Tema 3 - OCW Usal

Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible
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Tema 3
ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORCION ULTRAVIOLETA-VISIBLE
La espectrofotometría de absorción en las regiones ultravioleta y visible del
espectro electromagnético es, posiblemente, la más utilizada en la práctica del análisis
cuantitativo de todas las técnicas espectroscópicas. Asimismo, puede resultar de
utilidad como técnica auxiliar para la determinación de estructuras de especies
químicas.
Se basa en la absorción de radiación ultravioleta y visible por el analito, como
consecuencia de lo cual se origina un estado activado que posteriormente elimina su
exceso de energía en forma de calor, en un proceso que esquemáticamente puede
representarse así:
X + hυ —> X* —> X + calor
La cantidad de calor disipado es muy pequeño, por lo que el método tiene la
ventaja de originar un trastorno mínimo en el sistema que se estudia.
El término generalmente empleado en la medida de la radiación absorbida es el
de absorciometría, si bien, normalmente se utiliza la denominación de colorimetría
cuando se trabaja en la region visible del espectro electromagnético y se emplean
aparatos que utilizan filtros (ver más adelante) para seleccionar la radiación utilizada*.
Por otra parte, el término espectrofotometría suele aplicarse cuando la radiación
utilizada se extiende a las regiones ultravioleta e infrarroja, y además, se utilizan
monocromadores en lugar de filtros, así como sistemas de detección más sensibles,
como tubos fotomultiplicadores.
* En sentido estricto, un colorímetro es un instrumento que compara el color de una sustancia con el de
una disolución de referencia usando el ojo humano como detector, si bien, en la práctica, esta denominación
suele aplicarse a muchos fotómetros de filtro con sistemas de detección eléctricos.
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Claudio González Pérez
En cuanto a la región ultravioleta, hay que indicar que la zona de mayor interés en
la práctica analítica ordinaria es la denominada como ultravioleta próximo (longitud de
onda entre 200 y 400 nm), pues el ultravioleta lejano o ultravioleta de vacío (de 10 a
200 nm) presenta el inconveniente de que oxígeno atmosférico absorbe en esa región,
siendo necesario eliminarlo del instrumento de medida. Debido a ello, la
espectrofotometría en esa región espectral no se ha desarrollado suficientemente.
LEYES DE LA ABSORCION DE RADIACION
Cuando un haz de radiación monocromática de una determinada longitud de onda
atraviesa una capa de disolución conteniendo una especie absorbente, la potencia
(energía por unidad de tiempo y unidad de área) del haz incidente Po se atenúa,
disminuyendo hasta P (figura 3.1.)
Se define la transmitancia, T, como la fracción de radiación incidente que
consigue atravesar la muestra. Varía de 0 a 1 y puede expresarse también como
porcentaje:
P
P x
T=
; %T=
100
Po
Po
Un parámetro de mayor utilidad práctica es la absorbancia, A, definida como
A = – log T = log
Po
P
b
Po
P
P–dP
P
db
Figura 3.1. Absorción de radiación
Obsérvese que cuando no hay absorción de radiación, P=Po y entonces, A=0,
mientras que si se absorbe el 99 %, solo se transmite el 1%, con lo que A=2.
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible
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Para una capa de disolución absorbente de espesor infinitamente pequeño, db,
(Figura 3.1.) la disminución de la potencia radiante, dP, es proporcional a la propia
potencia incidente, P, a la concentración de la especie absorbente, C, y al espesor db:
dP = – k P C db
donde k es una constante de proporcionalidad. Reagrupando la ecuación anterior e
integrando, se obtiene:
dP
= – k C db
P
P
dP
=–
P
b
k C db
0
Po
ln
P
P
= – k C b = 2.3 log
Po
Po
log
donde, ε = k/2.3. La expresión,
P
= – log T = A = ε b C
Po
A = ε b C
se denomina ley de Beer. Es fundamental en análisis cuantitativo al relacionar la
absorbancia con la concentración.
La constante ε recibe el nombre de absortividad molar, cuando la concentración
se expresa en moles/litro y el camino óptico, b, en centímetros. La absortividad es
una propiedad característica de la sustancia absorbente y depende de la longitud de
onda. Por ello, para aplicar la ley de Beer debe seleccionarse una determinada longitud
de onda, y para este propósito se utiliza el espectro de absorción, siendo éste una
gráfica que indica la variación de la absorbancia, o de la absortividad, con la longitud
de onda.
DESVIACIONES DE LA LEY DE BEER
La proporcionalidad entre la absorbancia y la concentración únicamente se cumple
para disoluciones muy diluidas, observándose desviaciones más o menos acusadas al
aumentar la concentración (figura 3.2.).
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Claudio González Pérez
Desviaciones
positivas
A
Desviaciones
negativas
C
Figura 3.2. Desviaciones de la ley de Beer
Las desviaciones de la ley de Beer pueden clasificarse de la forma siguiente:
Reales
Instrumentales
Químicas
Radiación no monocromática
Radiación parásita
Errores de lectura
Dimerizaciones
Influencia del equilibrio Acido-base
Complejos
Influencia del disolvente
Influencia de la temperatura
Impurezas en los reactivos
Interacción entre especies absorbentes
Personales
DESVIACIONES REALES. En la deducción de la ley de Beer que se hizo
anteriormente, no se ha considerado que la absortividad depende del índice de
refracción, n, según la expresión:
n
ε = ε verdadero
2
2
n +2
Como, a su vez, el índice de refracción varía con la concentración, la absortividad
no es rigurosamente constante para cualquier concentración, provocando desviaciones
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Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible
negativas. De todas formas, en la práctica, para concentraciones inferiores a 10–3 M
puede prescindirse de la influencia de este factor, al ser el índice de refracción
esencialmente constante.
DESVIACIONES INSTRUMENTALES. Las fluctuaciones producidas en la
corriente eléctrica, la inestabilidad de algunas fuentes de radiación o la respuesta no
lineal del detector pueden originar el funcionamiento incorrecto de un determinado
aparato. Además de éstos, pueden considerarse los siguientes factores de tipo
instrumental como causas de desviaciones de la ley de Beer:
a) Uso de radiación no monocromática. La deducción de la ley de Beer se hizo
sobre la base de utilizar radiación monocromática, lo cual, en sentido estricto, nunca
se cumple, pues en la práctica, todos los dispositivos seleccionan una banda más o
menos ancha en torno a una determinada longitud de onda. La influencia de la radiación
policromática sobre la ley de Beer puede mostrarse del siguiente modo:
Supóngase un haz formado por las longitudes de onda λ1 y λ2 (banda M en la
figura 3.3.a.).
N
N
A
A
M
M
λ1
λ2
a)
λ
C
b)
Figura 3.3. Influencia de la radiación policromática sobre la ley de Beer.
Aplicando la ley de Beer a cada una de ellas, se tiene:
A1 = log
P 01
–ε b C
= ε 1 b C ; P 1 = P 01 10 1
P1
A2 = log
P 02
–ε b C
= ε 2 b C ; P 2 = P 02 10 2
P2
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Claudio González Pérez
Cuando este haz constituido por las dos radiaciones atraviesa una disolución
conteniendo especies absorbentes, la potencia del haz emergente es P1+P2, mientras
que la del haz incidente sobre la muestra es P01 + P02. Según esto, la absorbancia
medida será:
A M = log
P 01 + P 02
= log
P1 + P2
P 01 + P 02
P 01 10
–ε 1 b C
AM = log (P01 + P02) – log (P01 10–ε1
bC
+ P 02 10
–ε 2 b C
+ P02 10– ε2b C )
En el caso particular de que ε1 = ε2 la ecuación anterior se simplifica, reduciéndose
a
AM = ε1 b C
que es la ley de Beer. Sin embargo, cuando ε1 es distinto de ε2, la relación entre AM y
la concentración deja de ser lineal. Evidentemente, cuanto mayor sea la diferencia
entre ε1 y ε2, mayores serán las desviaciones de la linealidad. Por eso mismo, aún
cuando la anchura de banda sea relativamente grande, si las diferencias en los valores
de la absortividad son pequeños, la utilización de un haz policromático no implica
diferencias significativas respecto a uno monocromático (ver Fig. 3.3.a., banda N).
b) Presencia de radiación parásita. El haz de radiación que sale de un
monocromador suele estar contaminado con pequeñas cantidades de radiación parásita
o dispersada originada por reflexión de los distintos componentes ópticos, dispersión
por partículas de polvo atmosférico, etc. Por otra parte, la propia muestra puede
originar dispersiones.
Con frecuencia, la radiación dispersada tiene una longitud de onda diferente
respecto a la radiación principal, pudiendo además, en ocasiones, llegar al detector sin
haber atravesado la muestra. Por todo ello, la absorbancia medida en presencia de
radiación parásita es:
AM = log
P0 + Ps
P + Ps
donde Ps es la potencia del haz dispersado. Al aumentar la concentración de
sustancias absorbentes, disminuye P, con lo que este término puede ser lo
suficientemente pequeño respecto a Ps como para que la expresión anterior se
transforme en:
AM = log
P0 + Ps
P + Ps
- log 0
P + Ps
Ps
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Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible
lo cual indica la presencia de desviaciones negativas en la ley de Beer debido a este
factor.
c) Errores de lectura. Los errores indeterminados en la lectura de la
transmitancia o absorbancia son errores que potencialmente siempre están presentes
y es necesario tenerlos en cuenta. En ocasiones, pequeños errores en la lectura de la
transmitancia o de la absorbancia pueden ocasionar errores grandes en la
concentración cuando se opera en los extremos de la escala. Esto se ilustra en la
figura 3.4.
%T
1
3
2
C
Figura 3.4. Errores de lectura.
En 1, figura 3.4., el error absoluto cometido en la determinación de la
concentración, para un cierto error de lectura de transmitancia, es pequeño, pero al
ser pequeña la concentración, el error relativo puede ser grande. En 3, la
incertidumbre en la determinación de la concentración es alta, y en 2, hacia la mitad
de la escala, parece que se trata de la situación más favorable.
Puede demostrarse, como se indica a continuación, que el mínimo error relativo
se obtiene para una absorbancia de 0.434.
La primera derivada de la ley de Beer es:
A = ε b C = – log T ;
ε b dC = – log e
dT
T
donde dT representa el error indeterminado en la lectura de la escala de
transmitancia y dC indica la incertidumbre en la concentración. Como log e = 0.434 y ε
b = – log T/C, se obtiene,
dC
0.434
=
dT
C T(log T)
Derivando esta ecuación de nuevo e igualando a cero, se obtiene que la
transmitancia óptima corresponde a 36.8 %, que equivale a una absorbancia de 0.434.
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Claudio González Pérez
DESVIACIONES QUIMICAS
Se incluyen en este apartado toda una serie de desviaciones aparentes de la ley
de Beer producidas como consecuencia de procesos químicos en los que participan las
especies absorbentes.
a) Influencia del equilibrio. Cuando la sustancia problema interviene o forma
parte de un sistema en equilibrio con otras especies, el desplazamiento del equilibrio
implica una modificación en la concentración, y, en consecuencia, en la absorbancia.
Algunas situaciones que pueden producirse son las siguientes:
Dimerizaciones. Cuando una disolución de dicromato potásico no tamponada se diluye, ocurre una
transformación parcial en cromato, como consecuencia del equilibrio dímero-monómero:
Cr2O72– + H2O <——> 2 CrO42– + 2 H+
(λmax = 350, 450 nm)
(λmax = 372 nm)
Acido–base. En la figura 3.5. se muestran los espectros de absorción de un indicador ácido-base.
4
A
3
1
punto
isosbéstico
2
HIn <——> In– + H+
3
rojo
amarillo
2
1
4
λ
Figura 3.5. Espectros de absorción de un indicador ácido-base.
Es evidente que cuando las especies absorbentes están implicadas en un equilibrio ácido-base, la
ley de Beer no se cumple, al menos que el pH o la fuerza iónica sean constantes, o se opere a la
longitud de onda del punto isobéstico, esto es, la longitud de onda a la cual las dos especies
absorbentes en equilibrio presenten la misma absortividad. En este sentido hay que mencionar
que los puntos isosbésticos se toman frecuentemente como criterio para la existencia de dos
especies absorbentes interconvertibles de un compuesto determinado.
Complejos. Cuando se mide la absorbancia de un complejo, por ejemplo Fe(SCN)63–, para que se
cumpla la ley de Beer hay que mantener constante la concentración de ligando libre, lo cual se
consigue frecuentemente operando en gran exceso de ligando respecto al metal.
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible
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b) Influencia del disolvente. Como consecuencia de las interacciones soluto–
disolvente se originan con frecuencia desplazamientos espectrales, ensanchamientos
de bandas y otros fenómenos que pueden provocar desviaciones en la ley de Beer. En
este sentido, no es posible hacer predicciones de forma general. Unicamente
mencionar algunos términos relacionados con los desplazamientos espectrales:
desplazamiento batocrómico o desplazamiento hacia el rojo, consiste en un
desplazamiento del máximo de absorción hacia longitudes de onda mayores (este
efecto suele producirse en disolventes de alta constante dieléctrica). Desplazamiento
hipsocrómico o desplazamiento hacia el azul, es el desplazamiento hacia longitudes de
onda más cortas.
c) Influencia de la temperatura. La temperatura puede influir modificando el
equilibrio químico de algunos sistemas, así como, en ocasiones, dar lugar a
desplazamientos batocrómicos. De todas formas, la temperatura no suele ser un
factor a considerar en la mayor parte de los sistemas absorbentes sencillos.
d)
Presencia
de
impurezas
en
los
reactivos. Muchos métodos
espectrofotométricos son lo suficientemente sensibles como para detectar
cantidades a nivel de trazas, por lo que la presencia de impurezas absorbentes en los
mismos reactivos pueden originar errores considerables. Debido a ello, en la práctica
analítica ordinaria, las medidas espectrofotométricas se llevan a cabo frente a un
blanco constituido por la propia célula, el disolvente y los reactivos. En este sentido
interesa que la absorbancia del blanco sea pequeña, pues si es grande, un pequeño
error en su medida puede implicar un gran error relativo en el resultado final.
e) Interacciones entre especies absorbentes. Cuando en una disolución existen
varias especies absorbentes, la ley de Beer se cumple para cada una de ellas, si todas
actúan independientemente. Sin embargo, la interacción entre ellas puede producir
alteraciones en la distribución de cargas, como consecuencia de lo cual puede
modificarse la energía requerida para la absorción y, en consecuencia, variaciones en
la posición, forma y altura de las bandas de absorción. Por otra parte, estas
alteraciones en la distribución de cargas también pueden ser originadas por la
presencia de sales inertes, con el consiguiente aumento de la fuerza iónica de la
disolución.
Claudio González Pérez
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f) Interacciones soluto–radiación electromagnética. Aunque en sentido estricto
no son factores de tipo químico, también deben considerarse otros tipos de
interacción entre la radiación y la materia, distintos de los que intervienen en el
proceso de absorción. Así, la posible emisión de resonancia y la presencia de
fenómenos fluorescentes y fosforescentes pueden originar desviaciones aparentes en
la ley de Beer.
ERRORES PERSONALES
En este sentido, los mayores errores suelen cometerse por el uso inadecuado de
las cubetas de absorción. Resultan de utilidad las recomendaciones siguientes:
* Es necesario asegurarse de que las cubetas están perfectamente limpias, no
rayadas y exentas de huellas o adherencias en las paredes por las que ha de
pasar la radiación.
* Las cubetas de vidrio y cuarzo pueden limpiarse con ácido nítrico o con agua
regia en frío, pero no con mezcla crómica.
* Una vez limpias, las cubetas deben enjuagarse con agua destilada y con varias
porciones de la disolución a medir.
* No deben secarse interiormente, mientras que el exterior debe secarse con
papel suave, comprobando, además, que, una vez llena con la disolución problema,
no contiene burbujas de aire.
* Aunque se debe trabajar con cubetas idénticas para la muestra y la referencia
(blanco), es buena práctica utilizar siempre la misma disolución en cada una de
ellas.
ABSORCION DE RADIACION
Como se indicó en el capítulo anterior, cuando una molécula absorbe un fotón, se
incrementa su energía, pasando a un estado excitado. En relación con esto, pueden
hacerse las siguientes preguntas: ¿qué pasa con la energía absorbida? ¿en qué se
invierte?, etc. Seguidamente se intentará dar respuesta a ellas.
La absorción de radiación ultravioleta y visible origina transiciones entre
distintos niveles de energía electrónicos, así como simultáneamente transiciones
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible
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vibracionales y rotacionales, de forma que el cambio en la energía molecular de una
determinada especie como consecuencia de la absorción de energía radiante puede
representarse así:
∆E = ∆Eelectrónica + ∆Evibracional + ∆Erotacional + ∆Etraslacional
De todos los términos que figuran en la expresión anterior, el más importante es
∆Eelectrónica, pues la diferencia de energía entre dos estados vibracionales es unas 10
veces menos, y ∆Erotacional es, a su vez, entre 10 y 100 veces menor que ∆Evibracional.
Por otro lado, el último término es tan pequeño que prácticamente puede prescindirse
de su influencia.
Debido a lo anteriormente expuesto, suele ser de utilidad clasificar las especies
absorbentes en base al tipo de transiciones electrónicas que pueden tener lugar.
Asimismo, esto permite correlacionar el comportamiento espectral de una
determinada especie con sus características químicas, lo cual es importante en orden
a determinar estructuras moleculares y para la identificación de ciertos grupos
funcionales.
Tipos de transiciones electrónicas
Las moléculas orgánicas, y una gran cantidad de aniones inorgánicos, contienen
electrones en orbitales moleculares σ y π, así como en orbitales no enlazantes, n, por
lo que cuando estas especies absorben fotones de contenido energético adecuado se
pueden producir transiciones a los correspondientes orbitales moleculares
antienlazantes, σ* y π*, tal como se indica en la figura 3.6., donde se muestra la
estructura de Lewis para una molécula orgánica sencilla y las transiciones electrónicas
correspondientes.
σ*
π*
H
C
H
++
O++
σ
π
+n
n
π
σ
Figura 3.6. Transiciones electrónicas entre niveles de energía moleculares.
13
Claudio González Pérez
Como se representa en la figura 3.6., pueden tener lugar cuatro tipos de
transiciones: σ—>σ*, π—>π*, n—>σ* y n—>π*. Asimismo, también pueden producirse
transiciones denominadas de transferencia de carga y de campo ligando.
Seguidamente se comentarán algunas peculiaridades de cada una de las transiciones
mencionadas.
Transiciones σ—>σ*. Estas transiciones entre orbitales moleculares sigma
enlazantes y antienlazantes implican energías relativamente grandes (ver fig. 3.6.), de
forma que las bandas de absorción se observan en el ultravioleta lejano, a longitudes
de onda inferiores a 200 nm (Figura 3.7.). Esta región del espectro se denomina
frecuentemente ultravioleta de vacío, debido a que los constituyentes normales del
aire, nitrógeno y oxígeno, absorben fuertemente a 160 y 200 nm respectivamente, por
lo que los espectros en esta zona deben obtenerse operando en el "vacío".
UV lejano
UV próximo
Visible
Intensidad
π —> π *
transferencia de carga
σ —> σ*
n —> π*
.
n —> σ*
campo ligando
200
400
λ, nm
750
Figura 3.7. Bandas de absorción originadas por diferentes transiciones electrónicas.
En los hidrocarburos saturados, en los que solamente hay enlaces sencillos C–H
se producen estas transiciones; así el metano presenta máximos de absorción a 125 nm
y el etano a 135 nm. Desde el punto de vista analítico, estas bandas tienen poco
interés, debido a dificultades de tipo instrumental.
Transiciones n—>σ*. Las especies químicas saturadas que contengan átomos con
pares electrónicos en orbitales no enlazantes pueden dar lugar a que se produzcan
transiciones n—>σ*. Esto sucede, por ejemplo, en compuestos saturados conteniendo
heteroátomos de oxígeno, azufre y halógenos.
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible
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Estas transiciones requieren bastante energía, si bien en menor grado que las σ—
>σ*, por lo que las bandas correspondientes se presentan fundamentalmente en el
ultravioleta lejano. Por otra parte, la intensidad de las absorciones asociadas con
estas bandas suelen ser de pequeña magnitud.
Los máximos de absorción correspondientes a esta transiciones n—>σ* tienden a
desplazarse hacia longitudes de onda menores al aumentar la electronegatividad del
heteroátomo. De hecho, la mayor parte de los compuestos saturados que contienen
oxígeno absorben a longitudes de onda inferiores a 200 nm, lo cual hace posible que
compuestos tales como el agua, o los alcoholes, puedan utilizarse como disolventes en
el ultravioleta próximo.
Transiciones n—>π* y π—>π*. Estas transiciones se consideran juntas debido a
que muchos grupos químicos contienen electrones en orbitales π y no enlazantes. Como
se aprecia en la Figura 3.6., las transiciones π—>π* requieren la absorción de una
cantidad de energía relativamente grande, por lo que suelen aparecer en el
ultravioleta lejano, mientras que las n—>π* necesitan menor cantidad de energía, como
consecuencia de lo cual se originan bandas en las zonas ultravioleta próximo y visible.
En lo que respecta a la intensidad de la absorción, las absortividades molares de
los picos asociados a las transiciones n—>π* son generalmente bajos, mientras que los
correspondientes a los π—>π* son considerablemente mayores. De cualquier forma, el
comportamiento mencionado puede alterarse, como se verá posteriormente, por la
presencia de determinadas agrupaciones atómicas, o por el tipo de disolvente.
Para que tengan lugar las transiciones consideradas en este apartado, es evidente
que la especie química tendrá que contener algún grupo funcional con enlaces π, esto
es, la estructura molecular deberá presentar centros absorbentes no saturados. A
estos grupos de átomos responsables de la absorción en las regiones ultravioleta y
visible se les denomina grupos cromóforos (por extensión, se considera que los
sistemas con electrones s son cromóforos en el ultravioleta lejano). En la tabla 3.1. se
muestran algunos grupos cromóforos y las transiciones implicadas en
espectrofotometría ultravioleta-visible.
Por otra parte, existen determinadas agrupaciones atómicas que por sí mismas no
comunican color a la molécula que pertenecen, pero son capaces de reforzar la acción
de un cromóforo. Estos grupos se denominan auxocromos.
15
Claudio González Pérez
Tabla 3.1.
Grupos cromóforos y transiciones electrónicas
Grupo cromóforo
Estructura
Etilénico
C
C
Acetilénico
C
C
Carbonilo
C
Amida
Nitro
— NO2
Oxima
C
Ester
π−> π∗
π −> π∗
π −> π∗
n −> π∗
π −> π∗
n −> π∗
π −> π∗
n −> π∗
π −> π∗
n −> π∗
O
O
O
O
C
OR
O
C
NH2
Carboxilato
Transición
C
π −> π∗
n −> π∗
π −> π∗
n −> π∗
N
Los grupos auxocromos suelen contener grupos funcionales con electrones en
orbitales no enlazantes y que, en consecuencia, pueden absorber únicamente en el
ultravioleta lejano, como consecuencia de transiciones n—>σ*. Sin embargo, si un
auxocromo y un cromóforo se encuentran en la misma molécula, la absorción del
cromóforo se desplaza hacia longitudes de onda más largas, a la vez que se produce un
incremento en la intensidad de la absorción. Este efecto se atribuye normalmente a la
posibilidad de que se den transiciones n—>π*. En relación con las modificaciones de las
intensidades de absorción se definen los siguientes términos: efecto hipercrómico
(aumento de la intensidad de la absorción) y efecto hipocrómico (disminución de la
intensidad de la absorción).
Cuando una molécula contiene dos o más grupos cromóforos pueden darse las
siguientes posibilidades:
a) Si los cromóforos están separados por dos o más enlaces sencillos se dice que están aislados,
y, en estos casos, la absorción es la suma de todos los grupos cromóforos presentes. Ejemplo:
CH3–CH2–CH2–CH=CH2
CH2=CH–CH2–CH2–CH=CH2
λmax (nm)
184
185
εmax
10000
20000
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Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible
b) Cuando los cromóforos están conjugados, esto es, separados por un enlace sencillo, se produce
un desplazamiento batocrómico acompañado de un efecto hipercrómico.
–C=C–
–C=C–C=C–
–C=C–C=C–C=C–
λmax (nm)
170
220
260
εmax
16000
21000
35000
La razón de estos desplazamientos se considera que es debida a que la conjugación hace que se
produzca una deslocalización de los electrones π sobre, al menos, cuatro átomos, como
consecuencia de lo cual se rebaja el nivel de energía del orbital π*, con lo que al ser menor la
energía requerida para las transiciones, los máximos de absorción se desplazan hacia mayores
longitudes de onda, aumentando además las probabilidades de que tengan lugar las mencionadas
transiciones, lo que origina un aumento simultáneo en la intensidad de la absorción. Sin embargo,
cuando existe algún enlace triple, se observa una disminución de la intensidad de absorción
(efecto hipocrómico)
λmax
ε max
CH2 = CH – CH = CH 2
219
21000
CH2 = CH – C CH
219
6500
c) Cuando los cromóforos están unidos directamente, el espectro resultante normalmente es
distinto del que presentan ambos cromóforos cuando están aislados, ya que en realidad se forma
un nuevo cromóforo.
CH2=CH2
CH2=C=CH2
λmax
170
225
εmax
10000
500
En cuanto a la influencia del disolvente, puede decirse que al aumentar la
polaridad del disolvente se produce un desplazamiento hipsocrómico (hacia menor
longitud de onda) de las bandas n—>π* y un desplazamiento batocrómico (hacia
longitudes de onda mayores) de las bandas π—>π*. Esto puede explicarse teniendo en
cuenta que el estado excitado es más polar que el estado fundamental, por lo cual, la
presencia de un disolvente polar tiende a estabilizar los estados excitados, rebajando
su nivel energético. De todas formas, si únicamente tuviera lugar este efecto, en
ambas transiciones ocurrirían desplazamientos batocrómicos. Sin embargo, en el caso
de las transiciones
n—>π* se produce un aumento de solvatación del par de
electrones no enlazados, lo cual rebaja la energía del orbital no enlazante en mayor
medida que lo que disminuye la energía del orbital π*. En consecuencia, se produce un
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Claudio González Pérez
aumento de la energía requerida para la transición n—>π* y el consiguiente
desplazamiento hipsocrómico.
Bandas de transferencia de carga. Estas bandas se originan cuando se produce
transferencia de electrones de una parte a otra de un sistema. Para ello es necesario
que uno de sus componentes tenga características de dador de electrones y otro de
aceptor. Como consecuencia de esta transferencia de electrones se origina un estado
excitado que es el resultado de un proceso de oxidación-reducción interna. Así, por
ejemplo, la absorción de un fotón por el complejo Fe(III)–SCN– da lugar a la
transferencia de un electrón desde el tiocianato hasta uno de los orbitales del hierro,
originándose una especie excitada consistente en Fe(II) y SCN neutro:
Fe(III)–SCN– + hν —> Fe(II)–SCN
Lo mismo que sucede con otros tipos de excitación electrónica, el electrón que ha
experimentado la transferencia vuelve a su estado original, si bien, ocasionalmente
puede tener lugar la disociación del estado excitado, teniendo lugar, en este caso, una
reacción fotoquímica.
Algunas moléculas orgánicas pueden
transferencia de carga intramolecular:
originar
de
absorción
por
R
R
C = O + hν
bandas
+
–
=C—O
Las bandas de absorción originadas por estos procesos de transferencia de carga
son particularmente importantes en análisis químico, ya que muchos compuestos
orgánicos e inorgánicos las presentan en el ultravioleta (a veces también en el visible)
y las absortividades molares suelen ser muy altas (superiores a 10000), por lo cual se
obtienen límites de detección muy bajos para estas especies.
Bandas de campo ligando. El color que presentan muchos iones y compuestos de
metales de transición normalmente se deben a absorciones denominadas de campo
ligando (junto a éstas, suelen presentarse las intensas bandas de transferencia de
carga anteriormente mencionadas). Estas absorciones suelen ser de baja intensidad y
18
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible
aparecen en la región visible, llegando en ocasiones hasta el ultravioleta próximo y el
infrarrojo próximo.
El origen de las bandas de campo ligando puede explicarse del siguiente modo: los
cinco orbitales d de un átomo o un ión de un elemento de transición, cuya
representación se muestra en la figura 3.8., en ausencia de un campo magnético o
eléctrico externo están degenerados, no siendo necesaria la absorción de radiación
para promover un electrón de un orbital a otro.
Como puede verse en la figura 3.8., los orbitales dx2–y2 y dz2 están orientados
según los ejes de coordenadas x, y y z. Estos orbitales forman el grupo eg. Por su
parte, los orbitales dxy, dyz y dxz, llamados orbitales t2g, se orientan según las
bisectrices a dichos ejes.
Al formarse un complejo octaédrico entre el ión metálico y el agua, o algún otro
ligando, los átomos dadores de los ligandos se aproximan al ión metálico central a lo
largo de los ejes, por lo que habrá una mayor repulsión entre los electrones de los
ligandos y los electrones de los orbitales eg del ion central, que entre los de los
ligandos y los de los orbitales t2g.
z
z
z
y
x
x
x
y
d yz
dxy
z
dxz
y
z
y
y
x
x
d x2–y 2
dz 2
Figura 3.8. Representación esquemática de los cinco orbitales atómicos d.
19
Claudio González Pérez
Como consecuencia de las repulsiones mencionadas, la aproximación de los seis átomos
dadores (cargas puntuales) a lo largo de los ejes produce un campo eléctrico que
elimina la degeneración existente en el grupo de orbitales d y los divide en dos grupos,
los t2g con energía inferior y los eg con energía superior (figura 3.9.) *
dx 2–y 2 d z2
E
d
xy
dxz dyz dx2 –y 2 d z2
∆oct.
d
xy
dxz dyz
Figura 3.9. Desdoblamiento de los orbitales d por efecto del campo ligando.
La energía de separación entre los dos grupos, representada por ∆oct depende de
las características del ión metálico (carga y número cuántico principal del orbital d) y
del ligando (distribución de su densidad de carga y polarizabilidad). En este sentido,
es posible ordenar los ligandos más comunes en orden creciente de ∆ (serie
espectroquímica):
I–<Br–<Cl–<F–<OH–<C2O42– H2O<SCN–<NH3<etilendiamina<NO2–<CN–
Ejemplo: Las disoluciones acuosas de Cu2+, Cu(H2O)42+ son de color azul pálido, mientras que en
medio amoniacal, Cu(NH3)42+, el color es azul violeta muy intenso. Esto es debido al aumento que
experimenta el campo ligando cuando se sustituye el H2O por NH3.
Las consideraciones teóricas anteriormente expuestas permiten deducir si una
determinada especie química absorberá radiación electromagnética en las regiones
ultravioleta y visible. Desde el punto de vista práctico es interesante poder predecir
la longitud de onda aproximada a la que se producirá la absorción máxima. Para esto,
se han propuesto toda una serie de reglas empíricas obtenidas de la observación de
los espectros de absorción de una gran variedad de sustancias orgánicas. Las reglas
que seguidamente se presentan de forma resumida** se han desarrollado para los
siguientes tipos de compuestos: dienos conjugados, anillos bencénicos sustituidos,
compuestos carbonílicos no saturados y ácidos, esteres, nitrilos y amidas no
saturados. Cada uno de esos grupos funcionales absorbe a una cierta longitud de onda,
* Cuando se forman complejos tetraédricos o con simetría cuadrada plana, se originan desdoblamientos que
pueden deducirse con razonamientos similares a los utilizados para la estructura octaédrica.
** Para profundizar en el tema pueden consultarse las siguientes publicaciones: Scott, "Interpretation of the
ultraviolet Spectra of Natural Products". Pergamon, Oxford (1964. H.H. Jaffe y M. Orchin, "Theory and
Applications of Ultraviolet Spectroscopy", Willey, Nuw York (1962).
20
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible
y a este valor hay que adicionarle determinadas cantidades en función de la presencia
de otras agrupaciones atómicas presentes en la molécula. En la tabla 3.2 se muestran
dichas cantidades, correspondientes a algunos casos concretos.
Tabla 3.2.
Longitudes de onda de máxima absorción
Dienos
conjugados
Bencenos
monosutituidos
Comp. carbonílicos
Ac. y esteres
insaturados
–C=C–CO
C=C–CHO
215
210
197
λ base, nm
217
203
Doble enlace
adicional
+ 30
+45
+30
+30
+30
α +10
β +12
γ +18
α +10
β +12
γ +18
+10
α +35
β +30
γ +50
α +35
β +30
γ +50
254
Grupo alquilo
+5
+20
+17
Cl, Br
+5
+7
+8
— OH
+7
+16
—COOH
+27
+19
—NH2
+27
+26
Algunas consideraciones respecto al color
Los cuerpos luminosos, como el Sol o una lámpara, emiten radiaciones en un amplio
espectro que comprende muchas longitudes de onda. Aquellas longitudes de onda que
están comprendidas entre unos 400 y 700 nm son capaces de afectar la retina del ojo
humano y con ello dar origen a las impresiones subjetivas de la visión. Se hace mención
de impresiones subjetivas, debido a que en la percepción del color influyen factores
químicos, fisiológicos y físicos; de hecho, la respuesta humana al color varía de una
persona a otra.
Las personas que tienen una visión normal del color son capaces de correlacionar
aproximadamente la longitud de onda de la radiación visible que llega al ojo con la
subjetiva sensación del color, y éste, a veces se utiliza para designar ciertas porciones
del espectro.
21
Claudio González Pérez
Cuando incide radiación electromagnética visible sobre la materia puede ser
absorbida total o parcialmente; si la absorción es total, el objeto aparece de color
negro, y si se reflejan todas las radiaciones, de color blanco. Nosotros percibimos los
objetos por medio de la luz emitida o reflejada, de forma que cuando la luz blanca
(conteniendo todas las longitudes de onda) pasa a través de un medio que es
transparente a ciertas longitudes de onda, pero que absorbe otras, para el observador
ese medio aparece coloreado. Debido a que solo las radiaciones no absorbidas llegan al
ojo, sus longitudes de onda indican el color del medio. Se dice que este color es
complementario al color que se percibiría si la luz absorbida se pudiera detectar,
debido a que la luz emitida y absorbida juntas forman la luz blanca original.
Análogamente, los objetos de color que son opacos absorben algunas longitudes de
onda y reflejan otras cuando son iluminadas por luz blanca. En la tabla 3.1. se indican
los valores que corresponden a determinadas zonas del espectro visible.
Tabla 3.1.
Colores del espectro visible
λ absorbida (nm)
Color absorbido
Color observado
(complementario)
380–420
420–440
440–470
470–500
500–520
520–550
550–580
580–620
620–680
680–780
violeta
azul–violeta
azul
verde–azulado
verde
amarillo–verdoso
amarillo
anaranjado
rojo
púrpura
amarillo-verdoso
amarillo
anaranjado
rojo
púrpura
violeta
azul–violeta
azul
verde–azulado
verde
INSTRUMENTACION
El instrumento que normalmente se utiliza para medir la transmitancia o la
absorbancia de una muestra en función de la longitud de onda es el
espectrofotómetro. Antes de pasar a describir sus componentes básicos, es
conveniente indicar algunos términos relacionados con la nomenclatura utilizada a
propósito de la instrumentación en los métodos ópticos de análisis. Las definiciones
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible
22
que se indican no pueden considerarse universales, pero sí están en razonable acuerdo
con el uso popular y son las que se utilizan en las principales obras dedicadas al tema*.
FOTOMETRO: Cualquier dispositivo utilizado para medir la intensidad de
radiación. Normalmente se utiliza para designar un instrumento sencillo provisto
de filtros para seleccionar una banda de longitudes de onda y de una fotocélula o
un fototubo para medir la intensidad de radiación.
ESPECTROFOTOMETRO: Instrumento más sofisticado que posee un
monocromador en lugar de filtros. Además, el sistema de detección normalmente
es un fotomultiplicador, más sensible que una fotocélula.
COLORIMETRO: Instrumento muy simple que compara, usando el ojo humano
como detector, el color de la sustancia problema con el de una disolución patrón.
(El nombre de colorímetro suele aplicarse en la práctica a cualquier instrumento
apropiado para medir en la region visible, y, en realidad, así se conocen muchos
fotómetros de filtro comerciales).
ESPECTROSCOPIO: Aparato diseñado para detectar detectar líneas
espectrales a simple vista. Su aplicación está restringida al análisis cualitativo y
para elementos con líneas de emisión en la zona visible del espectro.
ESPECTROGRAFO: Instrumento que registra líneas espectrales sobre una placa
fotográfica.
ESPECTROMETRO: Denominación general que se aplica a instrumentos que
poseen sistemas de detección eléctricos.
Según las definiciones anteriores, un espectrofotómetro es un espectrómetro
que mide fotones. Su utilización suele limitarse, en la práctica, a la región
untravioleta, visible e infrarroja.
* Eugene D. Olsen. "Métodos Opticos de Análisis". Ed. Reverté. Barcelona.
23
Claudio González Pérez
Los componentes básicos de un espectrofotómetro son: una fuente de radiación,
un monocromador, que seleccione una banda estrecha de longitudes de onda, una
cubeta, o recipiente que contenga la muestra, un detector de radiación y un sistema
de tratamiento y lectura de la señal detectada (figura 3.10.)
espejo
.
Fuente de
radiación
Filtro
o
Detector
monocromador
Muestra
Medidor
o
registro
.
Referencia
Figura 3.10. Espectrofotómetro de doble haz.
Fuentes de radiación
Las fuentes de radiación utilizadas en espectrofotometría ultravioleta y visible
deben ser continuas en una amplia zona del espectro, de intensidad elevada y ser
esencialmente constante con la longitud de onda.
En la zona ultravioleta y visible, la fuentes más utilizadas son de dos tipos:
fuentes térmicas, basadas en la emisión de radiación por efecto de la temperatura, y
fuentes cuya radiación se debe a descargas eléctricas producidas en el seno de gases.
Entre las primeras, la más común es la lámpara de filamento de volframio. En
condiciones ordinarias de operación, esta lámpara resulta útil entre unos 350 nm y
unos 3000 nm. (figura 3.11.)
volframio (- 3000ºK)
deuterio
visible
Energia
.
200
400
700
λ , nm
Figura 3.11. Curvas de distribución espectral de las lámparas de deuterio y volframio.
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible
24
Como puede observarse en la figura 3.11., la mayor parte de la energía emitida
corresponde a la zona infrarroja. La distribución de la energía depende de la
temperatura del filamento, la cual depende, a su vez, del voltaje; un incremento en la
temperatura de operación aumenta la energía total emitida y desplaza el máximo de
intensidad hacia longitudes de onda más cortas. Sin embargo, en la práctica, esto no
se utiliza para obtener mayor cantidad de radiación ultravioleta, ya que se acorta
considerablemente el tiempo de vida de la lámpara.
Debido a que la radiación emitida depende únicamente del voltaje suministrado,
éste tiene que ser muy estable, por lo cual los instrumentos llevan incorporado un
sistema para la estabilización de la corriente. Por otra parte, el calor producido por la
lámpara puede constituir un problema, por lo que, con frecuencia, en el lugar donde se
coloca la lámpara se instala un ventilador con objeto de evitar el calentamiento de la
muestra y de los demás componentes del instrumento.
Por debajo de 350 nm, la potencia de una lámpara de volframio es inadecuada,
debiéndose emplear una fuente diferente. La más común es una lámpara de descarga
de hidrógeno, o de deuterio. Cuando se produce una descarga eléctrica entre dos
electrodos en el seno de un gas, como hidrógeno, las colisiones entre los electrones de
la descarga y las moléculas gaseosas provocan la excitación electrónica, vibracional y
rotacional de dichas moléculas, con lo que se obtiene un espectro de líneas que es
característico del gas, siempre que la presión sea baja. Al aumentar la presión, las
líneas se ensanchan, llegando a superponerse, hasta que, a presiones relativamente
altas (0.2–5 mm) se produce un espectro continuo.
Tanto la lámpara de hidrógeno como la de deuterio tienen un intervalo de
utilización comprendido entre 175 y 350 nm (figura 3.11.). También se utilizan con la
misma finalidad la lámpara de descarga de xenon y la de vapor de mercurio.
Finalmente, indicar que, puesto que el vidrio absorbe fuertemente a longitudes
de onda inferiores a unos 350 nm, las lámparas de ultravioleta deben utilizar ventanas
de cuarzo.
25
Claudio González Pérez
Filtros y monocromadores
La misión de los filtros y de los monocromadores es seleccionar un haz de
radiación "monocromática"*. Con este fin se utilizan los siguientes dispositivos:
De corte
Absorción
De banda
Filtros
Interferencia
Selección de la
longitud de onda
Prismas
Monocromadores
De transmisión
Redes
De reflexión
Los filtros de absorción se utilizan en la región visible y se basan en la absorción
selectiva de ciertas longitudes de onda. Normalmente consisten en un vidrio coloreado
o una suspensión de un colorante en gelatina que se coloca entre dos placas de vidrio.
Los filtros de banda (figura 3.12. A) se caracterizan por su anchura de banda
(anchura a la mitad de la altura) que puede oscilar entre 30 y 250 nm.
100
%T
B (filtro naranja)
A (filtro verde)
50
400
anchura
de banda
500
combinación de los dos filtros
600
700
λ, nm
800
Figura 3.12. Transmitancia de algunos filtros.
Los filtros de corte tienen transmitancias de casi el 100 % en una zona del
espectro visible, pero luego disminuye rápidamente hasta un valor de transmitancia
cero (figura 3.12.B). Por combinación de diferentes filtros pueden seleccionarse
bandas espectrales relativamente estrechas (figura 3.12.).
* La radiación monocromática es la radiación de una sola longitud de onda. Por supuesto, es imposible
producir radiación monocromática verdadera, en sentido estricto. Sin embargo, cuanto mejor sea el
monocromador, tanto más estrecho será el intervalo de longitudes de onda.
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible
26
Los filtros de interferencia consisten en un dieléctrico transparente
(frecuentemente, fluoruro cálcico o magnésico) recubierto en ambos lados con dos
finas capas de plata semirreflectante. (figura 3.13.)
Figura 3.13. Filtro de interferencia.
Cuando un haz de radiación incide sobre este dispositivo, una fracción atraviesa
la primera capa metálica, mientras que la restante se refleja. La parte que ha pasado
sufre una escisión similar al llegar a la segunda capa metálica. Si la parte reflejada en
la segunda interacción es de longitud de onda adecuada, se refleja, en parte, desde la
cara interior de la primera capa en fase con la radiación incidente de la misma longitud
de onda. El resultado es que se refuerza esa determinada longitud de onda, mientras
que la mayoría de las otras, fuera de fase, sufren una interferencia destructiva. Estos
filtros proporcionan anchuras de banda menores y transmitancias de pico mayores que
los filtros de absorción. Se dispone de filtros de interferencia para todas las zonas
de las regiones ultravioleta y visible, así como parte del infrarrojo.
Un monocromador se caracteriza por producir un haz de radiación de gran
pureza espectral y permitir variar, de forma continua y en un amplio intervalo, la
longitud de onda de la radiación. Los componentes básicos de un monocromador son
una rendija de entrada, que selecciona un haz de radiación policromática entrante, un
elemento dispersante, prisma o red, que dispersa la radiación en sus longitudes de
onda individuales, y una rendija de salida, que aísla la banda espectral deseada (figura
3.14.)
La dispersión de radiación por un prisma se basa en el fenómeno de la refracción;
esto es, el cambio de dirección que experimenta un haz de radiación al pasar de un
medio a otro con distinto índice de refracción. El grado de desviación depende de la
longitud de onda; así, los azules se desvían más que los rojos.
27
Claudio González Pérez
El material de que está construido el prisma depende del tipo de radiación a
dispersar; en la región visible se usan prismas de vidrio, mientras que en el
ultravioleta es necesario usarlos de cuarzo.
rendija
de salida
rendija
de entrada
λ1
λ1+λ2
λ2
.
Figura 3.14. Dispersión de radiación por un prisma.
Los prismas presentan las ventajas de su gran pureza espectral (no hay órdenes
de dispersión superiores, como en las redes), mientras que el principal inconveniente
reside en que la dispersión no es lineal; esto es, las longitudes de onda no se dispersan
de manera uniforme: es mayor para las longitudes de onda más cortas.
Las redes de reflexión*, que son las más utilizadas, consisten en una superficie
dura, pulida, sobre la que se ha grabado un gran número de surcos paralelos y muy
próximos entre sí (entre 300 y 2000 surcos por milímetro para las regiones
ultravioleta y visible).
Figura 3.15. Difracción de radiación por una red de reflexión.
Cuando un haz de radiación incide sobre una red de reflexión con un ángulo i
(figura 3.15.) se refleja según un ángulo φ, diferente del incidente. En la Figura 3.15.
se muestran los haces paralelos 1 y 2. La máxima interferencia constructiva entre
ambos se produce cuando la diferencia de caminos recorridos por ellos sea un múltiplo
entero de la longitud de onda, y esta diferencia es AB – CD. Los segmentos AB y CD
pueden expresarse en función de d y de los ángulos i y .
* Tambien existen las redes de transmisión, que normalmente se construyen trazando una serie de surcos
paralelos sobre una placa de vidrio, con una punta de diamante.
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible
AB = d sen i
28
CD = – d sen φ**
por lo cual,
nλ = d (sen i + sen φ)
donde n, número entero, se denomina orden de difracción.
Según la ecuación anterior, existen distintos valores de λ para unos
determinados ángulos i y φ, por lo que junto con la línea de primer orden (n=1)
aparecen líneas de órdenes superiores. Ordinariamente, la línea de primer orden es la
más intensa. Las líneas de órdenes superiores pueden eliminarse mediante filtros.
El fenómeno de la difracción de una radiación policromática por una red se
representa esquemáticamente en la figura 3.16. Para seleccionar la radiación de una
determinada longitud de onda, se hace girar la red hasta hacer que la radiación que
interesa coincida con la rendija de salida, eliminando los órdenes superiores mediante
filtros.
3er orden
267
2º orden
400
1er orden
800
600
200
300
200
400
200
radiación incidente
(200–800 nm)
Figura 3.16. Difracción de una radiación policromática por una red.
En cuanto a la anchura de rendija de salida debe tenerse en cuenta lo siguiente: a
medida que disminuye la anchura de rendija se reduce la anchura de banda, siendo
posible aumentar la resolución, pero solo hasta un cierto límite, ya que, a partir de un
determinado valor, la difracción por la propia rendija comienza a ser apreciable.
Además, es necesario considerar que al disminuir la anchura de rendija, disminuye
también la intensidad del haz de radiación, por lo que hay que tener en cuenta la
sensibilidad del detector, la cual puede limitar el estrechamiento de la rendija.
** El signo menos indica que el ángulo de reflexión, φ, cae en el lado opuesto al ángulo de incidencia, i.
29
Claudio González Pérez
En resumen, y comparando con los prismas, las redes de difracción presentan las
ventajas de su elevada resolución, dispersión lineal y pocas pérdidas de radiación por
absorción. Posiblemente, el mayor inconveniente esté relacionado con la presencia de
órdenes de difracción superiores.
Recipientes para las muestras
En espectrofotometría analítica, casi siempre se trabaja con disoluciones, por lo
cual la mayoría de los recipientes para las muestras son celdas o cubetas para colocar
líquidos en el haz del espectrómetro. Estos recipientes deben estar fabricados con un
material que permita el paso de radiación de la región espectral de interés. Así, el
vidrio puede emplearse entre 350 y 2000 nm, mientras que en la región ultravioleta se
necesita cuarzo o sílice fundida (ambas sustancias también son transparentes en la
región visible).
En algunos instrumentos baratos se utilizan a veces tubos de ensayo cilíndricos
como recipientes para las muestras. Es importante que estos tubos siempre se
coloquen igual, para lo que se marcan en un lado, y la marca siempre se pone en la
misma dirección cuando se coloca el tubo en el compartimento de cubetas del
instrumento.
Las celdas se deben llenar de tal forma que el haz de radiación pase a través de
la disolución, con el menisco por encima del haz. Las celdas típicas para las regiones
ultravioleta y visible tienen 1 cm de paso óptico, si bien existe una gran variedad en
cuanto a tamaño, forma y otras peculiaridades, como se muestra en la figura 3.17.
.
estándar
(1 cm)
cilíndrica
microcelda
.
.
de flujo
térmica
Figura 3.17. Celdas para espectrofotometría.
2 cm
30
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible
Detectores
Los detectores usados en espectrofotometría ultravioleta y visible son
transductores que convierten la energía radiante en una señal eléctrica*. Un detector
ideal deberá presentar las características siguientes:
*
*
*
*
*
*
*
Sensibilidad elevada en la región espectral de interés.
Respuesta lineal para la energía radiante.
Tiempo de respuesta pequeño.
Utilizable en un amplio intervalo de longitudes de onda.
Elevada relación señal/ruido.
Mínima señal de salida en ausencia de radiación.
Buena disponibilidad para la amplificación.
Sin embargo, no existe el detector ideal, por lo que en la práctica, se evalúan
todos los factores anteriores y se selecciona algún detector que resulte adecuado al
caso. Los más utilizados son: células fotovoltaicas, fototubos y tubos
fotomultiplicadores.
Células fotovoltaicas. Consisten en una placa de hierro, que actúa de electrodo
positivo, sobre la que se deposita una fina capa de un material semiconductor, como
selenio, y éste se recubre de una capa muy fina de oro o plata, que actúa como
segundo electrodo o electrodo colector (figura 3.18.)
(
Plata
)
Selenio
Hierro
(
)
Figura 3.18. Célula fotovoltaica.
Cuando la radiación electromagnética incide sobre el selenio, se promocionan
electrones a las bandas de conducción, haciendo que pasen electrones desde la
superficie del selenio hasta el electrodo colector de plata, produciéndose un aumento
de la conductividad proporcional al número de fotones que inciden sobre la superficie
del semiconductor.
Las células fotovoltaicas presentan las siguientes características: son sencillas
de construir, relativamente baratas y no requieren una fuente de energía externa, por
lo que pueden conectarse directamente a un galvanómetro o un amperímetro. En
cuanto a los inconvenientes, su uso limitado a la región visible (su máxima sensibilidad
* En espectrofotometría infrarroja suelen utilizarse detectores térmicos, que responden al calor.
31
Claudio González Pérez
se presenta hacia los 550 mn, mientras que la respuesta a 350 y a 750 nm disminuye
hasta un 10 % de la máxima), presentan dificultades para la amplificación, y
fenómenos de fatiga, de forma que la corriente de salida disminuye gradualmente con
el tiempo.
Fototubos. Consisten en un cátodo semicilíndrico recubierto interiormente de un
material fotosensible, y un ánodo, en el interior de un recipiente en el que se ha hecho
el vacío (figura 3.19.).
.
(–)
hν
(+)
e–
.
Figura 3.19. Fototubo.
Cuando la radiación incide sobre el cátodo, se produce una emisión de
fotoelectrones que se dirigen al ánodo, originándose una corriente que posteriormente
se amplifica. La emisión de electrones depende de la naturaleza de la superficie del
cátodo y de la frecuencia de la radiación. En el comercio existen fototubos que
difieren en el material con el que está construida la superficie del cátodo, siendo, por
tanto, diferente su respuesta a la radiación de diversas frecuencias.
Muchos espectrofotómetros están provistos de detectores intercambiables que
permiten mantener una buena respuesta en un amplio margen de longitudes de onda.
En general, puede concluirse que los fototubos son más sensibles que las células
fotovoltaicas, por la posibilidad de poder amplificar la corriente inicialmente
generada.
Tubos fotomultiplicadores. Este tipo de detector consiste en un cátodo
fotosensible y una serie de electrodos (dínodos), cada uno a un potencial menos
negativo que el que le precede (figura 3.20.)
32
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible
dínodos
C
–550 V.
A
–600 V.
hν
–500 V.
A: ánodo
C: càtodo
Figura 3.20. Tubo fotomultiplicador.
La radiación que llega al fotocátodo provoca la emisión de electrones primarios,
que son acelerados hasta el primer dínodo. Al incidir en él, cada fotoelectrón origina la
emisión de varios electrones adicionales; éstos, a su vez, son acelerados hasta el
dínodo 2, y así sucesivamente, hasta que al final, la corriente así producida se recoge
en el ánodo, se amplifica electrónicamente y se mide. Normalmente, los tubos
fotomultiplicadores contienen 9 ó 10 dínodos, los cuales originan de 106 a 107
electrones por cada fotón.
Este sistema de detección se caracteriza por su respuesta rápida y elevada
sensibilidad. El límite de detección viene condicionado por el ruido de fondo que se
origina como consecuencia de la emisión termoiónica, la cual puede reducirse
enfriando. De hecho, estas corrientes pueden eliminarse virtualmente enfriando el
detector a –30 ºC, si bien esto no se lleva a cabo en el trabajo espectrofotométrico
ordinario.
INSTRUMENTOS DE HAZ SENCILLO Y DE HAZ DOBLE
Las medidas de absorción de radiación ultravioleta y visible son, por su propia
naturaleza, de carácter relativo; debe de compararse, continuamente, la absorción de
la muestra, conteniendo el analito, con la de una referencia o blanco conteniendo las
mismas especies que la muestra, excepto el analito. En los instrumentos de haz
sencillo hay solamente un haz de radiación que, después de pasar a través de la
muestra llega al detector. De esta forma, para comparar la absorción del blanco, debe
sustituir éste a la muestra en cada lectura, lo cual implica varios segundos entre cada
medida.
Alternativamente, la muestra y la referencia pueden compararse varias veces por
segundo usando un instrumento de doble haz. En él, (figura 3.10.) la radiación pasa
Claudio González Pérez
33
alternativamente a través de la muestra y de la referencia, lo cual se lleva a cabo
mediante un motor que hace girar un espejo ("chopper") dentro y fuera de la
trayectoria de la radiación. Cuando el espejo obturador intermitente no desvía el haz,
éste pasa a través de la muestra y el detector mide la potencia radiante P. Cuando
dicho espejo desvía el haz a través de la celda de referencia, el detector mide Po. De
esta forma la radiación es desviada varias veces por segundo, y el circuito compara
automáticamente P y Po para obtener la absorbancia.
La operación con el sistema de doble haz presenta, fundamentalmente, las dos
ventajas siguientes: la comparación muy rápida de muestra y referencia ayuda a
eliminar errores debidos a fluctuaciones en la intensidad de la fuente y del detector,
inestabilidad electrónica y cambios en el sistema óptico. Por otra parte, se facilita la
posible automatización.
APLICACIONES
En principio, cualquier especie química que absorba radiación electromagnética en
las regiones ultravioleta o visible es susceptible de poder ser determinada por
técnicas espectrofotométricas. El mayor campo de aplicación se encuentra en el
análisis cuantitativo, siendo la espectrofotometría una de las herramientas más
usadas.
Análisis cualitativo
Los espectros de absorción ultravioleta y visible son, en general, menos útiles con
fines cualitativos que los espectros en la región infrarroja, debido a que en aquellos
las bandas son más anchas y, por consiguiente, menos características.
La identificación de un compuesto puro requiere la comparación empírica de los
detalles del espectro (máximos, mínimos y puntos de inflexión) de la sustancia
problema con los del compuesto puro. Además, la intensidad de la absorción,
expresada en términos de la absortividad molar, ε, se usa con frecuencia como
criterio adicional para la identificación, sobre todo si ε tiene un valor elevado a
determinadas longitudes de onda.
Cuando se trata de identificar sustancias orgánicas, es conveniente operar en
fase de vapor y a presión baja, ya que en estas condiciones, el espectro observado es
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible
34
debido a moléculas aisladas y, generalmente es posible resolver la estructura fina
vibracional y rotacional, lo que proporciona detalles característicos para la
identificación. En disolución y, sobre todo, en presencia de disolventes polares como el
agua, alcoholes, ésteres y cetonas, las moléculas no se encuentran aisladas, sino
solvatadas, como consecuencia de lo cual se limita la rotación. Además, los campos del
disolvente pueden modificar de forma irregular los niveles de energía vibracionales y,
cuando el número de moléculas es grande, los niveles de energía son poco definidos,
obteniendose como resultado la aparición de una banda.
Una de las pocas sustancias orgánicas con espectro de absorción característico
en disolución es el benceno. Su espectro se usa frecuentemente en test de
especificaciones de pureza, donde el contenido en benceno debe ser cuidadosamente
controlado, por ejemplo, en alcohol absoluto o en ciclohexano.
Aun cuando la identificación de un compuesto orgánico de forma inequívoca con
este técnica, no es posible normalmente, el espectro de absorción en las regiones
ultravioleta y visible puede ser de utilidad para la detección de ciertos grupos
funcionales. Así, por ejemplo, la presencia de una banda débil entre 280 y 290 nm, que
se desplaza hacia menores longitudes de onda al aumentar la polaridad del disolvente,
indica la presencia de un grupo carbonilo. De cualquier forma, y para mayor seguridad,
estos datos deben usarse siempre en combinación con los obtenidos a partir de
espectros infrarrojos, de resonancia magnética nuclear o cualquier otra información
analítica de que se disponga. En resumen, el espectro de absorción ultravioleta y
visible no es una prueba infalible de la identidad de una especie química, pero sí
representa otra herramienta disponible para aplicarla de forma inteligente.
En cuanto a sustancias inorgánicas, casi las únicas que tienen espectro de
absorción ultravioleta y visible característico son los iones trivalentes de las tierras
raras. De hecho, el Ho2O3 se utiliza en ocasiones para comprobar el calibrado de la
longitud de onda de algunos instrumentos.
Análisis cuantitativo
Ya se ha comentado que la espectrofotometría de absorción ultravioleta y visible
es una de las técnicas más usadas en análisis cuantitativo. Se ha estimado que solo en
el campo biosanitario, un 95 % de las determinaciones cuantitativas se llevan a cabo
por espectrofotometría*.
* Douglas A. Skoog y James J. Leary. "Análisis Instrumental". Ed. Mc Graw–Hill. Madrid (1993)
Claudio González Pérez
35
En relación con los métodos clásicos de análisis (gravimétricos y volumétricos),
los métodos espectrofotométricos son menos exactos, si bien su mayor sensibilidad
(10–4–10–6 M) y rapidez los hace competir ventajosamente con aquellos en muchas
ocasiones. La precisión puede considerarse aceptable, ya que, normalmente se
obtienen incertidumbres relativas entre 1 y 2 %, aunque con determinadas
precauciones pueden reducirse considerablemente.
La base de la aplicación de los métodos espectrofotométricos al análisis
cuantitativo es la ley de Beer. El procedimiento a seguir para llevar a cabo una
determinación analítica consta de una serie de etapas encaminadas a establecer las
condiciones de trabajo y la preparación de la curva de calibrado.
a) Selección de la longitud de onda. Las medidas de absorbancia se llevan a
cabo normalmente a la longitud de onda correspondiente al máximo de absorción,
ya que de esta forma se obtienen máximas sensibilidades. Por otra parte, en esa
zona, la curva espectral suele ser bastante plana, por lo que el cumplimiento de la
ley de Beer es normalmente satisfactorio (ver anteriormente: "Uso de radiación
no monocromática" en las "Desviaciones de la ley de Beer").
A veces no es posible operar a la longitud de onda del máximo de absorbancia
cuando a esa longitud de onda absorbe apreciablemente alguna especie (distinta
del analito) presente, incluso, en ocasiones, el propio reactivo.
b) Preparación de las muestras para el análisis. Muchos compuestos orgánicos
absorben en la región ultravioleta y el tratamiento de la muestra solo implica la
separación de las posibles interferencias. Por otra parte, algunos elementos
inorgánicos absorben intensamente en la región visible, pero solo en ciertos
estados de oxidación. En estos casos, una etapa previa (además de la disolución si
se trata de muestras sólidas) debe incluir un proceso redox para llevar el
elemento al estado de oxidación adecuado. Así, por ejemplo, el manganeso se
determina frecuentemente en forma de permanganato, previa oxidación con
persulfato:
2 Mn2+ + 5 S2O82– + 8 H2O —> 2 MnO4– + 10 SO42– + 16 H+
La disolución violeta de permanganato presenta un máximo de absorbancia a 525
nm.
En otras ocasiones es posible desarrollar un color por medio de reactivos
orgánicos o inorgánicos. Así, por ejemplo, el Fe3+ puede determinarse mediante el
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible
36
color rojo de los complejos formados con SCN–; el Ni2+ por el color rosa de su
quelato con dimetilglioxima, etc.
En relación con estudios medioambientales, es importante la determinación de
SO2 en el aire, para lo cual suele utilizarse pararosanilina como reactivo,
midiendo a 560 nm la absorbancia del compuesto rojo obtenido. Asimismo, la
determinación rutinaria de amoniaco, nitritos y nitratos en aguas para consumo
público suele hacerse espectrofotométricamente. Para el amoniaco se utiliza el
reactivo de Nessler, operando en presencia de AEDT para evitar las
interferencias de Ca, Mg y Al, mientras que para el nitrito suele utilizarse la
clásica reacción de diazotación con aminas aromáticas y posterior reacción con
ácido naftilamino-7-sulfónico, midiendo la absorbancia a 520 nm. Por su parte, el
nitrato se reduce previamente a nitrito y se determina éste por el procedimiento
indicado anteriormente. Estas especias, NH3, NO3– y NO2– pueden representar
peligro para la salud cuando están presentes en aguas de consumo a niveles
superiores a 500, 50 y 0.1 g/mL respectivamente.
La formación de especies absorbentes mediante el uso de reactivos adecuados
hace necesario considerar toda una serie de factores, entre los que cabe
mencionar:
pH. Esta variable suele jugar un papel muy importante en las reacciones de formación de
complejos. La importancia del pH y su influencia sobre los iones metálicos y los ligandos se
discute detalladamente en las obras que tratan el tema correspondiente a equilibrios en
disolución.
Concentración
de
los
reactivos. Previamente a cualquier nueva determinación
espectrofotométrica es necesario establecer los márgenes de concentraciones adecuados de los
reactivos, ya que cantidades demasiado grandes o demasiado pequeñas pueden originar
desviaciones de la ley de Beer.
Tiempo adecuado para la medida. Cuando la especie absorbente es estable y su formación es
rápida, no es necesario controlar el tiempo al que realizar las medidas, mientras que si se
incumple alguna de las premisas anteriores, esta variable será necesario tomarla en
consideración.
Temperatura. Determinadas reacciones requieren operar a temperatura elevada para aumentar
la cinética de formación de un determinado complejo. En estas ocasiones la temperatura de
trabajo deberá especificarse en el procedimiento.
Orden de adición de los reactivos. A veces, es importante añadir los reactivos según una
determinada secuencia. Por ejemplo, la determinación de cobalto mediante la formación del
complejo entre Co(III) y nitrilotriacetato implica la formación previa del correspondiente
Claudio González Pérez
37
complejo con Co(II), por lo cual el peróxido de hidrógeno (oxidante) debe añadirse en último
lugar.
Eliminación de interferencias. Existen muy pocas reacciones que sean totalmente específicas,
por lo que en muchas ocasiones es necesario eliminar las interferencias de determinadas
especies, lo cual muy frecuentemente se consigue por enmascaramiento.
Extracción con disolventes orgánicos. La eliminación de sustancias interferentes puede llevarse
a cabo en ocasiones mediante extracción con algún disolvente orgánico inmiscible con el agua,
aunque tambien puede recurrirse a esta técnica cuando la especie absorbente es poco soluble en
agua.
Concentración de sales. Altas concentraciones de electrólitos influyen frecuentemente sobre la
absorción de determinados compuestos, debido a la formación de asociaciones iónicas que
originan desplazamientos del máximo de absorbancia.
Los efectos de las variables mencionadas deben conocerse y, en consecuencia,
escogerse un conjunto de condiciones de trabajo de forma que la absorbancia no
sea afectada apreciablemente por pequeñas variaciones incontroladas en sus
magnitudes.
c) Determinación de la relación absorbancia–concentración. Una vez conocida
la absorbancia de una determinada especie, en principio, se podría obtener la
concentración a partir de la ley de Beer: A = ε b C. Sin embargo, como se
comentó, no es prudente asumir el cumplimiento de dicha ley y utilizar un solo
patrón para determinar la absortividad molar, ε. Asimismo, tampoco es
conveniente basar los resultados de un análisis en un valor de la bibliografía para
obtener ε. Por ello, el método normal de trabajo consiste en la preparación de un
calibrado a partir de una serie de disoluciones patrón, preparadas en las mismas
condiciones que la muestra y obtener los resultados por interpolación.
Cuando se trata de analizar materiales complejos, es muy difícil, si no imposible,
reproducir en los patrones las condiciones de las muestras. En estas ocasiones
suele ser de utilidad el método de adición estándar, con objeto de
contrarrestar los efectos de la matriz. Este método, en análisis
espectrofotométrico, se suele aplicar de la siguiente manera: a varias alícuotas
idénticas de la muestra se adicionan volúmenes variables de una disolución
estándar del analito, de concentración conocida. Se añaden entonces los
reactivos correspondientes al método empleado y cada disolución se enrasa a un
38
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible
volumen fijo, antes de medir la absorbancia*. Si se cumple la ley de Beer, los
datos se representan como en la figura 3.21., a partir de la cual se obtiene el
punto de corte de la recta (obtenida, si es necesario, por ajuste por mínimos
cuadrados) con el eje horizontal y, a partir de ahí la concentración de la muestra
original.
0.6
o
A
o
0.4
o
0.2o
0
5.0
10.0
V, ml
15.0
Figura 3.21. Método de adición estándar para análisis espectrofotométrico.
Análisis de mezclas de sustancias absorbentes
Cuando en una disolución hay varias sustancias que absorben radiación, es posible,
en muchos casos, llevar a cabo su determinación sin necesidad de separar previamente
los distintos componentes. Se va a considerar el caso de que la muestra esté
constituida por los componentes M y N. La forma de proceder depende de los
espectros de absorción de ambas especies, y pueden presentarse los siguientes casos:
Espectros no superpuestos. En estas ocasiones, como se muestra en la figura
3.22, es posible encontrar algunas longitudes de onda a las que absorba solo una
de las especies; λ1 para determinar M y λ2 para determinar N.
A
M
N
λ1
λ2
Figura 3.22. Análisis de mezclas. Espectros no superpuestos.
* Cuando la cantidad de muestra es limitada, las adiciones estándar pueden llevarse a cabo por sucesivas
adiciones de incrementos de una disolución patrón de concentración conocida a una única alícuota del
problema. Las medidas de la absorbancia se hacen en el original y despues de cada adición.
39
Claudio González Pérez
Espectros superpuestos parcialmente. Cuando la situación es como se muestra
en la figura 3.23., la especie N no interfiere en la medida de M a la longitud de
onda λ1, por lo que la determinación de esta especie puede hacerse directamente
a λ1. A continuación se determina la absorbancia de M a la longitud de onda λ2 a
partir de la absortividad molar (en una experiencia previa) y finalmente, se resta
esta contribución de la absorbancia medida a λ2. Con ello se obtiene la
absorbancia del componente N, cuya concentración se calcula posteriormente de
la forma acostumbrada.
M+N
A
M
N
λ2
λ1
Figura 3.23. Análisis de mezclas. Superposición parcial de espectros.
Espectros completamente superpuestos. Como se indica en la figura 3.24. no es
posible encontrar una longitud de onda en la que M y N absorban de forma
exclusiva.
M+N
A
N
M
λ1
λ2
Figura 3.24. Análisis de mezclas. Superposición completa de espectros.
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible
40
En este caso, el problema se resuelve midiendo las absorbancias A1 y A2 a las
longitudes de onda λ1 y λ2 respectivamente, y planteando las ecuaciones
siguientes:
A1 = εM1 b CM + εN1 b CN (a λ1)
A2 = εM2 b CM + εN2 b CN (a λ2)
Esto es posible porque la ley de Beer establece que la absorbancia es una
propiedad aditiva, de forma que la absorbancia total de una disolución a una
longitud de onda dada es igual a la suma de las absorbancias de los componentes
individuales presentes.
En las ecuaciones anteriores, b representa el camino óptico y εM1, εM2, εN1 y εN2
las absortividades molares de M y N a las longitudes de onda λ1 y λ2, que deben
ser determinadas previamente a partir de disoluciones patrón, o mejor, a partir
de las pendientes de sus representaciones de la ley de Beer.
Esta forma de proceder es válida solo si se cumple la ley de Beer y si los dos
componentes se comportan independientemente uno del otro. La mayor precisión
se alcanza cuando se eligen longitudes de onda en las que las diferencias entre
las absortividades molares sean grandes: a λ1, εM grande y εN pequeña, y a λ2, εM
pequeña y εN grande. Sin embargo, no todos los sistemas se comportan de este
modo. Puede ocurrir que exista solapamiento a todas las longitudes de onda y que,
para cada λ, εM>εN. Un procedimiento alternativo para analizar estas muestras
consiste en un método gráfico, cuyo fundamento es el siguiente: la primera de las
ecuaciones anteriores puede escribirse así:
A1
ε M1 b
= CM +
ε N1
ε M1
CN
En lugar de medir A, εM y εN solamente a dos longitudes de onda, se miden estas
magnitudes a varias, para lo cual es necesario disponer de los espectros
correspondientes a los componentes puros y a la mezcla desconocida. Para un
cierto número de medidas, se representan gráficamente los valores de A/εM b
frente a εN/εM, obteniéndose una línea recta. La pendiente de la recta permite
obtener CN y la ordenada en el origen, CM. El método puede extenderse con
facilidad a sistemas de tres componentes. La principal ventaja del método es que
el uso de múltiples puntos a lo largo de todo el espectro, en lugar de utilizar
solamente dos, permite alcanzar un grado superior de precisión y exactitud.
Claudio González Pérez
41
Valoraciones fotométricas
En las valoraciones convencionales, el punto de equivalencia se detecta por medio
de la observación visual del cambio de color, ya sea inherente a uno de los reactivos
(por ejemplo, el permanganato) o producido por un indicador. Los operadores con vista
normal, en condiciones favorables, obtienen fácilmente una precisión de unas cuantas
décimas por ciento. Sin embargo, es difícil o imposible obtener buenos resultados en
casos donde el cambio de color es gradual, o donde los colores de las dos formas no
contrastan claramente. En estos casos puede detectarse el punto final
fotométricamente.
En las valoraciones fotométricas se miden las cambios de absorbancia de una
disolución durante la valoración. Estos cambios de absorbancia indican cambios en la
concentración de alguna especie absorbente de radiación. Para llevar a cabo esta
técnica, el recipiente de valoración puede colocarse directamente en el camino óptico
del instrumento, si bien, esto requiere normalmente alguna modificación del
compartimento de la muestra. Por ello, lo más corriente es la utilización de células de
flujo. La absorbancia medida, a la longitud de onda óptima, después de cada adición de
valorante, se representa frente al volumen de reactivo.
Las curvas de valoración consisten, si la reacción es completa, en dos líneas
rectas que se cortan en el punto final. Para las que son apreciablemente incompletas
se produce una curvatura en las proximidades del punto de equivalencia. En estos
casos, el punto final se obtiene por prolongación de los dos tramos rectos. En la figura
3.25. se muestra la forma de algunas curvas de valoración fotométrica.
La curva a) es típica de la valoración donde solo absorbe el reactivo valorante,
como en la valoración de As(III) con BrO3–—Br– leyendo la absorbancia a la longitud
de onda del bromo. La curva b) es característica de sistemas donde absorbe el
producto de la reacción; por ejemplo, en la valoración de Cu(II) con AEDT. Por otra
parte, cuando el analito se convierte en una especie no absorbente, se obtiene la curva
c). Este es el caso, por ejemplo, de la valoración de p-toluidina en butanol con ácido
perclórico, midiendo a 290 nm. Cuando un analito coloreado se transforma en un
producto incoloro al tratar con un reactivo valorante que también absorbe, se
obtienen curvas como la d). Finalmente, las curvas e) y f) pueden representar la
adición de ligandos para formar dos complejos sucesivos de diferente absortividad.
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible
42
Figura 3.25. Curvas de valoraciones fotométricas.
En la figura 3.26. se muestra la curva de valoración fotométrica de una mezcla de
Bi(III) y Cu(II) con AEDT.
A
Punto final
del Cu
Punto final
del Bi
vol. de AEDT
Figura 3.26. Valoración de una mezcla de Bi(III) y Cu(II) con AEDT.
A la longitud de onda de medida (745 nm), ninguno de los cationes ni el reactivo
absorben, así como tampoco el complejo Bi(III)—AEDT. Este complejo es más estable
que el de Cu(II)—AEDT y se forma en la primera parte de la valoración. Cuando se ha
terminado de formar el complejo Bi(III)—AEDT, comienza la formación del complejo
de Cu(II), aumentando la absorbancia hasta que éste se forma completamente. Se
obtienen dos puntos finales bien definidos.
43
Claudio González Pérez
Las valoraciones fotométricas presentan las siguientes ventajas sobre las
convencionales:
* Con ellas es posible la determinación de sustancias no absorbentes, puesto que
solo es necesario que absorba alguna de estas tres especies: reactivo valorante,
sustancia a valorar o producto de la reacción.
* La presencia de otras sustancias que absorban a la longitud de onda a la que se
mide no origina necesariamente interferencia, ya que solo importa el cambio que
se observa en los valores de la absorbancia.
* Los datos experimentales que realmente interesan se toman muy alejados del
punto de equivalencia. De esta forma, las reacciones empleadas no necesitan
tener constantes de equilibrio tan favorables como las requeridas para una
valoración convencional, que depende de observaciones cerca del punto de
equivalencia. Por la misma razón pueden utilizarse disoluciones más diluidas.
Determinación de constantes de disociación de ácidos y bases.
La determinación espectrofotométrica de constantes de disociación de ácidos y
bases se basa en que el espectro de absorción de moléculas orgánicas con grupos
funcionales ácidos o básicos depende del pH del medio.
Para un ácido débil,
–
HA <—> A + H
+
A
Ka =
pK a = pH + log
–
H
HA
+
HA
A
–
Para determinar el valor de pKa es necesario conocer el pH y las concentraciones
(en sentido estricto, las actividades) de las formas ácida (HA) y básica (A–). La
relación [HA]/[A–] puede obtenerse espectrofotométricamente si se conocen las
correspondientes absortividades molares, εHA y εA–, las cuales, a su vez, pueden
obtenerse desplazando el equilibrio de forma virtualmente completa hacia la derecha
y hacia la izquierda mediante la adición de un exceso de base y de ácido
respectivamente.
Según la ecuación anterior, cuando [HA] = [A–], pKa = pH y este valor de pH
corresponde a la mitad de la curva de valoración fotométrica, esto es, al 50 % de la
44
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible
valoración del ácido HA. Este punto puede obtenerse representando gráficamente la
absorbancia a una determinada longitud de onda frente al pH. En la figura 3.27. se han
representado los espectros de absorción de un indicador ácido-base a distintos
valores de pH.
615 nm
A
9
8
7.5
7
6.5
6
400
500
600
λ
700
6
7
8
9
pH
Figura 3.27. Espectros a varios pH y variación de la absorbancia con el pH a =625 nm
El punto donde se cruzan los espectros se denomina punto isosbéstico. La
presencia de un punto isobéstico evidencia que el equilibrio en cuestión implica solo
dos especies absorbentes.
Cuando se representa la absorbancia a 615 nm frente al pH (curva de la derecha
en la figura 2.27.) se obtiene una curva en forma de S. La parte izquierda corresponde
a la forma ácida del indicador, mientras que la parte superior derecha corresponde a
la conversión casi total en la forma básica. Debido a que el pKa se define como el valor
de pH en el cual una mitad del indicador está en la forma ácida y la otra mitad en la
forma básica, dicho pKa se determina por el punto de inflexión.
Determinación de la estequiometría de complejos
El principal interés de la técnica espectrofotométrica para determinar la
composición de complejos en disolución reside en el hecho de que pueden efectuarse
medidas sin perturbar los equilibrios que se consideran. Con esta finalidad se utilizan
fundamentalmente los siguientes métodos:
Método de las variaciones continuas. Considérese que pueden formarse varios
complejos,
Claudio González Pérez
45
M + L <—> ML
M + 2 L <—> ML2
……etc
pero que en ciertas condiciones predomina uno. Para determinar la estequiometría del
complejo predominante por el método de las variaciones continuas, el procedimiento a
seguir consiste en preparar mezclas de diferentes concentraciones de M y L, pero
manteniendo constante la concentración final (en la práctica, se preparan disoluciones
del catión y del ligando de concentraciones idénticas y se mezclan en distintas
relaciones de volumen, pero de modo que el volumen total sea constante).
La absorbancia de cada disolución se mide a una longitud de onda apropiada y se
representa gráficamente la absorbancia corregida (absorbancia medida menos las
absorbancias de M y L libres*) frente a la fracción molar de L. Se obtiene una gráfica
donde la absorbancia máxima se corresponde con la estequiometría del complejo
predominante. En la figura 3.28. se muestra la variación de la absorbancia para dos
complejos de estequiometría ML2.La curvatura de las líneas experimentales es el
resultado de no haberse completado la reacción de formación del complejo (de hecho,
se ha desarrollado algún método para la determinación de constantes de formación de
complejos, basado en la medida de las desviaciones con relación a las líneas rectas
teóricas indicadas en la figura). Cuando se forma un complejo muy estable se obtiene
una curva como la B, y cuando es poco estable, como la curva C. Por otra parte, la
representación dará un mínimo si el complejo absorbe menos que los reactivos.
Figura 3.28. Variaciones continuas para dos complejos ML2.
* En muchas ocasiones, M ó L (o ambos) no absorben a la longitud de onda de interés, de manera que no es
necesaria la corrección.
46
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible
Método de la relación molar. Este método es similar al anterior, excepto que aquí se
mantiene constante la concentración de uno de los componentes (a menudo, el ión
metálico) mientras que el otro se hace variar.
Al representar la absorbancia del complejo frente a la relación en moles de los
reactivos, se obtienen líneas rectas de diferente pendiente, produciéndose la
intersección en una relación que corresponde a la estequiometría del complejo (figura
3.29.) En el complejo ML representado en la figura 3.29. el catión metálico absorbe a
la longitud de onda de medida, puesto que el punto inicial tiene una absorbancia mayor
que cero. Por su parte, en el complejo ML2 el ligando absorbe a la longitud de onda a la
que se midió, por lo que la pendiente del segundo tramo es mayor que cero.
.
ML
1.2
A
1.0
0.8
.
ML2
0.6
0.4
0.2
0
1
2
3
[L] /[M]
Figura 3.29. Método de la relación molar.
El método de la relación molar presenta sobre el de las variaciones continuas las
siguientes ventajas: en primer lugar distingue mejor entre complejos de números de
coordinación altos; por ejemplo, entre ML5 y ML6 (xL=0.83 y xL=0.87). Además, y en
otro orden de cosas, los datos experimentales indican claramente el exceso de
reactivo necesario para que el complejamiento sea total, lo cual es muy útil en
procedimientos analíticos. Por otra parte, y esto puede considerarse una desventaja,
el gran exceso de reactivo puede conducir a formar complejos de orden superior.
47
Claudio González Pérez
ESPECTROFOTOMETRIA DE DERIVADAS
La espectrofotometría de derivadas es una técnica que se conoce desde hace
mucho tiempo, pero que se ha desarrollado en época relativamente reciente, sobre
todo por la falta de instrumentación a un precio razonable. Actualmente, la utilización
de sistemas electrónicos de diferenciación mediante el empleo de un micro ordenador
acoplado en serie con el espectrofotómetro permite la representación de derivadas
de primero, segundo e incluso órdenes superiores de la absorbancia frente a la
longitud de onda:
dA
para la primera derivada
dλ
2
d A
2
para la segunda derivada
dλ
siendo A la absorbancia y λ la longitud de onda.
La primera derivada de un espectro original también puede definirse como la
representación gráfica de la pendiente de la curva de absorción a cada longitud de
onda. En la figura 3.30. se muestran las características del espectro de la primera y
de la segunda derivada para el caso de un pico de absorción simétrico.
A
A
1ª derivada
2ª derivada
Figura 3.30. Pico de absorbancia simétrico y su primera y segunda derivada.
En el espectro de la primera o de la segunda derivada, la señal de ordenadas no
es proporcional al valor de absorción, sino a la pendiente del espectro normal. Por ello,
como la pendiente en el espectro normal puede tener valores positivos y negativos, el
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible
48
espectro de derivadas presenta valores positivos y negativos en la escala de
ordenadas, o bien, máximos y mínimos, según el carácter de la pendiente. Para una
sustancia absorbente, la posición de la longitud de onda y la relación entre los valores
de los extremos (máximos y mínimos) representa una magnitud característica.
La utilización de la espectrofotometría de derivadas presenta las siguientes
ventajas:
* Medida exacta de λmax. Mientras que en el espectro normal, especialmente en
el caso de bandas de absorción anchas, la posición correspondiente a la longitud de
onda del máximo solo puede ser fijada de manera aproximada, mientras que en la
primera derivada del espectro, la posición del máximo viene definida exactamente por
el paso de la curva por el valor cero.
* Mejor resolución de los espectros. En el espectro normal, la estructura fina
puede ser difícil de ver. En estos casos, es más conveniente emplear la segunda
derivada, ya que los máximos y mínimos del espectro normal y de la segunda derivada
aparecen prácticamente a las mismas longitudes de onda y la estructura fina del
espectro normal se pone de manifiesto mejor que en la primera derivada. En la
práctica analítica normal esto tiene gran importancia, ya sea con fines de
identificación, como criterio de pureza o para control de calidad.
* Determinaciones en presencia de turbidez. Las disoluciones turbias presentan
en general un aumento continuo de la absorbancia hacia longitudes de onda más cortas
y no ocasionan, por consiguiente, ninguna variación espectral importante en la primera
y segunda derivada, al menos para un nivel de turbidez no demasiado elevado.
* Determinaciones cuantitativas en presencia de dos o más componentes. La
determinación cuantitativa de componentes con bandas de absorción relativamente
estrechas y que estén solapadas con una banda ancha de un segundo componente es
uno de los campos de aplicación más extensos de esta técnica.
Cuando el componente que se desea determinar solo es visible en el espectro
total por un pequeño pico o por un hombro, la utilización de métodos convencionales
puede implicar grandes errores. Sin embargo, la primera o segunda derivadas de un
espectro de dos componentes permite, bajo ciertas condiciones, ver claramente los
diferentes compuestos y hacer determinaciones cuantitativas con errores
sistemáticos muy pequeños o incluso despreciables (figura 3.31.)
49
Claudio González Pérez
Espectro normal
1ª derivada
a)
b)
Figura 3.31. Espectro normal y primera derivada. a) un componente. b) dos componentes.
En la figura 3.31. se han representado los espectros normales y la primera
derivada de un componente caracterizado por una pequeña banda a) y el mismo
componente "oscurecido" por la presencia de otra especie con una banda de absorción
más ancha.
EJERCICIOS
1. Dadas las siguientes sustancias: pentano, pentanol, clorohexano, butadieno,
benceno, fenol, amoniaco, butilamina, ácido acético, benzopireno, ozono, ¿Absorberán
radiación visible?. ¿Cuáles absorberán radiación ultravioleta?. Justifíquelo.
2. Se determinó la absortividad molar de un compuesto químico midiendo la
absorbancia de una disolución de concentración conocida utilizando una cubeta de 1
cm. Se obtuvo el valor de 2.2x104 L mol–1 cm–1. ¿Qué valor se obtendría si se utilizase
una cubeta de 10 cm?. ¿Qué espesor (camino óptico) debería tener la cubeta para que
la misma disolución presente una transmitancia del 8.42 %?
3. En disoluciones acuosas neutras, el fenol tiene una absortividad molar de
1.8x104.mol–1.cm–1. ¿Qué intervalo de concentraciones de fenol pueden determinarse si
los valores de las absorbancias en cubetas de 10 cm deben limitarse a valores de 0.2 a
0.9 unidades de absorbancia?.
4. Se trata de determinar la concentración de Fe(III) en un agua mineral. Para
ello, se pipetean alícuotas de 10 mL de la muestra en matraces aforados de 50 mL. Se
adicionan a cada uno exactamente 0, 5, 10, 15 y 20 mL de una disolución patrón que
50
Espectrofotometría de absorción ultravioleta-visible
contiene 11.1 p.p.m. de Fe(III), seguido de un exceso de ion tiocianato, para formar
complejo rojo Fe(SCN)2+. Después de enrasar a 50 mL, las absorbancias de las cinco
disoluciones medidas a 580 nm (longitud de onda de máxima absorción) fueron 0.240,
0.437, 0.621, 0.809 y 1.009 respectivamente (cubetas de 1 cm). Obtener la
concentración de Fe(III) en la muestra de agua.
5. Se analizó espectrofotométricamente una mezcla de dicromato y
permanganato, en medio ácido sulfúrico 1 M y utilizando cubetas de 1 cm. Para ello, se
midieron las absorbancias a 440 y a 545 nm, obteniendo los valores de 0.385 y 0.653
respectivamente. Previamente, se encontró que la absorbancia de una disolución de
dicromato 8.33x10–4 M era de 0.308 a 440 nm y de 0.009 a 545 nm. Análogamente,
una disolución de permanganato 3.77x10–4 M presentó una absorbancia de 0.035 a 440
nm y de 0.886 a 545 nm. Calcular las concentraciones de permanganato y de dicromato
en la mezcla analizada.
6. Se determinó la estequiometría de un complejo MLn por el método de las
variaciones continuas y el de la relación molar, partiendo de disoluciones de M y de L
0.0100 molar. Para aplicar el primer método se mezclaron los volúmenes de cada una
de ellas que se indican en la tabla, obteniendo los correspondientes valores de
absorbancia. Para el método de la relación molar, se añadieron los volúmenes de L
indicados en la tabla a 5.0 mL de la disolución de M, enrasando al mismo volumen en
todos los casos.
Variaciones continuas
Relación molar
mL de M
mL de L
A
mL de L
A
10.0
9.00
8.00
7.00
6.00
5.00
4.00
3.00
2.00
1.00
0.00
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
8.00
9.00
10.0
0.000
0.130
0.261
0.399
0.530
0.660
0.799
0.750
0.500
0.252
0.000
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
8.00
12.0
14.0
0.000
0.080
0.181
0.269
0.360
0.447
0,540
0.628
0.720
0.900
0.900
Obtener la estequiometría del complejo MLn.