Identificación y Serotipificación de Salmonella spp.

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Identificación y Serotipificación de
Salmonella spp.
IV Curso de Capacitación del Programa WHO Global
Salmonella Surveillance – América Central
San José de Costa Rica (Costa Rica) – 27 de abril al 2 de Mayo de 2009
Dra. María Inés Caffer
Servicio Enterobacterias
Departamento Bacteriología
INEI – ANLIS “Dr. Carlos G Malbrán”
Característica Microbiológicas
del Género Salmonella
El género Salmonella pertenece a la Tribu
Salmonelleae, de la Familia Enterobacteriaceae.
Los miembros del género Salmonella son bacilos
gram-negativos, de 0,7-1,5 x 2,0-5µm, generalmente
móviles por flagelos perítricos (excepto S. Gallinarum),
anaerobios facultativos, no esporulados.
Taxonomía del Género Salmonella
El Género Salmonella comprende 2 especies:
Salmonella enterica que se divide en 6 subespecies:
Salmonella enterica subespecie enterica (I)
Salmonella enterica subespecie salamae (II)
Salmonella enterica subespecie arizonae (IIIa)
Salmonella enterica subespecie diarizonae (IIIb)
Salmonella enterica subespecie houtenae (IV)
Salmonella enterica subespecie indica (VI)
Salmonella bongori (V)
Nomenclatura del Género Salmonella
Únicamente las serovariedades de Salmonella enterica subespecie enterica
( que costituyen más del 99,5 % de los aislamientos de Salmonella) se
designan con un nombre, relacionado con el lugar geográfico donde se aisló la
primera cepa de la nueva serovaridad.
Este nombre se escribe con letras romanas, no en itálica y la primer letra va
con mayúscula.
Ej. Salmonella Typhimurium; Salmonella Oran
Las serovariedades pertenecientes a las subespecies restantes de
Salmonella enterica y a Salmonella bongori (muy escasas en patología
humana y veterinaria) se designan con el nombre de la subespecie, seguido
de la fórmula antigénica.
Ej. Salmonella IV 50 : b : - y Salmonella IV 44 : a : -.
Los nombres de todas las serovariedades están contenidos en el Esquema de
Kauffmann-White, publicado por el “Centro Colaborador de la OMS de
Referencia e Investigación de Salmonella”, del Instituto Pasteur de París.
Técnicas de aislamiento,
identificación y caracterización de
Salmonella spp.
Flujograma de Aislamiento, Identificación y Caracterización de
Salmonella spp. a partir de materia fecal
MATERIA FECAL (HISOPO)
Suspensión en
solución fisiológica
1er. día
Aislamiento en medios selectivos y
diferenciales
Caldo de enriquecimiento
18-24 hs, 37ºC
Aislamiento en medios selectivos y
diferenciales
Colonias típicas
2do. día
TSI
LIA
Estría
18-24 hs, 37ºC
3er. día
Serotipificación O
Lectura
Colonias típicas
P.
bioquímicas
TSI
LIA
Caldo Flagelar
Estría
18-24 hs, 37ºC
Lectura de P. Bioq.
4to. día
Serotipificación O
Lectura de P. Bioq.
Serotipificación H
P. bioquímica
Una vez realizada la identificación bioquímica y la serotipificación, se continúa con:
• La determinación de la sensibilidad a los antimicrobianos
• Estudios de subtipificación molecular por electroforesis en campo pulsado (PFGE), para el estudio de brotes y para
el monitoreo programado de aislamientos circulantes.
Propiedades bioquímicas diferenciales de
las subespecies de Salmonella
Pruebas
bioquímicas
S. enterica
subesp.
enterica (I)
Dulcita
+
ONPG
Malonato
Gelatina
Sorbita
+
KCN
L(+) tartrato
+
Mucato
+
Salicina
Lactosa
Habitat de
Animales
la mayoría
de sangre
de las
caliente
cepas
S. enterica
subesp.
salamae (II)
S. enterica
subesp.
arizonae
(IIIa)
S. enterica
.
diarizonae
(IIIb)
S. enterica
subesp.
houtenae
(IV)
S. enterica
subesp.
indica
(VI)
S. bongori
(V)
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
- (75%)
+
+
+
+
- (70%)
+ (75%)
+
+
+
+
-
d
d
+
+
d
+
+
+
+
+
-
Animales de sangre fría y medio ambiente
+ 90 % ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos; d: diferentes
reacciones
Pruebas bioquímicas de Salmonella
enterica subesp. enterica (I)
Pruebas bioquímicas
Fermentación de lactosa ***
ONPG
.
Producción de SH2
Fermentación de glucosa ***
Fermentación de dulcita ***
Fermentación de adonita ***
Decarboxilación de lisina **
Decarboxilación de ornitina **
Hidrólisis de arginina **
Hidrólisis de urea **
Producción de indol
Hidrólisis de gelatina ****
Reacción de rojo de metilo *
Reacción de Voges Proskauer *
Citrato de Simmons **
Utilización de malonato *
Salmonella enterica subep. enterica (I)
+
+/con gas
+
+
+
+
+
+
-
*Lectura a los 2 días; ** Lectura hasta los 4 días; *** Lectura hasta los 7 días; **** Lectura hasta los 30 días
Caracteres bioquímicos diferenciales entre
S. Typhi, S. Paratyphi A y Salmonella spp.
P. bioquímicas
SH2 (TSI)
Lisina decarboxilasa
Ornitina decarboxilasa
Arginina dehidrolasa
Glucosa (gas)
Citrato Simmons
S. Typhi
Trazas
+
-
S. Paratyphi A
+
+
-
Salmonella spp.
+
+
+
+
+
+
+ 90% ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos
Caracteres bioquímicos diferenciales entre Salmonella
enterica subesp. enterica (I) y Proteus mirabilis
Pruebas bioquímicas
SH2 (TSI)
Hidrolisis de urea
Fenilalanina deaminasa
Lisina decarboxilasa
Ornitina decarboxilasa
Lactosa
Dulcita
ONPG
Salmonella enterica subesp.
enterica (I)
+
+
+
+
-
Proteus mirabilis
+
+
+
+
-
+ 90% ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos
Caracteres bioquímicos diferenciales entre Salmonella
enterica subesp. enterica (I) y Citrobacter freundii
Pruebas bioquímicas
SH2 (TSI)
Urea (hidrólisis)
Lisina decarboxilasa
Ornitina decarboxilasa
Lactosa (fermentación)
Sacarosa (fermentación)
Dulcita (fermentación)
Malonato (fermentación)
ONPG
Salmonella enterica subesp.
enterica (I)
+
Citrobacter freundii
+
+
+
-
d
d
d
d
d
d
+
+
+ 90% ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos; d: diferentes
reacciones
Caracteres bioquímicos diferenciales entre Salmonella
enterica subesp. enterica (I), Edwarsiella tarda y
Escherichia coli SH2 +
P. bioquímicas
Indol
Citrato Simmons
Lisina decarbox.
Arginina dehidrol.
Manita
Dulcita
Ramnosa
Xilosa
ONPG
S. enterica subesp.
enterica (I)
+
+
+
+
+
+
+
-
E. tarda
E. coli SH2 +
+
+
-
+
+
-/+
+
+/+
+
+
+ 90% ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos
Serotipificación de
Salmonella spp.
Esquema de Kauffmann-White
Estructura antigénica de Salmonella spp.
Citoplasma
Pilus
Flagelo
bacteriano
Cápsula
Ag flagelar H
Pared celular
Líp
ido
A
Membrana
plasmática
Co
re
ADN
LP
S
Ribosomas
Ag Vi
Ag somá
somático O
ANTIGENOS DEL GENERO Salmonella
El estudio de la estructura antigénica del género Salmonella
permite tipificar las bacterias que lo componen en serovariedades
(serotipos).
La serotipificación completa se basa en la determinación de los
antígenos somáticos O, los antígenos flagelares H y el antígeno
capsular Vi (si está presente).
La serotipificación:
Es un importante complemento de la identificación bioquímica.
Permite determinar la prevalencia de una serovariedad en
distintas zonas geográficas.
Es de utilidad en el estudio de brotes y en la vigilancia basada
en el laboratorio
I.- Antígeno somático O
ESTRUCTURA DEL LPS
S. Typhimurium
Antigeno O
CORE
Exterior
Interior
Hep
PP – EIN
Hep
Hep
Gal
GlcNAc
Glc
KDO
LIPIDO A
Abe
Glc
Man
Rha
Gal
P
KDO
P
KDO
Ein
Gal
n
Abe: Abecuosa
Man: D-Manosa
Rha: L-Rhamnosa
Gal: D-Galactosa
GlcNAc: N-Acetil-D-Glucosamina
Glc: D-Glucosa
Hep: L-Glicero-D-Manoheptosa
KDO: 3 Deoxi-D-Acido Manooctulosilonico
EtN: Etanolamina
P: Fosfato
Rick,P. E. coli and S. Typhimurim
Celular and Molecular Biology. Vol 1, 1987
I.- Antígeno somático O
EXPRESIÓN DEL ANTIGENO O
Expresión del Antígeno somático O
La estructura somática se denomina con la letra O
seguida de : “dos puntos” y luego de números arábigos
separados por comas
Por ejemplo:
S. Typhimurium
O:1,4,[5],12
S. Enteritidis
O:1,9,12
Los símbolos para los factores somáticos determinados por conversión fágica
están subrayados (por ej. 1,9,12)
[ ] = los factores O entre corchetes, no subrayados, pueden estar presentes
o ausentes sin relación con la conversión fágica. Por ej. factor [5] del grupo
O:4 (B).
Estructura antigénica O + Estructura Flagelar H
Fórmula antigénica
(Esquema de Kauffmann-White)
II.- ANTÍGENO FLAGELAR H
Estructura del antígeno flagelar de S. Typhimurium
Rick,P.
E. and
coli and
S. Typhimurim
Rick,P.
E. coli
S. Typhimurim
Celular and
Celular
andMolecular
MolecularBiology.
Biology.Vol
Vol1,1,1987
1987
II.- ANTÍGENO FLAGELAR H
EXPRESIÓN DEL ANTÍGENO H
Unas pocas serovariedades de Salmonella spp. poseen una sola
fase flagelar, esos aislamientos se denominan monofásicos
Ejemplo:
Salmonella Enteritidis (9,12:g,m:-)
Salmonella Typhi (9,12 [Vi]:d:-)
Estructura antigénica O + Estructura Flagelar H
Fórmula antigénica
(Esquema de Kauffmann-White)
II.- ANTÍGENO FLAGELAR H
EXPRESIÓN DEL ANTÍGENO H
La gran mayoría de las serovariedades tienen dos especificidades o dos
fases en su antígeno flagelar o sea son aislamientos difásicos. En el
Esquema de Kauffmann-White, ambas fases están separadas por : “dos
puntos”
Ejemplo:
Salmonella Typhimurium (4,5,12:i:1,2)
Salmonella Panama (9,12:l,v:1,5)
1.- La fase 1 (identificada en los ej. por las fases: i o l,v, se denominan
con letras separadas por comas)
2.- La fase 2 (identificada en los ej. por las fases: 1,2 o 1,5 se denominan
con números arábigos o letras separados por comas ).
[ ] = Cuando los factores H están entre corchetes significa que ellos se
encuentran excepcionalmente en cepas salvajes.
Estructura antigénica O + Estructura Flagelar H
Fórmula antigénica
(Esquema de Kauffmann-White)
Estructura antigénica O + Estructura Flagelar H
Fórmula antigénica: 4,5,12:i:1,2 (O: 4,5,12 / H: i:1,2)
Esquema de Kauffmann – White
S. Typhimurium
Fenómenos de variación que
afectan la serotipificación
Variaciones somáticas
Variación de S R (Lisa Rugosa)
Variación M N (Mucoide No mucoide)
Variación V W (Capsular No capsular)
Variación S T R
Variación de Forma
Variación No fimbriada Fimbriada
Variaciones flagelares
Variación OH O
Variación de Fase
Variaciones Somáticas
VARIACION S – R
No se puede determinar el Ag O
Para obtener colonias lisas:
Realizar subcultivos en agar sangre o agar Mueller Hinton
Reaislar la cepa
Si no es posible revertir la rugosidad:
Confirmar la identificación por pruebas bioquímicas
Determinar el Ag H
VARIACION V - W
El antígeno Vi es un antígeno capsular que se encuentra en Salmonella Typhi,
Salmonella Paratyphi C y algunas cepas de Salmonella Dublin
SUSPENSION BACTERIANA
ANTISUERO “Vi” ANTISUERO “O”
Capsulada V
Calentada 1 h a 60 º C ó 30 min. a 100º C
Variación V - W
+
-
-
+
+
+
VARIACIONES FLAGELARES
VARIACION DE FASE
Es la variación reversible de los antígenos H.
Ocurre en el género Salmonella (Fase 1 y Fase 2)
La gran mayoría de las serovariedades son difásicas:
pueden expresar alternativamente antígenos flagelares de
dos especificidades.
Flujograma de Serotipifacacion de Salmonella spp.
Aislamiento con identificación bioquímicas de
Serotipificación somática
(aglutinación en lámina)
Estría en TSA
Aglutinación con solución salina al 2%
Negativa
Negativa (3)
Aglutinación c/ antisueros
poliv. flagelares H (4)
Cepa Rugosa (2)
Positiva
Aglutinación c/ antisueros
de grupo O
Serotipificación flagelar
(aglutinación en tubo)
Caldo flagelar
Positiva
Aglutinación c/
antisueros poliv.
somáticos (1)
Salmonella spp.
Negativa (5)
Aglutinación c/ antisueros
de fases H / factores H (6)
Inversión o Inducción de Fase
(Si es necesario)
Formula antigénica H
Positiva
Aglutinación c/ antisueros
de factores O
Formula antigénica O
Positiva
Formula Antigénica
Esquema de Kauffmann-White
RESULTADO FINAL
1 Antisueros polivalentes
somáticos: OS-A y OS-B
2.-Para revertir una cepa de la
forma rugosa a lisa, se
realizan subcultivos en agar
sangre o Mueller Hinton. Si
no es posible revertir la
rugosidad, se debe confirmar
la identificación por pruebas
bioquímicas y realizar la
serotipificación flagelar H.
3.- Ver Consideraciones a tener en
cuenta en "Serotipificación
somática"
4.-Antisueros polivalentes
flagelares: HS-1; HS-A; HSB; HS-C
5.-Ver Consideraciones a tener en
cuenta en "Serotipificación
flagelar”.
6. Si la serovariedad de Salmonella
es difásica y sólo expresa
una fase, realizar "Método de
inversión de fases"
Inversión o Inducción de Fase
Ejemplo: Salmonella Typhimurium (4,5,12.i:1,2)
Cultivos de S. Typhimurium
1
2
Flagelos de especificidad H:1,2
Flagelos de especificidad H:i
POBLACIÓN BACTERIANA BALANCEADA
SE EXPRESAN IGUALMENTE LAS DOS FASES
NO realizar
inversión de fase
POBLACIÓN BACTERIANMAYORITARIA EXPRESA
FLAGELOS DE ESPECIFICIDAD H:1,2
Realizar inversión
de fase
Flujograma de Inversión o Inducción
de Fase
Serotipificación somática O (O: 4,5,12)
Serotipificación flagelar H
Si la población está balanceada da
Fase 1 (H:i) y Fase 2 (H:1,2)
Si la población expresa
flagelos de fase 1 (H:i)
Si la población expresa
flagelos de fase 2 (H:1,2)
Inversión de fase con
antisuero H:i
Inversión de fase con
antisuero H:1,2
Se inmoviliza la Fase 1 y
se expresa fase 2
Se inmoviliza la Fase 2 y
se expresa fase 1
Fórmula antigénica: O:4,5,12 H:i:1,2 (Esquema de Kauffmann-White )
Salmonella Typhimurium
Determinación de la estructura antigénica
flagelar de una serovariedad difásica que
expresa sólo una fase flagelar
Una serovariedad difásica en algunas ocasiones puede
expresar sólo una fase flagelar
Ej. Salmonella subespecie I 4,5,12:i:En este caso sólo se expresa la fase flagelar H:i (Fase 1)
Tubo de
Craigie
El cultivo queda inmóvil (en el
lugar de siembra) ya que no se
expresa la Fase 2
Siembra del cultivo sin
formolar
Agar movilidad Craigie + 2 gotas del
Antisuero de Inversión de fase “i”
Esquema de Kauffmann-White
Grimont. P.A.D. & Weill, F -X. 2007. Antigenic formulas of the Salmonella serovars, 9 th revision. WHO Collaborating Centre for Reference and Research on
Salmonella . Institut Pasteur, Paris, France
Interpretación del Esquema de
Kauffmann - White
Primera columna: Indica el nombre de la serovariedad, si la misma
pertenece a S. enterica subesp. enterica (I) o las siglas S. II, S. IIIa, S.
IIIb, S. IV, S. V o
S. VI, indicando que la serovariedad estudiada pertenece a las otras
subespecies, o a S. bongori que no se denominan con un nombre.
Segunda columna: Antígenos somáticos O. Los números arábigos
indican el o los factores somáticos y se escriben separados por una
coma
Tercera y cuarta columna: Antígenos flagelares H. Se indican los
factores de las fases 1 y 2, del antígeno H, respectivamente . Para la
fase 1 los factores se denominan con letras minúsculas, seguida
algunas veces por un número que figura como subíndice, para la fase 2
en general se emplean números arábigos, aunque también se utilizan
letras minúsculas.
Un signo “negativo” indica que la fase considerada está ausente y por lo
tanto la serovariedad es monofásica.
Recomendaciones y
Conclusiones
Realizar una correcta identificación bioquímica
Realizar una correcta identificación de los
determinantes antigénicos somáticos y flagelares
Si el aislamiento no reacciona con ninguno de los
antisueros flagelares polivalentes, es necesario
realizar sucesivos pasajes por tubos de Craigie, con
el fin de exaltar la movilidad, hasta lograr el recorrido
completo en 18 – 24 hs, de incubación a 37ºC
En los casos de serovariedades de Salmonella spp.
difásicas, que expresen una sola de las fases
flagelares se debe realizar la técnica de Inversión de
Fase
Realizar una correcta interpretación del Esquema de
Kauffmann - White
MUCHAS GRACIAS !!!
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