ESPAÑOL PRINCIPIO DE ELISA COMPETITIVO Un proceso de unión competitivo ejecutado por el antígeno original (antígeno de muestra) y el antígeno añadido. Los procedimientos de elisa competitivo son diferentes en algún aspecto en comparación con elisa indirecta, elisa sandwich y elisa directa OBJETIVOS DEL ELISA COMPETITIVO Mide la cantidad de un específico: proteína, metabolito, anticuerpo PROCEDIMIENTO DE ELISA COMPETITIVO 1.- Las muestras se preparan incubando el anticuerpo primario con las muestras en tubos, donde el antígeno de interés forma un "complejo" con el anticuerpo. 2.- La muestra se agrega al pocillo y se deja incubar para que se adsorba en la superficie del pocillo. El "complejo", cualquier anticuerpo no unido y otras proteínas pueden adsorberse 3.- Después de la incubación de la muestra, los pocillos se lavan para eliminar cualquier proteína o "complejo" anticuerpo / antígeno no unido 4.- Luego, los pocillos se recubren con una solución de bloqueo, que evitará que el anticuerpo secundario se una a los pocillos de forma inespecífica. 5.- Después de otro ciclo de lavado, se deja incubar el anticuerpo secundario conjugado y "competir" con el antígeno de interés por la unión continua al anticuerpo primario. 6.- Después de un ciclo de lavado final, la enzima secundaria conjugada se hace reaccionar para producir una señal, que se puede leer en un lector de placas. RESULTADO DEL ELISA COMPETITIVO - La fuerza de la señal está inversamente relacionada con la cantidad de antígeno presente. Cuanto más antígeno esté presente, más difícil será que el anticuerpo secundario se una al anticuerpo primario y viceversa. - Esta forma de ELISA puede detectar cantidades más pequeñas de antígeno presente que los ELISA indirectos. - Este tipo de ELISA no requiere el uso de anticuerpos de pares coincidentes - En lugar de utilizar un anticuerpo secundario conjugado como competidor, se puede utilizar otro antígeno conjugado que el anticuerpo primario también reconozca. - En otras palabras, utilice una proteína que también reconozca el anticuerpo primario, que no sea la misma que el antígeno de interés. - La ventaja de utilizar este método es que no es necesario utilizar un anticuerpo secundario. - El anticuerpo primario utilizado puede ser policlonal y no purificado. - El antígeno de interés que es ideal para este tipo de ELISA contiene solo un epítopo reconocible por el anticuerpo primario USO DE ELISA COMPETITIVO - Se utiliza para determinar antígenos de moléculas pequeñas (T3, T4, Progesterona, etc.) - Utilizado para la detección de anticuerpos contra el VIH. - Se utiliza cuando solo hay un anticuerpo disponible para el antígeno de interés o cuando el analito es pequeño, es decir, un hapteno, y no puede unirse a dos anticuerpos diferentes. VENTAJAS DEL ELISA COMPETITIVO 1- Capacidad para usar muestras crudas o impuras y aun así unirse selectivamente a cualquier antígeno que pueda estar presente. 2- Alta especificidad, dado que se utilizan dos anticuerpos, el antígeno / analito se captura y detecta específicamente 3- Adecuado para muestras complejas, ya que el antígeno no requiere purificación previa a la medición. 4- Flexibilidad y sensibilidad ya que se pueden utilizar métodos de detección tanto directos como indirectos ESPAÑOL PRINCIPIO DE ELISA COMPETITIVA Un proceso de unión competitiva ejecutado por el antígeno original (antígeno de muestra) y el antígeno añadido. Los procedimientos de la elisa competitiva son diferentes en algún aspecto comparados con la elisa indirecta, la elisa de sándwich y la elisa directa. OBJETIVOS DE ELISA COMPETITIVA Mide la cantidad de un específico: Proteína, Metabolito, Anticuerpo PROCEDIMIENTO DE ELISA COMPETITIVA 1.- Las muestras se preparan incubando el anticuerpo primario con las muestras en tubos, donde el antígeno de interés forma un "complejo" con el anticuerpo 2.- La muestra se añade al pozo y se deja incubar para que se adsorba a la superficie del pozo. El "Complejo", cualquier anticuerpo no ligado, y otras proteínas pueden todos adsorber. 3.- Después de la incubación de la muestra, los pozos se lavan para eliminar cualquier proteína o anticuerpo/antígeno "complejo" no unido. 4.- Los pozos se cubren con una solución bloqueadora, que evitará que el anticuerpo secundario se una a los pozos de forma no específica. 5.- Después de otro ciclo de lavado, se permite que el anticuerpo secundario conjugado se incube y "compita" con el antígeno de interés para continuar uniéndose al anticuerpo primario. 6.- Tras un último ciclo de lavado, la enzima secundaria conjugada reacciona para producir una señal, que puede ser leída en un lector de placas. RESULTADO DE ELISA COMPETITIVA - La fuerza de la señal está inversamente relacionada con la cantidad de antígeno presente. Cuantos más antígenos estén presentes, más difícil será que el anticuerpo secundario se una al anticuerpo primario y viceversa. - Esta forma de ELISA puede detectar menores cantidades de antígeno presente que los ELISA indirectos. - Este tipo de ELISA no requiere el uso de anticuerpos de par coincidentes - En lugar de utilizar un anticuerpo secundario conjugado como competidor, se puede utilizar otro antígeno conjugado que el anticuerpo primario también reconozca. - En otras palabras, usar una proteína que el anticuerpo primario también reconozca, que no sea la misma que el antígeno de interés. - El beneficio de usar este método es que no hay que usar un anticuerpo secundario. - El anticuerpo primario utilizado puede ser no purificado, y policlonal. - El antígeno de interés que es ideal para este tipo de ELISA contiene sólo un epítopo reconocible por el anticuerpo primario USO DE ELISA COMPETITIVA - Se utiliza para determinar los antígenos de las pequeñas moléculas (T3, T4, Progesterona, etc.) - Se utiliza para la detección de anticuerpos del VIH. - Se utiliza cuando sólo un anticuerpo está disponible para el antígeno de interés o cuando el analito es pequeño, es decir, un hapten, y puede ser unido por dos anticuerpos diferentes. VENTAJAS DE LA ELISA COMPETITIVA 1- Capacidad de usar muestras crudas o impuras y aún así ligar selectivamente cualquier antígeno que pueda estar presente. 2- Alta especificidad, ya que se utilizan dos anticuerpos el antígeno/análisis es específicamente capturado y detectado 3- Adecuado para muestras complejas, ya que el antígeno no requiere purificación previa a la medición. 4- Flexibilidad y sensibilidad, ya que se pueden utilizar métodos de detección tanto directos como indirectos
