el antígeno G es dependiente de la conformación y no solo depende del segundo dominio externo de RHC (E/e) o las proteínas Rh. Los anticuerpos que lo detectan parecen ser anti- CD pero la actividad anti-G no puede ser separada en anti-C + anti-D. Las personas D negativas a veces parecen haber producido ambos anticuerpos. Hay eritrocitos G - en raros casos- que carecen del antígeno D y muestran una expresión débil o ausente de C (--eG). Adapted “Immunohematology Lessons Book by Marcelo Russo in 2013-14” prohibited press counsil reproduction rules editor of biology Only ISFDYT| Biología 4to – 20:30-22:00 Mier| Arg |Salto D Variantes Los fenotipos Rh variante surgen a través, de al menos, 4 mecanismos: (1) Reordenamiento del RHCE dispuestos en tándem y/o dirección a la derecha. (2) Mutación puntual (s) en cualquier gen que causa cambio de aminoácido (s), con la consiguiente pérdida de algunos epítopes y/o la expresión de un antígeno de baja incidencia. (3) Mutaciones sin sentido. (4) Supresión de nucleótidos causando la lectura de un codón de parada prematuro. En la imagen (página anterior), tan popular de Willy A. Flegel (Institut für Klinische Transfusionsmedizin und Immungenetik Ulm und Insti tut für Transfusionsmedizin,Universitätsklinikum Ulm, Germany) Las sustituciones de aminoácidos se distinguen como las RhD desde la proteína RHCE que se muestran en amarillo, con los cuatro aminoácidos que codifican para el antígeno C en verde y la que codifica la proteína E en negro. Las sustituciones de aminoácidos individuales que codifican para D parcial están en azul, y aquellos que codifican para D débil están en rojo. Las mutaciones, identificadas por el grupo de Ulm, están en azul claro y naranja. Los antígenos D Parcial fueron identificados por la prueba clásica con anticuerpos policlonales, producto de inmunizaciones de personas D parcial, con distintos fenotipos. En la actualidad son muchos los anticuerpos monoclonales que están siendo utilizados para clasificar los antígenos D y sus variantes. Un listado de las líneas monoclonales que probé en el centro queda exhibido. El modelo molecular original constaba de 8- 9 epítopes (EPD), pero se ha ampliado hasta consistir en más de 37 epítopes. Adapted “Immunohematology Lessons Book by Marcelo Russo in 2013-14” prohibited press counsil reproduction rules editor of biology Only ISFDYT| Biología 4to – 20:30-22:00 Mier| Arg |Salto Cuando se utiliza anticuerpos monoclonales anti-D para definir epítopes D, es importante realizar las pruebas en el pH correcto, la temperatura, la fuerza iónica y la concentración adecuadas. de anticuerpos, Se deben utilizar GR que han sido almacenados apropiadamente e incluir los controles. La mayoría de los epítopes D son de conformación, y pueden estar influenciados por otras proteínas y lípidos de la membrana del GR. Las predicciones en cuanto a la ubicación de diferentes epítopes D, se hacen sobre la base de que ciertos epítopes ausentes de hallan en los GR D parcial de base molecular conocida. Sin embargo, la ausencia de un etítope D no siempre puede ser un resultado directo del cambio en la estructura molecular y la presencia de proteínas codificadas. Por ejemplo, R0Har y DVA no tienen ningún exón en dirección a la derecha común; entonces se solapan con la reactividad de los anticuerpos monoclonales, lo que demuestra la dificultad de definir correctamente la base molecular de epítopes. Datos recientes sostienen que al menos algunos epítopes D son espacialmente diferenciados. Sin embargo, aún no se ha observado el impacto de los aminoácidos, que se encuentran dentro de la bicapa lipídica o en el lado citoplamático de la membrana del GR. La determinación exacta de los puntos de contacto de interacción entre el antígeno y el anticuerpo se encuentra en espera de datos cristalográficos confirmatorios. Adapted “Immunohematology Lessons Book by Marcelo Russo in 2013-14” prohibited press counsil reproduction rules editor of biology Only ISFDYT| Biología 4to – 20:30-22:00 Mier| Arg |Salto Las variantes DVI definidas por la serología son más abundantes en la raza blanca, en nuestro laboratorio corresponde a un sesgo de 6-10% de todos los resultados que han dado débil o irresuelto por pruebas tradicionales, siendo en la población la frecuencia mucho menor 0.020.05%. La mayoría se ha presentado por la existencia de anticuerpos anti-D en pacientes D positivos una vez descartado el fenómeno autoinmune. Las variantes se producen en tres categorías: reemplazando exón 4 y 5 de RHD por exón 4 y 5 de RHCE en el tipo I; agregando el exón 6 de RHCE en el tipo II y el exón 3 al 6 reemplazados por RHCE en el tipo III. El número de antígenos por célula en el tipo I varían desde 500 cpc, a 2400 en el tipo II y hasta 12000 para el tipo III. Variantes débiles La expresión del D débil no constituye una variante única. corresponde generalmente a la expresión antigua llamada Du. Vemos en la imagen como puntos rojos (los azules serían parciales) Existen una importante cantidad de poliformismos (más de 19 en el 2009) que se relacionan con esta expresión. Por ejemplo, un umbral se ponderó sobre aquellos sujetos que poseen menos de 400 sitios antigénicos, pero estos individuos “D-Débiles” pueden inmunizarse y formar anti-D luego de la exposición de a antígenos D normales. Se ha observado que la sustitución de aminoácidos en la variante D débil, se puede localizar en los segmentos de proteínas de transmembrana e intracelulares; así como en 4 regiones de la proteína (aminoácidos en la posición 2 a 12, alrededor de la 149, así como los aminoácidos 179 a 225 y los aminoácidos 267 a 397). Esto indica que los sujetos con fenotipo D débil, si bien no en todos, se debe a una alteración cuantitativas de la proteína RhD. En resumen, cuando decimos D débil nos referimos a un tipo de variante donde se halla expresado el antígeno D en forma anormal respecto de otro D “normal”; generalmente desde el punto de vista cuantitativo, puesto que han ocurrido sustituciones de simples aminoácidos con el consecuente cambio en la presentación química, pero las modificaciones ocurren a diferencia de los D parciales, en su porción citoplasmática e intramembranosa. Es difícil de asumir, pero se han publicado casos (escasos) de inmunización de sujetos D débil(D17) a causa de D-normales. Testeo de antígeno D PACIENTES vs DONANTES En este párrafo vamos a tratar de aunar los criterios de las guías internacionales, la muestra en el caso de tipificar pacientes u obstétricas debe diferenciarse respecto de los donadores o recién nacidos. En el primer caso, las pruebas deben ser simples o pruebas en duplicado si no se realizan por métodos automáticos y en cualquier caso se deben emplear reactivos con anti-D IgM Adapted “Immunohematology Lessons Book by Marcelo Russo in 2013-14” prohibited press counsil reproduction rules editor of biology Only ISFDYT| Biología 4to – 20:30-22:00 Mier| Arg |Salto monoclonales que no detecten la presencia de variantes DVI. En el caso de realizarlo por duplicado cabe hacerlo con dos anticuerpos monoclonales diferentes que reúnan las condiciones antes dichas. para el tipificado del antígeno. Si las pruebas tienen como propósito la transfusión hay que evitar llevarlas a fase antiglobulínica, los anticuerpos anti-D actuales son lo suficientemente potentes para poner en relieve ejemplares débiles del D y si sometemos a un ensayo antiglobulínico se corren otros riesgos: (D positivo) a causa de PAD (positiva), o pruebas D (variantes parciales) tipificadas como D (positivas). En el caso de los pacientes plausibles de recibir transfusión y de los pacientes gestantes se deberá emplear un reactivo incapaz de determinar las variantes débiles, parciales y débiles-parciales, para evitar que dicha población se ponga en riesgo asumiendo que representan sujetos D positivos. Tampoco se recomiendan reactivos que requieran la prueba antiglobulínica, sino los monoclonales anti-D categorizados como DVI negativos. En el caso de tipificar la población dadores y recién nacidos se debe emplear el reactivo capaz de detectar las formas variantes del antígeno, empleando al menos dos líneas monoclonales que detecten la variante DVI. La fase antiglobulínica podrá o no ser empleada siguiendo estrictamente las recomendaciones del fabricante. En algunos países se emplea igualmente el reactivo de las obstétricas DVI- en los recién nacidos, porque no hay suficientes casos de Recién Nacidos documentados como DVI sensibilizando madres D negativas, y recomiendan no cambiar el reactivo para no cometer errores, utilizando el incorrecto luego con las pacientes obstétricas. Son variadas las situaciones en las que pueden aparecer resultados inesperados o difíciles de interpretar. Su resolución puede requerir el simple cambio de un reactivo por otro o la utilización de protocolos realmente diferenciales. El advenimiento de reactivos cada vez más específicos y la claridad sobre su empleo, evitan en la actualidad, la propagación de un mayor número de casos con resultados discrepantes en las pruebas de tipificación D. Sigue siendo condicionante de una buena práctica la observación de ciertas variables Variable Anticuerpos fijados en vivo o C3. Autoaglutinación. Expresión débil del antígeno (no variante) Doble población celular. Error técnico. Calidad del reactivo. Solución DAT- elución. Lavados – tratamiento Tiol. Adsorción proteolítica. Investigación de mosaicísmo. Revisar los protocolos. Control de calidad. La expresión débil del antígeno –no D variante-. Puede obedecer a un simple aspecto regular de la herencia mendeliana; por ejemplo en las personas de raza negra como dijimos, tiene lugar el fenotipo cDe, al someter un reactivo anti-D en Adapted “Immunohematology Lessons Book by Marcelo Russo in 2013-14” prohibited press counsil reproduction rules editor of biology Only ISFDYT| Biología 4to – 20:30-22:00 Mier| Arg |Salto forma directa a los hematíes, suele resultar una prueba débil que amerita su potenciación con reactivos antiglobulina. Otro ejemplo de debilitamiento de la expresión, es el llamado efecto de posición, ejerciendo el Gen RHC en posición Trans la supresión sobre el Gen RHD en el cromosoma opuesto, así los GR CDe/Ce presentarán una expresión debilitada de D. Por ejemplo los genotipos CDe/ce y CDe/Ce codifican para los mismos antígenos, pero las células son más D débiles en el segundo caso. IMPORTANTE: (1) Se debe suprimir los términos D débiles, D parcial, Du para mencionar los hallazgos serológicos en pacientes y donantes en informes. Pues los sujetos deben conocer su estatus D, llamándolos D positivos o D negativos, sin importar como hallamos nosotros (profesionalmente) arribado a la conclusión. (2) Jamás deben emplear reactivos que empleen la fase antiglobulina en pacientes u obstétricas, sobre todo si son únicos. (3) En donantes y neonatos siempre se deben emplear el uso de anticuerpos monoclonales provenientes de al menos dos líneas celulares diferentes y que permitan detectar la variante DVI (de ser posible en un paso). (4) De hallar una paciente femenina con una variante débil o parcial se debe aplicar la profilaxis D (aunque con los métodos indicados en 2 no deberíamos distinguirlas, a todas ellas las consideraremos D negativas) (5) Siempre contar con la colaboración de un laboratorio de referencia capaz de resolver discrepancias D.