MICROSCOPÍA

MICROSCOPÍA
Trabajo Práctico N°
N 6
MICROBIOLOGÍA
(Octubre 2012)
Claudia Herrmann
cherrmann@iibintech.com.ar
1
MICROSCOPÍA
Campo claro
Campo oscuro
Microscopio Óptico
Contraste de fase
Fluorescencia
Confocal
Microscopio Electrónico
De transmisión (MET)
De barrido (MEB)
Microscopio de Fuerza Atómica
2
3
1) Microscopio de campo claro
Ocular (X10)
Objetivo
(X20, X40, X60, X100)
Muestra
Condensador
Fuente
L
Luz
4
1) Microscopio de Campo Claro
La muestra debe ser delgada (casi transparente)  Fijación  Tinción
Para aumentar la diferencia de contraste entre los microorganismos
y el medio en las muestras es necesario realizar tinciones.
Levaduras sin teñir
Bacterias Tinción Gram
5
2) Microscopio de campo oscuro
Objetivo
- Se coloca una placa opaca en el
condensador.
d
d
- Solo los rayos
y reflejados
j
o
difractados entran al objetivo.
Muestra
- Se obtiene una imagen con fondo
oscuro y la muestra iluminada.
Condensador
Placa Opaca
Fuente
Luz
- No es necesario fijar las muestras
(Buen contraste entre la muestra y el
fondo)
6
FUNDAMENTO
Rayos No
Desviados
Lente del Objetivo
Rayos Desviados
por la muestra
Muestra
Lente del
Condensador
Placa Opaca
Fuente de Luz
7
Campo Claro
Levaduras
vs.
Campo Oscuro
Chlamydomonas
8
3) Microscopio de Contraste de fase
Anillo de fase
Objeetivo
- Se basa en el retraso de las ondas de luz al
atravesar objetos de distintos índices de refracción
(densidades), aprovechando y amplificando dichos
retrasos.
- Convierte
C i t pequeñas
ñ dif
diferencias
i en ííndices
di
d
de
refracción variables y detectables por el ojo.
Muestra
- Permite observar estructuras sin necesidad de
fijar las muestras.
- Las partes oscuras de la imagen corresponden a
las porciones densas de la muestra; las partes
claras de la imagen corresponden a porciones
menos densas
Condensador
Disco Anular
Fuente
Luz
9
3) Microscopio de Contraste de Fase
La luz,, al atravesar objetos
j
con distintos índices de refracción,, experimenta
p
retrasos
(desfases), sin embargo, estos no son tan notorios como para poder percibirlos.
El MCF, mediante el diafragma anular y el anillo de fase, acentúa dichos retrasos,
haciendo que zonas con distintos índices de refracción se traduzcan en una variación
de contraste la cual puede ser observado.
rayos
en fase
-1/4
/
Se observan imágenes
con el fondo claro
(rayos no desviados) y
las muestras oscuras
con limites bien
definidos.
-1/4
ANILLO DE FASE
Objetivo
Los rayos desviados se
cancelan con los no desviados
Discos transparentes
con un diseño en relieve
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3) Microscopio de Contraste de Fase
Cél l Vi
Células
Vivas
Microscopio
p de
Campo Claro
p de
Microscopio
Contraste de Fase
• No hay buen contraste con el fondo • Buen contraste de células con el fondo
• No se observan hay límites claros
• Límites celulares evidentes (oscuros)
• No se distinguen estructuras internas • Se distinguen estructuras internas
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4) Microscopio de fluorescencia
Filtro de emisión
Muestra
Condensador de
Campo Oscuro
Lámpara
p
Filtro de
excitación
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MUESTRAS
- Pueden presentar autofluorescencia ó estar teñidas con fluoróforos:
- Anticuerpos
A ti
conjugados
j d
- Hoecht (tiñe DNA)
- Expresión de proteínas de fusión fluorescentes (GFP)
- Pueden estar vivas o fijadas  Microscopio Invertido
- Son exitadas excitadas a una longitud de onda y fluorescen emitiendo a una longitud
de onda mayor.
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5) Microscopio confocal
- Las muestras deben estar teñidas
con fluoróforos o presentar
autofluorescencia
- Las muestras pueden estar vivas o
fij d
fijadas
- Las muestras son excitadas a una
longitud de onda y fluorescen
emitiendo a una longitud de onda
mayor.
- Solo
S l llos h
haces d
de lluz que pasan por
el foco llegan al detector.
planos
- Se observan planos.
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5) Microscopio confocal
- Un Rayo Láser se hace pasar a través
del pinhole, este haz de luz pasa a
través del espejo y luego a través del
l t objetivo
lente
bj ti ell cuall llo enfoca
f
sobre
b lla
muestra.
- La
L lluz emitida
itid por lla muestra
t es
recibida por el lente objetivo y
reflejada por el espejo.
- Esta luz pasa a través de la apertura
pinhole que no permite el paso de la
fluorescencia originada por los planos
fuera de foco.
- Sólo la luz del plano focal llega al
detector.
15
Al
Algunas
Aplicaciones
A li i
1) Análisis de colocalización.
2) Inmunofluorescencias y detección de sondas.
3) Series Z (Reconstrucciones 3-D).
4) Time Series (Series Temporales).
5) FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching).
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5) Microscopio confocal
1- Observación de una imagen desde el eje z.
2- Se registran imágenes correspondientes a diferentes planos xy.
3- Se reconstruyen imágenes de la muestra observadas desde los ejes x ó y.
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5) Microscopio Confocal
Microscopia de fluorescencia
Microscopia Confocal
Escherichia coli
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6) Microscopio Electrónico de Transmisión (TEM)
- Se
S utiliza
tili un h
haz d
de electrones
l t
e imanes
i
como lentes.
l t
-Los electrones se transmiten a través de la muestra (poca
penetración: aprox. 10 - 100 nm)
- Muestra extremadamente fina y de baja densidad
 Contraste con el fondo débil.
TINCIÓN: absorbe electrones y produce una imagen
más oscura de la región teñida (osmio, tungsteno,
plomo o uranio)
- Se ggenera vacío p
para evitar q
que los electrones colisionen con
los átomos del aire y se desvíen.
- Tratamiento de las muestras:
- Fijación
- Corte con micrótomo/criofractura
- Tinción con sales de metales pesados.
Fuente emisora
de electrones
Condensador
Muestra
Objetivo
Lente
proyectora
Pantalla
- No explora superficies. El haz de electrones incidente atraviesa la muestra observada
y los detalles finos o ultra-estructuras son capturadas en una pantalla (fósforo).
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20
CARACTERÍSTICAS del MET
• Objetos
Obj t < 0
0.2
2 um (virus,
( i
estructuras
t t
celulares
l l
iinternas,
t
etc.)
t )d
deben
b observarse
b
por ME (no pueden ser discriminadas con la resolución del MO)
• El poder de resolución del ME es mucho mayor que el de los MO debido a que la
longitud de onda de los electrones es 100.000 veces menor que la de la luz visible.
• El contraste es el resultado de la dispersión diferencial de electrones por la
p
es función del número y masa de átomos en la
muestra. El ggrado de dispersión
trayectoria de los electrones.
• Las células (mamífero y bacterias) son demasiado gruesas para ser examinadas
satisfactoriamente en preparaciones enteras
enteras. La observación de su estructura interna
exige que sean fijadas, deshidratadas, embebidas en plásticos y seccionadas (50 nm
aprox). Los cortes luego se tiñen con sales de metales pesados y se montan.
• En el MET los rayos X generados revelan la estructura interna, tamaño y
distribución de partículas, red cristalina, interfases y defectos puntuales de la red
atómica, etc.
• El MET permite estudiar la composición química de la muestra. Puede hacerse
un detallado estudio cristalográfico del material investigado.
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6) Microscopio electrónico de transmisión (TEM)
Célula eucariota
Bacteria
(Brucella)
1 uM
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7) Microscopio Electrónico de Barrido (MEB) ó
Scanning Electron Microscopy (SEM)
-Se utiliza un haz de electrones e imanes como lentes.
-Se genera vacío para evitar que los electrones colisionen con los átomos del aire y
se desvíen.
-Se captan los electrones emitidos por el objeto (no transmitidos).
-Tratamiento de las muestras:
-Fijación
-Deshidratación
-Cobertura con metales pesados.
-Se observan topologías de superficies.
23
24
La muestra es irradiada con
un haz muy estrecho de
electrones hace que la
muestra desprenda
electrones de baja energía
(secundarios) que pueden
ser recogidos sobre una
placa cargada positivamente
(ánodo) generando de este
modo una señal eléctrica
que es puede ser utilizada
para ggenerar una imagen
p
g de
la muestra.
El generador de barrido
hace que el haz de
electrones atraviese la
muestra siguiendo un
rastreo de barrido
25
7) Microscopio electronico de barrido (SEM)
Pelos
l radiculares
di l
Bacterias (Rhizobium)
26
7) Microscopio de Fuerza Atómica (MFA)
• Microscopio mecano-óptico
• Resolución < 1nm
• Registra la topología de la muestra
• FUNDAMENTO:
FUNDAMENTO Se
S basa
b
en la
l detección
d
ió de
d las
l fuerzas
f
atómicas
ó i
(d l orden
(del
d de
d los
l
nanoNewton) ó moleculares de interacción entre una punta y la superficie del
material estudiado.
• El MFA ha sido esencial en el desarrollo de la nanotecnología
COMPOSICIÓN
• Cantilever: dimensión aprox. 200 um.
• Láser: La flexión del cantilever es registrado
mediante un haz láser (medición óptica) que se
refleja en su parte posterior para luego
alcanzar un fotodetector.
• Punta: cristal de forma piramidal o cónica
cónica.
Sus dimensiones bordean los 5 nm y 100 A de
diámetro.
27
7) Microscopio de fuerza atómica (MFA)
La muestra es movida en las tres direcciones,
mientras el cantilever traza la superficie de la
muestra en detalle
detalle.
Todos los movimientos son controlados por
una computadora.
d
La fuerza de interacción entre la superficie
p
de la muestra y la punta hacen que el
cantilever se flexione.
Un detector mide esta flexión conforme la
punta barre la superficie y con ello se
obtiene
bi
un mapa topográfico.
áfi
28
7) Microscopio de fuerza atómica (AFM)
Algunos artefactos de la MFA
Muestra
Imagen
Muestra
Imagen
29
7) Microscopio de fuerza atómica (AFM)
Proteína de unión a ADN (23 kDa)
ADN (500 pb)
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Microscopía
Algunas muestras requieren de TINCIONES para ser
obser adas por un
observadas
n determinado microscopio
¿Cuáles son las tinciones más comunes que podemos utilizar en
microbiología para observar y distinguir entre distintos
microorganismos?
31
TINCIONES
Catiónicos: se combinan con los constituyentes
celulares cargados negativamente tales como
ácidos nucléicos, polisacáridos ácidos y superficies
celulares. Ejemplos: Azul de metileno, Cristal
violeta,
l
Safranina.
f
Colorantes
Aniónicos: se combinan con los constituyentes
celulares cargados positivamente,
positivamente tales como
numerosas proteínas. Ejemplos: Eosina, Fucsina
acida y Rojo congo.
Liposolubles: se combinan con las sustancias grasas.
Ejemplos: Sudan negro.
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Tinciones
Positivas: Colorantes que
tiñen al microorganismo
y no al medio.
2 TIPOS
Simples: uso de un solo colorante.
Sirven para distinguir formas.
formas
Diferenciales: uso de un colorante
iniciall y lluego un colorante
l
d
de
contraste. Sirven para diferenciar
distintos tipos de células (Ejemplo:
tinción Gram)
Negativas: Colorantes que no tienen afinidad por los
componentes celulares (Ejemplo: nigrosina). Tiñen al medio y
no a las bacterias, sirven para ver células con cápsulas de
mucopolisacáridos.
mucopolisacáridos
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Tinción Gram
LLas bacterias
b
i gram+ y gram- se tiñen
iñ de
d forma
f
di i
distinta
d bid a las
debido
l
diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares (PC).
La PC bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo así
como para prevenir la lisis osmótica.
El componente de la PC que confiere rigidez es el peptidoglicano.
Gram+
PC
Gram-
Gruesa capa de peptidoglicano (80-90%)
(80 90%)
Ácidos teicóicos
Delgada capa peptidoglicano (10-20%)
Membrana exterior
Fosfolípidos
Li
Lipopolisacáridos
li á id
Lipoproteínas
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Tinción Gram
Permite distinguir
g dos grandes
g
grupos
g p de bacterias que
q
poseen diferencias estructurales en la PC.
Peptidoglicano
Polimero de N-acetilglucosamina
y N-acetilmurámico unidos por
péptidos.
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GRAM
POSITIVO
GRAM
NEGATIVO
36
37
Esquema de la PC Bacteriana
Gram POSITIVAS
Gram NEGATIVAS
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TINCIÓN GRAM
Protocolo
1) Preparar un extendido
A partir de cultivos en medio líquido: Se toma un poco de
cultivo con el ansa y se desparrama sobre un portaobjeto
portaobjeto.
A partir de cultivos en medio sólido (FRESCOS): Se apoya el
ansa sobre
b una colonia,
l i lluego se coloca
l
una gota
t d
de agua
sobre el portaobjeto y se desparrama el material con el ansa.
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TINCIÓN GRAM
2) Fijar el material
Gram +
Gram -
EEsperar a que lla muestra
t seque,
Pasar el portaobjeto sobre el mechero.
3) Cubrir con Cristal violeta
Dejar el colorante 60 segundos.
4) Lavar con agua
40
TINCIÓN GRAM
5)) Agregar ell mordiente
d
(LUGOL)
(
)
Lugol: solución de I2 y KI
Dejar actuar por 60 seg
seg.
Lava con agua.
Gram +
Gram -
6)) Agregar ell decolorante
d l
Decolorante: solución de acetona y etanol.
Aplicar por 5 segundos
El decolorante p
produce una DESHIDRATACIÓN de la p
pared de
péptidoglicano. Este se contrae, se cierran los poros y se transforma
en una barrera física impermeable al solvente la cual impide el
lavado del cristal violeta que queda atrapado en el interior de las
bacterias Gram+.
41
TINCIÓN GRAM
7)) Agregar ell colorante
l
de
d contraste (Safranina)
( f
)
Gram +
Gram -
Gram +
Gram -
8)) Lavar con agua
g
Violeta
Azulado
Rosado
42
43
44
TINCIÓN GRAM
Rosa (Gram -)
Violeta (Gram +)
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TINCIÓN DE ESPORAS (Técnica Schaeffer-Fulton)
Endospora bacteriana:
• Estructura altamente resistente al calor y a condiciones ambientales desfavorables.
• El principal desencadenante de la formación de esporas es la falta de nutrientes
nutrientes.
• Se observan en los géneros Bacillus y Clostridium (Gram +).
• Altamente resistentes al calor,
calor desecación
desecación, ácidos
ácidos, álcali y desinfectantes
desinfectantes.
Estructura
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Clasificación en función de su posición
Bacillus cereus: central, ovalada, no deformante
Bacillus subtilis: subterminal,
subterminal cilíndrica
cilíndrica, no deformante
Clostridium: terminal, ovalada, deformante
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Tinción de Esporas
Protocolo
1) Preparar el extendido y fijar por calor.
2)) Cubrir con verde de malaquita
q
y calentar por
p 3 minutos.
3) Lavar con agua.
4) Agregar
A
colorante
l
t de
d contraste
t t (safranina).
( f i )
5) Lavar con agua.
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Tinción de Ácido Resistencia (Ziehl-Neelsen)
Permite distinguir bacterias del género Mycobacterium.
Mycobacterium Estas poseen
en su pared acido micólico (hidroxilípido de cadena ramificada) que se
encuentra acomplejado al péptido glicano de la pared celular.
50
51
REACTIVOS:
1. Fucsina Fenicada:
• Colorante soluble en los componentes lipídicos
• Cuando se aplica calor a la muestra logra atravesar
la barrera de ácido micólico y tiñe de rojo los
componentes lipídicos de la PC.
2. Alcohol Ácido: decolorante
3. Azul de Metileno: Colorante de contraste. Tiñe las
bacterias que no son ácido resistentes.
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Tinción de Ácido Resistencia (Ziehl-Neelsen)
Protocolo:
1) Preparación del extendido y fijación por calor.
2) Cubrir el portaobjeto con fucsina fenicada (fucsina básica con fenol).
3) Calentar hasta emisión de vapores.
4) Lavar con agua.
5) Agregar decolorante (HCl 3%, EtOH 95%).
6) Lavar con agua
agua.
7) Agregar el colorante de contraste (Azul de metileno).
8) Lavar con agua.
53
54
Etapas de Formación de la Espora
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