Efectos de la suplementación con ácido butírico sobre la

Resumen: V-010
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2006
Efectos de la suplementación con ácido butírico sobre la carcinogénesis
experimental del colon en ratas tratadas con 1,2-dimetilhidrazina.*
Catuogno, María S. - Montenegro, María A. - Sánchez Negrette, Marcial
Cátedra Patología General y Sistemática. Facultad de Ciencias Veterinarias de la UNNE.
Sargento Cabral 2139 – Corrientes 3.400 – E- mail: patgral@vet.unne.edu.ar
* Trabajo subsidiado por la SGCyT. UNNE.
Introducción
En los seres humanos, los tumores del intestino grueso constituyen una causa de morbilidad y mortalidad en gran parte
del mundo. Factores dietéticos y del medio ambiente son considerados como responsables del 85-90% de los casos. La
relación entre el cáncer de colon y componentes de la dieta, tales como grasas, fibras vegetales, vitaminas y otros
elementos, han sido evaluados en estudios epidemiológicos, así como en trabajos experimentales (6,9,10,11). En este
sentido, estudios experimentales con animales de laboratorio y estudios in Vitro, han demostrado que la leche de vaca
contiene numerosos componentes con potencial de inhibir el proceso de la carcinogénesis. Tales componentes lo
constituyen la esfingomielina, el ácido linoleico conjugado, el ácido butírico, la vitamina A y D, así como el calcio,
entre otros (3,7). Investigaciones microbiológicas han reportado que la flora anaeróbica del intestino grueso y del rumen
en mamíferos producen Acidos Grasos de Cadena Corta (AGCC) entre los que se encuentran el ácido butírico que
juega un importante rol en la regulación del crecimiento celular, ya que promueve la proliferación lenta de las células
pero a la vez estimula la proliferación de criptas normales e inhibe el crecimiento in Vitro de líneas celulares de cáncer
de cólon (1,4,5,8). Por otra parte, se considera al ácido butírico como un potente inductor de diferenciación in Vitro para
una amplia variedad de células neoplásicas, incluyendo leucemia, linfoma, glándula mamaria, colon, recto, hígado,
cervix y ovario (2). También induce apoptosis por modulación de genes proapoptóticos y antiapoptóticos y posee efectos
antiinflamatorios. (5)
Los efectos de la dieta láctea sobre la carcinogénesis experimental del intestino grueso en ratas, fueron estudiados por
nuestro grupo de investigación, utilizando diversos tipos de leche: leche entera en polvo, leche descremada en polvo,
leche fresca de vaca y de búfala. En dichas experiencias hemos observado disminución del desarrollo de neoplasias del
colon. Debido a que en trabajos previos siempre utilizamos leche entera o parcialmente descremada, no sabemos cual de
los componentes normales de la leche con potencial de inhibir el desarrollo de neoplasias del intestino han podido ser
responsables de la disminución del desarrollo de los tumores intestinales. Es así que continuando en la misma línea de
investigación, el presente plan tiene por objetivo determinar los efectos de la suplementación con ácido butírico, un
componente normal de la leche, sobre el desarrollo de neoplasias del colon en un modelo de carcinogénesis
experimental del intestino grueso inducida con la droga cancerígena 1,2-dimetilhidrazina. El mismo forma parte de una
línea de investigación que viene desarrollando nuestro grupo de trabajo.
Materiales y Métodos
Fueron utilizadas ratas Wistar, machos, de 6 semanas de edad, con un peso promedio de 160 gr. Las mismas fueron
alojadas en jaulas individuales en ambiente con temperatura controlada de 21 ºC, mantenidas con agua y dieta adlibitum. El ácido butírico (AcBu) fue administrado en el agua de bebida a la concentración de 4 mg/ml. Las neoplasias
en el intestino grueso fueron inducidas mediante una inyección subcutánea semanal de DMH durante 17 semanas a la
dosis de 20 mg/kg de peso corporal.
Los animales fueron divididos al azar en dos grupos con diferentes lotes de la siguiente manera: Grupo Control (sin la
administración de DMH) compuesto por lote 1 (sin tratamiento. n =10), lote 2 (tratado con AcBu. n=20) y Grupo
experimental (con la administración de DMH) compuesto por lote 3 (tratado sólo con DMH n=20), lote 4 (tratado con
DMH + AcBu. n=20).
Se utilizó ácido butírico con pureza 99% de Sigma-Aldrich, el cual fue administrado en el agua de bebida 14 días antes
del primer tratamiento con DMH y continuado hasta el momento del sacrificio de los animales transcurridas las 26
semanas de iniciada la experiencia.
La DMH (Symetrical Dimethylhydrazine Dihydrochloride – Sigma, Chem. Co-) fue preparada como una solución
madre conteniendo 400 mg de DMH disuelta en 100 ml de agua destilada estéril conteniendo 37 mg de EDTA como
agente estabilizador y mantenida a pH 6,5 con hidróxido de sodio. Esta solución fue preparada cada semana, momentos
antes de cada inoculación.
Todos los animales fueron sacrificados 8 semanas posteriores a la última dosis de DMH. En cada uno de los animales el
intestino grueso en su totalidad fue extraído, abierto longitudinalmente mediante un corte sobre el lado opuesto a la
inserción mesentérica, a fin de observar la mucosa y la presencia de lesiones. Luego se procedió a lavar la mucosa a fin
de eliminar restos de materia fecal, para seguidamente ser fijado en formol bufferado al 10 % durante 24 horas. Con el
intestino extendido, lavado y fijado se procedió a realizar mediante lupa el examen macroscópico. Se evaluó el número,
el tamaño, la forma y la localización de los tumores en las distintas porciones del intestino grueso. Para tal fin el
intestino grueso fue dividido anatómicamente en 4 partes: recto, colon distal, colon proximal y ciego.
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Los tumores fueron clasificados macroscópicamente en 2 categorías: tumores polipoides: con sus variantes, pediculado
y de base sésil y tumores no polipoides: con sus variantes, plano y ulceroinfiltrante. Todos los tumores fueron extraídos
y procesados para su posterior estudio microscópico. El resto del intestino grueso fue cortado en segmentos y enrollados
sobre sí mismos siguiente la técnica del rollo suizo. Posteriormente los tumores y cada uno de los cilindros fueron
procesados según la técnica histológica clásica para bloques parafinados, cortados en micrótomo tipo Minot, en 5µm de
espesor y coloreados con la técnica de Hematoxilina-Eosina.
Fueron analizados cortes histológicos de cada uno de los segmentos del intestino grueso (ciego, colon proximal, colon
distal y recto) a fin de detectar, localizar y caracterizar a los tumores. Microscópicamente los tumores fueron
clasificados en adenomas tubulares (AT), adenomas tubulovellosos (ATV), adenocarcinomas simples (ACS),
carcinomas de células en anillo de sello (Ccas), carcinomas mucinosos (Cmu) y carcinomas mixtos (Cmix).
Resultados
Número de Tumores:
El lote DMH presentó en total 166 tumores, con un promedio de tumores por rata (t/r) de 8,3; el lote AcBu+DMH
presentó 142 tumores con 7,47 (t/r). El mayor número de tumores observados por rata fue en el lote DMH de n= 19
tumores y en el lote AcBu + DMH de n=16 tumores.
Tamaño de Tumores:
El tamaño de los tumores osciló desde 1 milímetro hasta 20 mm. Los mismos fueron agrupados según los siguientes
rangos: entre 1-5mm, 6-10mm, 11-15mm y 16-20mm. (Tabla 1).
Tabla 1.Tamaño de los tumores en los lotes tratados con DMH, con y sin la adición de Acido Butírico
Tamaño
Lotes
DMH
1-5mm
(%)
6-10mm
(%)
11-15mm
(%)
16-20mm
(%)
+ 20mm
(%)
Total
91 (68,94)
34 (25,76)
5 (3,78)
1 (0,76)
1 (0,76)
132
79 (66,95)
33 (29,97)
6 (5,04)
-
-
118
AcBu + DMH
( )Los números entre paréntesis corresponden a porcentajes sobre el total de cada lote.
DMH: Lote tratado con 1,2-dimetilhidrazina; AcBu + DMH: Lote tratado con Acido Butírico y 1,2-dimetilhidrazina.
El mayor porcentaje de los tumores se ubicó en los rangos que van entre 1 a 5mm y entre 6 a 10 mm, no existiendo
diferencias significativas entre los diferentes lotes.
Aspecto macroscópico:
En la Tabla 2 se especifican los 4 tipos macroscópicos de tumores estudiados por cada uno de los lotes tratados así
como el porcentaje correspondiente.
Tabla 2: Aspecto macroscópico de tumores en los lotes tratados con DMH, con y sin la adición de Acido Butírico.
T. Macroscópico
P. Pedic.
(%)
P. Sesil
(%)
Plano
(%)
61 (46,21)
70
(59,32)
56 (42,42)
30
(25,42)
Ulceroinf.
(%)
Total
Lotes
DMH
AcBu + DMH
7
(5,30)
12
(10,17)
8
(6,06)
6
(5,08)
132
118
( )Los números entre paréntesis corresponden a porcentajes sobre el total de cada lote.
P.Pedic: Polipoide Pediculado; P.Sesil: Polipoide Sesil; Ulceroinf: Ulceroinfiltrante
DMH: Lote tratado con 1,2-dimetilhidrazina; AcBu + DMH: Lote tratado con Acido Butírico y 1,2-dimetilhidrazina.
Analizando ambos lotes se puede observar que los animales tratados con ácido butírico mostraron mayor desarrollo de
tumores polipoides ( n=82), mientras que el lote DMH presentó igual desarrollo de tumores polipoides (n= 68) y no
polipoides (n= 64).
Examen microscópico del I ntestino Grueso:
Se realizó el estudio morfológico de cada tumor, considerando el tipo histológico y la frecuencia de cada tipo.
- Tipo histológico:
En la Tabla 3 se especifican los tipos histológicos de tumores distribuidos en cada lote.
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Tabla 3: Tipos Histológicos de tumores en los lotes tratados con DMH, con y sin la adición de Acido Butírico.
T. Histológico
AT
ATV
ACS
Ccas
Cmu
Cmix
Total
DMH
-
-
131
23
2
10
166
AcBu + DMH
1
1
126
3
-
11
142
Lotes
AT (adenoma tubular); ATV (adenoma tubulovelloso); ACS (adenocarcinoma simple); Ccas (carcinoma de
células en anillo de sello), Cmu (carcinoma mucinoso), Cmix (carcinoma mixto); DMH: Lote tratado con 1,2dimetilhidrazina; AcBu + DMH: Lote tratado con Acido Butírico y 1,2-dimetilhidrazina; T. Histológico: Tipo Histológico.
- Frecuencia de los diferentes tipos histológicos.
El lote DMH presentó 166 tumores ,132 hallados macroscópicamente y 34 en el estudio microscópico, siendo
todos malignos.
El lote AcBu+DMH presentó 142 tumores, 118 hallados macroscopicamente y 24 en el estudio microscopico,
de los cuales fueron 2 benignos y 140 malignos. El numero de neoplasias correspondientes a Ccas y Cmu, fue mayor en
el lote sin la suplementacion con Acido butirico (n=25) y 3 en el lote DMH + Ac. Bu. respectivamente. Además, el lote
Ac. Butírico no presento neoplasias del tipo Cmu. Con respecto a los tumores mixtos y ACS, no se observaron
diferencias entre ambos lotes.
Discusión
Los estudios preliminares indican que las ratas suplementadas con ácido butírico no presentaron diferencias
significativas en cuanto al número total de tumores con respecto al lote DMH control, no obstante se observó en el lote
suplementado con ácido butírico menor desarrollo de neoplasias del tipo planas y ulceroinfiltrantes, así como de
carcinomas en anillo de sello, considerados como los tumores de comportamiento más agresivo en cuanto a su
capacidad infiltrante y de dar metástasis. Por otra parte, en el lote suplementado con Acido butírico, se desarrollaron
neoplasias benignas. Estos resultados permiten inferir que el desarrollo de ciertos tipos de neoplasias puede ser
influenciado por el tipo de dieta utilizada. En esta experiencia los animales que recibieron ácido butírico desarrollaron
no solo menor número de neoplasias sino fundamentalmente desarrollaron menor número de tumores de
comportamiento agresivo.
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