Transcripción en eucariotas

Tema 8. Funcionamiento del DNA (I)
Genética CC. Mar 2004-05
Objetivos
• Transcripción
• RNAs y procesamiento
Genética CC Mar 2004/5 • D. Posada, Universidad de Vigo
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1
Dogma Central de la Biología
Molecular
Transcripción
Traducción
• DNA ⇒ RNA ⇒ proteína
• Transcripción seguida de
traducción
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Nucleótidos RNA
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2
Cadena RNA
La cadena del RNA se parece
a una cadena única de DNA,
ya que esta formado por un
esqueleto de azúcar–fosfato,
con un base ligada a la
posición 1’ de cada ribosa. Las
uniones azúcar–fosfato se
realizan entre las posiciones 5’
y 3’ del azúcar, como en el
DNA, por lo que la cadena del
DNA tiene un extremo 5’ al
principio y otro 3’ al final.
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RNA versus DNA
1. El RNA es de cadena única, por lo que es más flexible y puede
adoptar estructuras complejas, incluso intramoleculares.
2. El RNA utiliza como azúcar la ribosa en vez de la desoxirribosa. La
ribosa contiene un grupo OH (hidroxilo) en el carbón 2’, mientras que
el DNA tiene una H en esa posición.
3. Los nucleótidos de RNA (ribonucleótidos) contienen las bases
adenina, citosina, guanina, como el DNA, pero contienen uracilo en
vez de timina. El uracilo puede formar enlaces de hidrógeno con la
adenina, tal como la timina.
4. El RNA puede catalizar importante reacciones biológicas. Los RNA
que funcionan como enzimas se denominan ribozimas.
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Tipos de RNA
•RNA mensajero (mRNA): codifica la secuencia aminoacídica de una
proteína. Los mRNAs son los tránscritos de los genes codificadores,
también llamados genes estructurales.
•RNA transferente (tRNA): transporta los aminoácidos a los ribosomas
durante la traducción.
•RNA ribosomal (rRNA): constituye los ribosomas al unirse a las
proteínas ribosómicas. En los ribosomas el mRNA se traduce en
proteínas.
•RNA pequeño nuclear (snRNA): forma junto a determinadas
proteínas los complejos moleculares utilizados en el procesamiento del
RNA eucariótico.
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Transcripción en procariotas
• La transcripción es la síntesis de una copia de
RNA a partir de un segmento de DNA.
• El RNA es sintetizado por la enzima RNA
polimerasa (o transcriptasa). En procariotas,
una única RNA polimerasa cataliza este
proceso. Esta enzima no necesita cebadores
para iniciar la transcripción y carece de
habilidades de corrección de errores.
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Transcripción en procariotas
• La RNA polimerasa desenrrolla la doble hélice de
DNA al principio del gen. Sólo una de las dos hebras
de DNA, la 3’-5’, se transcribe en RNA, por lo que el
RNA se sintetiza en dirección 5’-3’.
• Los precursores del RNA son los ribonucleósidos
trifosfato ATP, CTP, GTP y UTP.
• La RNA polimerasa selecciona el siguiente nucleótido
de la cadena de RNA que debe añadirse según las
base expuesta en la cadena de DNA, por las reglas de
apareamiento de bases:
DNA 3’-ATACTGGAC-5’
RNA 5’-UAUGACCUG-3’
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Estructura del gen procariota
Caja (-35)
5’-TTGACA-3’
Caja Pribnow (-10)
5’-TATAAT-3’
• Promotor: es una secuencia situada, corriente arriba de la secuencia
codificadora de RNA, que interactúa con la RNA polimerasa. Asegura
que la transcripción comienza siempre en el mismo sitio.
• Secuencia codificadora: es la secuencia de DNA que será transcrita en
RNA por la RNA polimerasa.
• Terminador: es una secuencia situada corriente abajo de la secuencia
codificadora de RNA que especifica dónde termina la transcripción.
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Iniciación y elongación de la
transcripción en procariotas
El factor sigma es
esencial para
reconocer las
regiones -10 y -35
del promotor.
La transcripción
produce 30-50
nucleótidos por
segundo.
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Terminación de la transcripción en
procariotas
• Secuencias terminadoras señalizan la
terminación
– Dependientes de rho
– Independientes de rho (figura)
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Transcripción en eucariotas
Molécula
Localización
RNA que sintetiza
RNA polimerasa I
RNA polimerasa II
RNA polimerasa III
nucleolo
nucleoplasma
nucleoplasma
28S rRNA, 18S rRNA, 5.8S rRNA
mRNA, snRNAs
tRNA, 5S rRNA, snRNAs
Sensibilidad a la
–amanitina
Menor
Mayor
Intermedia
• Hay varias polimerasas
• Los tránscritos han de ser procesados para ser
funcionales
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Transcripción de genes codificadores por
la RNA polimerasa II en eucariotas
• Precursor del mRNA (pre-mRNA)
• Promotores:
– Basales: caja TATA (–25, TATAAAA), señala el
punto exacto de iniciación de la transcripción.
– Proximales: caja CAAT (–75) y caja GC (–90,
GGGCGG), contribuyen a la orientación de la
RNA polimerasa.
• Factores basales de transcripción (TFs) (p.e.,
TFIID)
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Ensamblaje del complejo de
preiniciación (PIC)
1.TFIID (subunidad de unión a la caja
TATA (TBP) + factores asociados a la TBP
(TAFs)) se une a la caja TATA para formar
el complejo comprometido inicial.
2.El complejo TATA-TFIID actúa como sitio
de unión para la TFIIB.
3.Se unen la RNA polimerasa y el factor
TFIIF, formando el complejo mínimo de
iniciación de la transcripción.
4.Los factores TFIIE y TFIIH se unen
formando el complejo completo de
iniciación de la transcripción, también
llamado complejo de preiniciación (PIC).
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Transcripción de genes codificadores
por la RNA polimerasa II
• Los activadores son TF que se unen
a secuencias intensificadoras para
estimular la transcripción.
• Los intensificadores (“enhancers”)
se encuentran en copia única o en
múltiples copias. Suelen situarse
corriente arriba, pero también
corriente abajo, en el mismo gen.
Pueden estar a miles de pb del gen que
controlan. También hay
intensificadores en procariotas,
siempre cerca de los promotores.
• Los represores son TF que se unen a las secuencias silenciadoras para
reprimir la transcripción.
• Los activadores y los represores son específicos de célula y tejido, de forma
que son responsables de las diferencias de expresión génica en diferentes
células y tejidos.
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mRNA eucariota
• Secuencia líder (5’UTR)
• Secuencia codificadora: especifica la secuencia aminoacídica
de la proteína codificada por el gen.
• Secuencia trailer (3’UTR): puede contener información que
señala la estabilidad de un mRNA particular.
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Procesamiento RNA procariotas
versus eucariotas
1º tránscrito de RNA
Transcripción + Traducción
Genes codificados (cistrones)
Procariotas
RNA maduro
Acopladas
Uno o varios (policistrónicos)
Eucariotas
pre-mRNA
Separadas
Uno (monocistrónicos)
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Maduración mRNA eucariota
• Encaperuzado 5’
• Cola poli(A)
• La región codificadora contiene regiones
regiones codificantes (exones) y no
codificantes (intrones) => SPLICING
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Maduración mRNA eucariota
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Encaperuzado 5’
• Encaperuzado 5’: Una vez que la
RNA polimerasa ha sintetizado
20-30 nucleótidos de pre-mRNA,
una enzima caperuzadora añade
un nucleótido de guanina. Los
azúcares de los dos siguientes
nucleótidos también son
metilados.
• La caperuza 5’ estará presente en
el mRNA maduro, ya que es
esencial para que el ribosoma se
una el extremo 5’ del mRNA en
el paso inicial de la traducción.
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Cola poli(A)
• Cola poli(A): Adición de 50-250
nucleótidos de adenina por una
enzima. Estabilizar el mRNA.
• En eucariotas no hay secuencias de
terminación, la transcripción pasado
el sitio poliA cientos o miles de
nucleótidos.
• Más tarde se produce un corte en el
sitio poliA y la adición de la cola
poli(A).
Adición de poli(A) en mamíferos
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Corte y empalme del mRNA
(“mRNA splicing”)
•
Los intrones típicamente
empiezan por 5’GU y
acaban con AG’3
1.
2.
Corte intrón 5’
Lazo entre el extremo 5’
libre del intrón y una A de
la secuencia del punto de
ramificación del intrón
Corte intrón 3’
Ligamiento de los exones
3.
4.
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Spliceosoma
Spliceosomas: pre-mRNA + partículas nucleares pequeñas de
ribonucleoproteínas (snRNPs). snRNPs = snRNAs + 6-10 proteínas.
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Splicing alternativo
Splicing alternativo de la alfa-tropomosina
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Edición del RNA
• La edición del RNA consiste en la modificación del RNA maduro
después de la transcripción
• La edición del RNA debe de hacerse con precisión -> guía del
RNA (gRNA)
• Muchas secuencias de mRNA de mitocondrias y cloroplastos en
plantas son editadas (C-a-U).
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Ribosomas
• Ribosoma procariotas (E.coli) 70S
– Subunidad 50S: 23S rRNA + 5S rRNA + 34 proteínas
– Subunidad 30S: 16S rRNA + 20 proteínas
• Ribosoma eucariotas (mamíferos) 80S
– Subunidad 60S: 28S rRNA + 5.8S rRNA + 5S rRNA + ~50 proteínas
– Subunidad 40S: 18S rRNA + ~35 proteínas
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Transcripción de genes rRNA en
procariotas
• Unidades de transcripción
de rRNA (rrn): 16S-23S5S, con espaciadores
internos (IS)
• RNA polimerasa -> prerRNA (líder + 16S-23S-5S
con IS + trailer)
• El pre-RNA se asocia con
proteínas ribosomales
• RNAasa III corta el preRNA -> precursores 16S,
23S y 5S
• Enzimas -> 16S, 23S y 5S
maduros
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Genes rRNA en eucariotas
• Unidades repetitivas del rRNA en tándem (100 o 1000 veces)
–
–
–
–
NTS-ETS-18S-ITS-5.8S-ITS-28S-ETS
Espaciador no transcrito (NTS)
Espaciador externo (ETS)
Espaciador interno (ITS)
• Como resultado de la transcripción se forman nucleolos alrededor de
estas unidades, que llegan a producir 103 - 106 ribosomas
• 5S se sintetiza en otros genes
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Transcripción rRNA en eucariotas
• RNA polimerasa I ->
pre-rRNA.
• El procesamiento del
pre-rRNA tiene lugar en
complejos formados por
el pre-rRNA, 5S rRNA y
proteínas ribosómicas.
Figura. Transcripción y procesamiento del rRNA eucariota en células humanas
– Se elimina primero la
5’ ETS.
– Se divide el nuevo
precursor en dos
moléculas precursoras
que darán lugar al 18S
rRNA por un lado, y al
28S y 5.8S por el otro.
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Transcripción 5S rRNA en eucariotas
• RNA polimerasa III
• Se inicia al ligarse los
factores de transcripción al
promotor, región control
interna (ICR), que se
encuentra dentro de la región
transcrita.
• La transcripción del 5S
produce directamente 5S
maduros.
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Auto corte y empalme (“auto-splicing”)
• Algunos genes rRNA presentan
intrones
• El pre-rRNA se pliega formando una
estructura secundaria que promueve
la eliminación del intrón:
1.El intrón es cortado en su extremo
5’, al que se le añade una guanina
2.El intrón es cortado en su extremo 3’
3.Se ligan los dos exones
4.El intrón escindido forma un lazo, y
se corta produciéndose además una
pequeña molécula lineal
• RNA catalíticos o ribozimas
• Origen de la vida ¿DNA? ¿RNA?
Auto corte y empalme (“auto-splicing ”) de intrones en el 28S pre-rRNA de Tetrah ymena
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RNA transferente (tRNA)
• Los tRNAs adquieren una forma de trébol al aparearse bases complementarias
en diferentes regiones de la molécula.
• Se distinguen 4 tallos (”stems”) separados por 4 lazos (“loops”).
• El lazo II, o lazo anticodón, contiene los tres nucleótidos del anticodón que se
emparejarán con los tres nucleótidos de un codón determinado en el mRNA
durante la traducción.
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Transcripción tRNA
• RNA polimerasa III ->
pre-tRNA
• Copia única
(procariotas) o múltiple
(eucariotas)
• Todos acaban en CCA
• Promotores internos
• Algunos genes tRNA
eucariotas presentan
intrones
tRNA.Tyr
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Transcriptasa inversa
• mRNA ⇒ cDNA
• En retrovirus
• Sin actividad
exonucleásica 3’-5’
• Ingeniería genética
(rt-PCR)
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