REACCIONES Antígeno- Anticuerpo - U

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REACCIONES
Antígeno- Anticuerpo
Alfredo De Ioannes
Inmunología Básica
Facultad de Ingeniería
Universidad de C hile
Septiembre 2007
Características de la Interacción
Antígeno - Anticuerpo
9 Específica
9 Reversible
9 Dependiente de pH
9 Sensible a la Temperatura
9 Sensible a la fuerza iónica
Fuerzas implicadas en la
Interacción Antígeno - Anticuerpo
9
9
9
9
Puentes de hidrógeno
Fuerzas electrostáticas (enlaces iónicos)
Fuerzas de van der Waals
Enlaces hidrófobicos
AFINIDAD Y AVIDEZ
Afinidad y Avidez de un
anticuerpo por un epitopo
Afinidad
Suma de todas las fuerzas atractivas y repulsivas
entre un sitio de unión del anticuerpo (paratopo)
y el correspondiente epitopo. Se define por una constante
de equilibrio (Ka), según la ley de acción de masas.
Avidez
Fuerza con la que un anticuerpo multivalente se une
a un Antígeno multivalente. Su valor es mucho mayor que
la suma de las afinidades.
Cinética de la Reacción
(ecuación válida solo para moléculas monovalentes)
k
Hapteno + Ac
( Hapteno-Ac)
k’
Ka =
k
=
(Hapteno-Ac)
(Hapteno)(Ac)
k’
[Ac] la concentración de sitios libres de Ac
[Ac-H] la concentración de sitios ocupados del Ac
Los anticuerpos como sondas
para buscar antígenos de interés
Ventajas
9
9
9
9
9
9
9
Especificidad
Sensibilidad
Estabilidad
Versatilidad en el diseño: ELISA, IFI, Western blot, etc.
Tiempo de ejecución razonable: inutos a ~ hrs
Costo conveniente
Infraestructura mínima
Los anticuerpos
como sondas para
buscar antígenos
de interés
Inmunización con
Carrier-hapteno
Antisuero
Ej. Haptenos (drogas, toxinas, hormonas, etc).
Análisis de los Ac. unidos a:
Hapteno
libre
Hapteno
en otra
Proteína
Hapteno
al
mismo
carrier
Técnicas Inmunoanalíticas
- Reacción de precipitación
En medio líquido
• Floculación
• Nefelometría
• Precipitación de complejos Inmunes
En gel
•
•
•
•
•
•
Inmunodifusión doble
Inmunodifusión radial
Inmunoelectroforesis
Rocket electroforesis
Contrainmunoelectroforesis
Inmunoelectroforesis cruzda bidimensional de Laurel
- Reacción de aglutinación
• Aglutinación pasiva
• Aglutinación directa
- Fijación y actividad hemolítica del complemento
- Reacciones en fase sólida
o
o
ELISA
Western blot
Reacciones de Precipitación y
Floculación en solución
Reacciones de sueros humanos de pacientes con
Tiroiditis de Hashimoto auotoinmune.
o
es
Precipitado de proteínas (mg)
c c
Ex A
Tiroglobulina agregada (mg)
Equivalencia
Ex
ce
Ag so
Inmunodifusión Doble
(o de Ouchterloni)
Suero humano
HIg
HSA
Suero humano
Ej: Mezcla de antígenos y suero
polivalente
AS (pozo central) : Antisuero de conejo anti-suero humano
HSA: Albúmina humana purificada
HIg: Inmunoglobulina humana purificada
Ensayo Immunoturbidimétrico
9
9
9
Suero + Ag
complejos insolubles
Aumenta turbidez de la solución
y puede ser medida ópticamente
Turbidez proporcional a la cantidad
de proteínas en la muestra
Sensibilidad de método se puede
incrementar con los anticuerpos
Unidos a látex: mayores agregados
Inmunodifusión Radial
Ag
Anticuerpo incorporado al gel
El tamaño de los halos es
proporcional a la
concentración del
antígeno
Reacciones de Aglutinación
Se considera aglutinación cuando el antígeno es
particulado y tiene como tamaño mínimo el bacteriano
¾Aglutinación Directa: Las
partículas o células tienen un
antígeno intrínseco.
¾Aglutinación Pasiva:
partículas o células a las
cuales se le agrega el antígeno
Reacciones en fase sólida
¾ ELISA
¾ Western bots
¾ Inmunofluorescencia
¾Cromatografía de Afinidad
ELISA
(Enzime linked
immunosorbent assay )
Detección de anticuerpos
Detección de Antígeno
Determinación de antígenos
por ELISA
Sándwich
Densidad óptica
Densidad óptica
Competencia
[ Ag ]
Caso de Haptenos
[ Ag ]
Caso de Proteínas
Western blot
Precipitado producto enzimático
Quimioluminiscencia
Sustrato
Anti-anticuerpo-Enzima
Anticuerpo específico
Inmunofluorescencia indirecta
Anticuerpo anti-Acrosina
Se puede hacer con células vivas o fijadas,
con o sin permeabilizar.
Anticuerpo anti-Ag de
embrión de ratón
Cromatografía de Afinidad
9Ej: Purificación de un anticuerpo
uniendo el antígeno a una resina (sp).
Sin embrago, también se puede hacer
lo contrario.
Anticuerpo
Anticuerpo no unido
Buffer de elusión
Elución de Anticuerpo
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