Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 1998,17 (2), 542-549 Normas internacionales sobre métodos y sueros de referencia para pruebas de diagnóstico por detección de anticuerpos P.F. W r i g h t Canadian Food Inspection Agency, National Centre for Foreign Animal Disease, 1015 Arlington Street, Suite T2300, Winnipeg, Manitoba R3E 3M4, Canadá Resumen Las normas internacionales son necesarias para garantizar que las pruebas de diagnóstico que aplican las distintas partes implicadas en una transacción comercial cumplen unos requisitos mínimos de rendimiento diagnóstico. Las pruebas empleadas para autorizar el traslado internacional de animales deben ofrecer un margen holgado de confianza en que los animales que arrojan un resultado negativo, y cuyo traslado por consiguiente se autoriza, estén efectivamente libres de un determinado agente infeccioso. Sin la elaboración de estándares internacionales para pruebas de diagnóstico es imposible alcanzar un cierto nivel de armonización internacional. En lo que se refiere a métodos y sueros, las normas sirven para establecer un marco de referencia a partir del cual pueda inferirse el rendimiento diagnóstico que presenta una prueba concreta realizada en un laboratorio determinado. Los ensayos estándar internacionales sientan un patrón de rendimiento analítico y diagnóstico al que deberá ajustarse cualquier nuevo reactivo o nueva metodología. Los sueros de referencia internacionales, por su parte, constituyen sueros primarios de referencia, útiles a un tiempo para calibrar ensayos y reactivos y como prototipo para preparar sueros de referencia tanto nacionales como de trabajo. Para la mayoría de los métodos de análisis serológico es preciso instituir tres sueros de referencia: uno fuertemente positivo, uno débilmente positivo y uno negativo. Esos estándares se utilizan como patrón para calibrar el intervalo de detección y la sensibilidad analítica de la prueba en cuestión. Los ensayos así calibrados tenderán a presentar una sensibilidad y una especificidad de diagnóstico que coincidan con las del ensayo de referencia, lo que a su vez facilitará un mayor grado de armonización internacional. Palabras clave Comercio internacional - Ensayo inmunoenzimático - Especificidad - Estándares de referencia - Fijación del complemento - Inmunodifusión en gel de agar - Neutralización viral - Sensibilidad - Técnicas serológicas. Introducción Uno de los principales cometidos de la Oficina Internacional de Epizootias (OIE) es la armonización de las normas que regulan el comercio de animales o productos de origen animal entre sus Países Miembros. Las pruebas de diagnóstico empleadas para autorizar el traslado internacional de animales o productos de origen animal son parte integrante de esa normativa. A efectos de comercio internacional, la OIE reconoce dos categorías distintas de pruebas diagnósticas. En la primera categoría figuran las pruebas «prescritas», cuya aplicación previa al traslado internacional de animales es exigida por el Código Zoosanitario Internacional de la OIE (5). Sin embargo, en la actualidad no existen pruebas prescritas para todas las enfermedades que figuran en las Listas A y B de la OIE (5). Por tal motivo hay una segunda categoría, la de las pruebas «de sustitución», que son adecuadas para diagnosticar una enfermedad en ciertos contextos locales y 543 Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 17 (2| pueden usarse, previo acuerdo bilateral entre las partes implicadas, para la importación o exportación de animales. Con independencia de la categoría de la que se trate, es patente la necesidad de disponer de sueros y ensayos de referencia internacional para las pruebas de diagnóstico. Este artículo aborda algunos de los aspectos más importantes relativos a la elaboración de esos estándares internacionales para pruebas de diagnóstico por detección de anticuerpos contra agentes infecciosos. Rendimiento diagnóstico Valor predictivo Los estandares internacionales son necesarios para garantizar que las pruebas de diagnóstico que aplican las partes implicadas en una transacción comercial cumplen unos requisitos mínimos de rendimiento diagnóstico. Las pruebas empleadas para autorizar el traslado internacional de animales deben ofrecer un margen holgado de confianza en la probabilidad de que los animales que arrojan resultado negativo, y cuyo traslado por consiguientes se autoriza, estén efectivamente libres de un determinado agente infeccioso. Ese margen de confianza es lo que suele conocerse como el «valor predictivo» del resultado de una prueba. Aunque tanto los resultados positivos como los negativos sean importantes, y aunque ambos posean su propio valor predictivo, el de un resultado negativo reviste una importancia capital para los intercambios internacionales, pues representa la probabilidad de que un animal que arroja un resultado negativo se encuentre realmente libre de la infección. Tres son los factores básicos que influyen sobre el valor predictivo de una prueba, ya se trate de un diagnóstico positivo o negativo: a) la sensibilidad de diagnóstico, b) la especificidad de diagnóstico, c) la prevalencia de la enfermedad ( 1 , 9 ) . La sensibilidad y la especificidad de diagnóstico son rasgos característicos del ensayo. La prevalencia de la enfermedad guarda obviamente relación con las circunstancias sanitarias que reinan en el país exportador y rodean la aplicación de la prueba. Sensibilidad de diagnóstico La sensibilidad de diagnóstico de una prueba equivale a la proporción de animales a ciencia cierta infectados que arrojan un resultado positivo, esto es, la proporción de resultados verdaderos positivos. Los resultados negativos arrojados por animales infectados se consideran falsos negativos. Para estimar la sensibilidad de diagnóstico es necesario analizar el mayor número posible de muestras, con objeto de obtener una representación lo más amplia posible del espectro de títulos de anticuerpos que se espera en una población infectada (9). Habida cuenta de la gama infinita de títulos de anticuerpos que pueden hallarse, resulta extremadamente difícil realizar esta estimación con cierto margen de confianza. Especificidad de diagnóstico La especificidad de diagnóstico de una prueba se define como la proporción de animales a ciencia cierta no infectados que dan resultados negativos, esto es, la proporción de resultados verdaderos negativos. Se considera falso positivo a todo resultado positivo arrojado por un animal no infectado. Por regla general, la estimación precisa de este parámetro exige el análisis de miles de muestras procedentes de animales no infectados (9). Los resultados falsos positivos suelen ser infrecuentes e impredecibles, y pueden darse en proporciones de uno o dos por cada mil muestras examinadas. Conviene señalar que los valores predictivos, tanto los positivos como los negativos, se calculan a partir de la prevalencia de la enfermedad y de estimaciones de. la sensibilidad y especificidad de diagnóstico. Los errores en dichas estimaciones se acumulan pues en el cálculo del valor predictivo, razón más que suficiente para realizar las estimaciones de la manera más exacta posible. La sensibilidad y especificidad de diagnóstico vienen influidas a su vez por dos factores: a) la sensibilidad analítica, b) la especificidad analítica. Ambos parámetros son inherentes al ensayo y dependen a su vez de los reactivos que se elijan y del método analítico al que se apliquen. Sensibilidad analítica La sensibilidad analítica de una prueba serológica mide la cantidad más pequeña de anticuerpos que puede detectarse en una muestra de ensayo. «Anticuerpo» es un término funcional, referido a toda inmunoglobulina inducida en respuesta a la infección por un determinado agente patógeno y capaz de reconocer a un antígeno presente en dicho agente o derivado de él. En esta categoría se inscriben las inmunoglobulinas de cualquier isotipo (por ejemplo, IgM, lgG lgG , IgA, etc.). No todos los isotipos se detectan necesariamente con igual eficiencia. Ello dependerá del método de prueba del que se trate. La sensibilidad analítica suele calcularse determinando la dilución que corresponde al punto final en las muestras examinadas. En otros casos se infiere a partir del tiempo que media entre la infección y el primer momento en que el anticuerpo es detectable. lt 2 Especificidad analítica La especificidad analítica de un ensayo serológico mide la capacidad de la prueba para detectar anticuerpos especialmente significativos para el diagnóstico de la infección en cuestión, esto es, la capacidad de la prueba para detectar anticuerpos que identifiquen exclusivamente al agente etiológico, y no otros anticuerpos cuya presencia pueda venir 544 inducida por antigenos de otros microorganismos (emparentados o no con el agente en cuestión) provistos de reactividad cruzada. Existen diversas formas de influir en la especificidad analítica de un ensayo. Los sistemas más comúnmente utilizados consisten en: utilizar antígenos formados por subunidades específicas; diseñar el ensayo de tal manera que detecte isotipos de anticuerpos singularmente específicos y significaüvos para el diagnóstico; o utilizar anticuerpos monoclonales de gran especificidad en ensayos de competición o bloqueo. La especificidad analítica se determina analizando paneles de muestras procedentes de animales infectados por un agente infeccioso del que se sabe que expresa antígenos con reactividad cruzada. Evidentemente, todos los parámetros hasta aquí descritos están relacionados entre sí y dependen unos de otros. Todos ellos influyen sobre el rendimiento diagnóstico total de una prueba dada y, en última instancia, sobre la confianza que es posible depositar en un resultado. Sin la elaboración de normas que encuadren tanto los métodos de prueba como los productos de referencia, nunca será posible alcanzar un cierto nivel de armonización internacional. En lo que se refiere a métodos y sueros, los estándares internacionales sirven para establecer un marco de referencia a partir del cual pueda inferirse el rendimiento diagnóstico que presenta una prueba concreta realizada en un laboratorio determinado. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 17 (2] Los estándares internacionales en ensayos son importantes en este contexto porque ofrecen valores de referencia para la sensibilidad y especificidad de diagnóstico y para la preparación y caracterización de sueros estándar internacionales. Algunas de las pruebas serológicas clásicas, como las de fijación del complemento, aglutinación, precipitación o neutralización viral, constituyen desde hace décadas pruebas prescritas para el comercio. Con el paso de los años, la obtención de reactivos más refinados y el progreso de las técnicas de laboratorio sobre las que esas pruebas reposan se han traducido en un incremento de su rendimiento analítico y diagnóstico. Ahora bien, considerando los enormes esfuerzos invertidos en el desarrollo de ensayos de fijación primaria, especialmente en el ámbito de las técnicas inmunoenzimáticas, es sorprendente el escaso número de tales ensayos que constituyen pruebas prescritas para el comercio internacional. Tal situación está sin embargo cambiando hoy en día, gracias a la elaboración de normas internacionales referidas concretamente a las mencionadas técnicas inmunoenzimáticas y, de manera más general, a la validación de todo tipo de ensayos (17). Estas son sólo dos de las razones por las cuales la OIE ha creado una red de Laboratorios de Referencia y Centros Colaboradores, dedicada a concebir y estandarizar nuevos métodos de prueba y a coordinar la validación de esos métodos a nivel internacional. Documentación Ensayos de referencia Los métodos de diagnóstico por detección de anticuerpos que se describen en el Manual of standards for diagnostic tests and vaccines de la OIE (citado a continuación como el Manual de la OIE) (8) y vienen definidos en él como pruebas prescritas constituyen los estándares internacionales actualmente vigentes. Las pruebas prescritas ofrecen un margen de confianza aceptable en la probabilidad de que los animales que arrojan un resultado negativo estén efectivamente libres de un agente infeccioso concreto. Con fines comerciales también se pueden utilizar, previo acuerdo bilateral entre las partes implicadas, pruebas «de sustitución», aunque es posible que estas pruebas no ofrezcan un margen de confianza igual al de las pruebas prescritas, o que no hayan sido validadas de manera tan rigurosa como lo exige la Comisión de Normas de la OIE. Decir que todas las pruebas prescritas ofrecen un mismo margen de confianza seria exagerado, pues no todas ellas presentan idéntico nivel de rendimiento analítico o diagnóstico. No obstante, una prueba prescrita actualmente aceptada como método de referencia constituye una herramienta muy útil para el diagnóstico de una enfermedad infecciosa. Pero es preciso recordar que hay muchas enfermedades para las cuales no existe hoy por hoy ninguna prueba prescrita, y que por consiguiente las pruebas de diagnóstico no son el único elemento de decisión a la hora de autorizar el traslado internacional de animales. Un ensayo estándar internacional debe venir referenciado y/o documentado de manera detallada y exhaustiva. Es preciso describir con sumo detalle los reactivos biológicos, sobre todo los aspectos relacionados con su composición, pureza, actividad biológica y nivel de seguridad o inocuidad biológica. Cuando los reactivos biológicos se hayan obtenido a partir de cultivos o cepas de referencia, será necesario especificarlos. Deben citarse todas las referencias pertinentes para la preparación y estandarización de cualquier reactivo biológico. Debe indicarse asimismo qué proveedores comerciales proporcionan reactivos biológicos de calidad aceptable, y detallar los protocolos de titulación necesarios para optimizar la actividad de esos reactivos. Es preciso describir la pureza química, formulación, pH y fuerza iónica de cualquier reactivo químico o solución tampón, e indicar todos los parámetros físicos de tiempo, temperatura, incubación, etc., que intervienen en el ensayo. También será objeto de minuciosa descripción el instrumental y el material desechable que deben utilizarse, sobre todo cuando su sustitución pueda afectar el rendimiento del ensayo. No faltarán tampoco orientaciones relativas a los procedimientos de control interno de calidad, al cálculo de los resultados y a la interpretación de los datos. Las descripciones de métodos de referencia contenidas en los diversos capítulos del Manual de la OIE cumplen en su mayoría todos estos requisitos. Validación También es preciso validar de forma adecuada los métodos de referencia. Además de figurar en el Manual de la OIE (9), esta cuestión está tratada con todo lujo de detalles en otro artículo 545 Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 17 (2) de este número de la Revista científica y técnica (4), razón por la cual no será discutida. No está de más recordar, sin embargo, que la Comisión de Normas de la OIE exige la validación exhaustiva de cualquier ensayo que se proponga como prueba prescrita. Ello significa que hay que presentar datos sobre la sensibilidad y especificidad analíticas del método en cuestión, así como estimaciones de su sensibilidad y especificidad de diagnóstico, obtenidas a partir de experimentos sobre el terreno con un sólido fundamento estadístico. También deben presentarse datos sobre la repetibilidad del ensayo, esto es, la concordancia de los resultados obtenidos con réplicas de una única muestra tanto en el curso de una misma serie como durante series distintas del ensayo. Para que el método sea aceptado intemacionalmente es preciso ofrecer datos sobre su reproductibilidad, es decir, la capacidad del ensayo para arrojar resultados coherentes cuando diferentes laboratorios de varios países distintos lo aplican a alícuotas de una misma muestra. Nunca se insistirá demasiado en la importancia fundamental de los ensayos de referencia. En todo lo que atañe a los intercambios internacionales, el método estándar constituye el patrón de rendimiento diagnóstico. Además, proporciona un modelo de comparación a los laboratorios que preparan sus propios reactivos y diseñan sus propios protocolos, y establece los niveles mínimos aceptables de rendimiento analítico y diagnóstico a los que es preciso atenerse a la hora de concebir nuevas metodologías. Sueros de referencia Los sueros estándar internacionales son modelos originales de referencia, necesarios para armonizar y estandarizar las pruebas de diagnóstico por detección de anticuerpos específicos de un agente infeccioso. Sirven a la vez como productos de referencia para calibrar ensayos y reactivos y como prototipos para preparar sueros estándar tanto nacionales como de trabajo (2). En el curso de una reunión de consultores auspiciada por la División Mixta del Organismo Internacional de Energía Atómica y la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (OIEA/FAO), celebrada en enero de 1 9 9 2 en Viena, uno de los puntos tratados fue el de los sueros de referencia internacionales para la detección de anticuerpos mediante técnicas inmunoenzimáticas ( 1 7 ) . Todas las opiniones coincidieron en señalar la necesidad de definir tres sueros de referencia: uno fuertemente positivo, uno débilmente positivo y uno negativo. Los sueros positivos deben proceder de animales que exhiban una respuesta humoral típica al microorganismo en cuestión. Los sueros negativos deben tomarse de animales que jamás se hayan visto expuestos al microorganismo ni hayan sido vacunados contra él. Estos sueros de referencia no deben requerir ningún tipo de dilución previa ni tratamiento especial por parte del laboratorio receptor antes de su empleo en una prueba inmunoenzimática. Al preparar los sueros de referencia positivos, es aceptable efectuar una única dilución (en suero de referencia negativo) de la reserva inicial de suero positivo, con objeto de obtener una reactividad determinada que quede dentro de los límites de detección del ensayo. Los sueros de referencia se utilizarán para calibrar las técnicas inmunoenzimáticas de la manera siguiente: a) el suero de referencia fuertemente positivo se utilizará para determinar el límite superior de detección exacta; b) el suero de referencia débilmente positivo se utilizará para determinar el límite inferior de detección exacta o la sensibilidad analítica del ensayo; c) el suero de referencia negativo, utilizado para preparar diluciones de los sueros positivos, sirve además de referencia o control paralelo de los sueros positivos. A la hora de calibrar un ensayo, el uso de tres sueros de referencia permite definir las características mínimas aceptables de la relación dosis/respuesta y proporciona una mayor confianza en que el ensayo exhiba niveles de sensibilidad y especificidad de diagnóstico paralelos a los del método de referencia con el que se caracterizaron originalmente dichos sueros. Los ensayos que se calibran frente a un único suero de referencia positivo no ofrecen el mismo margen de confianza. En sus directrices para la preparación de sueros de referencia internacionales (6), la Comisión de Normas de la OIE adopta este criterio y recomienda que se establezcan tres sueros de referencia para todas las técnicas inmunoenzimáticas, y también para la mayoría de las demás pruebas prescritas para el comercio. Sueros de referencia para técnicas inmunoenzimáticas En la mayor parte de las aplicaciones diagnósticas de técnicas inmunoenzimáticas, las muestras se analizan a dilución única en lugar de utilizar bancos de diluciones. A dilución única, las técnicas inmunoenzimáticas traducen la actividad de anticuerpos de modo semicuantitativo. En pruebas inmunoenzimáticas de competición o bloqueo, la actividad de anticuerpos se expresa como el porcentaje de inhibición que experimenta un anticuerpo competidor específico. Para ensayos imunoenzimáticos (enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA) indirectos, se ha propuesto expresar la actividad de anticuerpos como porcentaje de positividad respecto al suero de referencia positivo ( 1 7 ) . Ello sirve para unificar la escala (de 0% a 100%) en la que se expresarán los datos, que quedarán así normalizados para cualquier ensayo inmunoenzimático. Utilizando la brucelosis bovina como ejemplo, se ha descrito un modelo de trabajo para seleccionar y definir títulos de anticuerpos estándar para el ELISA indirecto ( 1 8 ) . Se selecciona un suero positivo tal que, tras preparar diluciones de razón 2 en un suero negativo y someterlo al método ELISA 546 Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 17 (2) estándar a la dilución normal de diagnóstico, arroje una curva dosis/respuesta típica. Tras determinar la porción lineal de la curva dosis/respuesta, se selecciona el suero de referencia fuertemente positivo como aquella dilución que represente títulos de anticuerpos intermedios entre el punto superior y el punto central de la porción lineal de la curva. El suero de referencia débilmente positivo, por su parte, corresponde a la dilución que caiga a medio camino entre el punto central y el inferior. Dado que ambos sueros de referencia positivos se preparan en forma de diluciones en suero negativo, este último se incluye como suero de referencia negativo. El suero fuertemente positivo representa un 100% de positividad, y se utiliza para normalizar el resto de datos brutos. El suero de referencia débilmente positivo se emplea para definir la sensibilidad analítica mínima de la prueba. La sensibilidad analítica de un ELISA indirecto depende de diversas variables, entre otras el antígeno, la antiglobulina y el marcador enzimático que se elijan. Ahora bien, con independencia de las variables de cualquier índole que puedan presentar este tipo de ensayos, el suero de referencia débilmente positivo debe arrojar un resultado inequívocamente positivo cuando se analiza a su dilución especificada. para detectar anticuerpos bovinos contra Brucella abortus, el actual estándar internacional es el denominado Segundo suero estándar internacional contra B. abortus (International standard B. abortus serum, ISABS) (10). Al nivel de actividad de anticuerpos de este suero, que exhibe una curva dosis/respuesta típica, se le ha asignado un valor de 1.000 Unidades Internacionales de FC (UIFC) por ml. A una dilución de 1/200, este suero se utiliza para titular la concentración óptima de antígeno que debe usarse en la prueba de FC. Haciendo tal cosa, se calibra también la sensibilidad analítica de la prueba. En su forma no diluida, el Segundo ISABS equivale al suero fuertemente positivo que se recomienda para las pruebas inmunoenzimáticas. A una dilución de 1/200, equivale al suero de referencia débilmente positivo recomendado para dichas pruebas, con la salvedad de que el usuario tiene que diluirlo en solución tampón en lugar de suero negativo. El Segundo ISABS es también muy importante a efectos de comercio internacional, dado que permite normalizar los datos de cualquier prueba de FC en forma de UIFC. De forma análoga debe procederse a la hora de seleccionar y definir anticuerpos de referencia para ensayos inmunoenzimáticos de competición o bloqueo. El factor crucial en cualquier ensayo de ese tipo reside en el anticuerpo competidor, que suele ser una preparación de anticuerpos monoclonales. Cada una de estas preparaciones poseerá una sensibilidad y una especificidad analíticas propias. Como en el caso del ELISA indirecto, se selecciona un suero positivo tal que, tras preparar diluciones de razón 2 en un suero negativo y someterlo al método de prueba estándar a la dilución normal de diagnóstico, arroje una curva dosis/respuesta típica. Por regla general, las curvas dosis/respuesta de estos ensayos tienden a mostrar una pendiente mucho más pronunciada que las del ELISA indirecto, y la porción lineal de la curva suele abarcar muy pocas diluciones. Se recomienda (17) que el suero de referencia fuertemente positivo represente la dilución más elevada capaz de inducir reiterada e inequívocamente el máximo nivel de inhibición (esto es, el 100%) del anticuerpo monoclonal competidor de referencia. El suero de referencia débilmente positivo debe corresponder a una dilución que induzca un nivel de inhibición superior al 5 0 % e inferior al 1 0 0 % . Definir este estándar resultará más o menos difícil en función del ensayo y de la pendiente de la curva dosis/respuesta, aunque deberá resultar inequívocamente positivo en cualquier circunstancia y momento. Los sueros de referencia para ensayos de precipitación, como por ejemplo la inmunodifusión en gel de agar (IDGA), deben inducir reacciones típicas cuando se someten no diluidos al método de prueba de referencia. Como en el caso de las técnicas inmunoenzimáticas, los sueros de referencia deben incluir un suero fuertemente positivo, uno débilmente positivo y uno negativo. Al reaccionar con una dilución óptima de antígeno, el estándar fuertemente positivo debe inducir la formación de una línea de precipitación nítida, que constituirá el patrón con el que luego habrán de cotejarse las líneas de precipitación resultantes de cualquier muestra de ensayo. El suero de referencia débilmente positivo, por su parte, debe inducir el nivel mínimo de reacción detectable por el ensayo. Debe procurarse, siempre que sea posible, que el suero débilmente positivo sea un suero no diluido. En su defecto, dicho suero se preparará por predilución en el suero de referencia negativo. El estándar débilmente positivo reviste una importancia capital en las pruebas de IDGA, pues su reactividad define la sensibilidad de diagnóstico del ensayo. Sueros de referencia para técnicas de dilución extrema Para ensayos de dilución extrema como la prueba de neutralización viral (NV) o la de fijación del complemento (FC), un suero de referencia positivo debe deparar una curva dosis/respuesta típica cuando para titularlo se utilice el método de prueba estándar. En el caso de la prueba de FC Sueros de referencia para técnicas de precipitación Para las pruebas de precipitación se utilizan subunidades antigénicas solubles, que pueden contener más de un tipo de antígeno en función del sistema utilizado para prepararlo y de la pureza de la preparación. Valga como ejemplo el caso de la leucosis bovina enzoótica (LBE) (3, 11): la prueba de IDGA permite detectar fácilmente anticuerpos contra dos antígenos solubles, las glicoproteínas gp-51 y p-24. Los anticuerpos anti-gp51 suelen ser más precoces, persistentes y regulares. La preparación antigénica que se utiliza en el ensayo estándar contiene mayoritariamente gp-51, aunque también puede contener p-24. Se emplean dos sueros de referencia. El suero E l carece de un nivel suficiente de anticuerpos anti-p24 para que puedan detectarse por el método IDGA de referencia. No diluido, este suero estándar se utiliza para titular el antígeno y 547 Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 17 (2) determinar su concentración óptima para la prueba de IDGA. El suero E 4 , por su parte, contiene anticuerpos contra ambos antígenos, y se emplea para calibrar la sensibilidad analitica de la prueba. Llevado a una dilución 1/10 en suero negativo, el suero E4 debe inducir una reacción inequívocamente positiva. En el ejemplo de la LBE, los dos sueros de referencia positivos se han preparado a partir de fuentes distintas. No diluido, el suero E l equivale al estándar fuertemente positivo que se recomienda para las técnicas inmunoenzimáticas. Diluido en suero negativo, el suero E 4 equivale al suero estándar débilmente positivo. Definición de un suero «típico» Las consideraciones anteriores sobre el calibrado de las pruebas hacen frecuente alusión al concepto de «típico». ¿Qué es un suero típico? Los sueros de referencia deben ser representativos de la mayor parte de muestras que habrán de someterse de forma sistemática a un ensayo determinado. En este sentido, y dada la existencia de una serie de variables que dependen del animal huésped y que pueden influir sobre la composición sérica normal o básica, los sueros deben ser típicos en lo que concierne a su composición normal o básica (8). Deben ser típicos también en lo que atañe a los isotipos, la especificidad y el espectro de títulos de anticuerpos que cabe esperar en el curso de un episodio infeccioso natural ( 1 4 ) . Resulta difícil definir el término «típico». No todos los isotipos de anticuerpo fijan el complemento, neutralizan virus, aglutinan bacterias o precipitan antígenos solubles. En las distintas fases de una infección, no todos los isotipos estarán representados por un igual en términos de especificidad, concentración o avidez. Lo importante es que los anticuerpos significativos para el diagnóstico se hallen representados de una forma que sea típica de la respuesta inmunitaria humoral que elabora el huésped frente a la infección por un microorganismo dado. Para ciertas aplicaciones puede ser necesario seleccionar estándares séricos que sean representativos de las primeras fases de la infección. De todos modos, habida cuenta de los requisitos de cuarentena y demás factores atenuantes que figuran en los certificados zoosanitarios de importación/exportación, es preferible interpretar «típico» en el sentido de la respuesta media o mediana a la infección (18). Cuando exista más de un posible método de prueba, el hecho de que el suero candidato exhiba una reactividad típica a los distintos métodos brindará una mayor confianza en que dicho suero sea representativo del curso natural de la infección. En ocasiones podrá ser necesario infectar o inmunizar experimentalmente a los animales con microorganismos inactivados. En tal caso, sin embargo, a la hora de caracterizar la respuesta inmunitaria convendrá ceñirse únicamente a los sueros que remeden el perfil de la infección natural. También los sueros de referencia negativos deben ser típicos en lo que respecta a su composición sérica normal o básica. Hay que cerciorarse de que dichos sueros no contienen anticuerpos con reactividad cruzada frente al microorganismo en cuestión, y de que su reactividad es la propia de una reacción negativa al ensayo del que se trate. Tanto el suero de referencia positivo como el negativo pueden proceder de un solo animal o constituir una mezcla de sueros. En este último caso, es preciso comprobar de antemano que cada uno de los sueros que componen la mezcla exhibe una curva típica, y hacer después otro tanto con la mezcla final resultante. A fin de evitar cualquier tipo de sesgo en la elección y caracterización de los sueros de referencia, el laboratorio de referencia debe enviar los sueros candidatos a diversos laboratorios colaboradores para que éstos los sometan a prueba. En el caso de los sueros de referencia internacionales, dichos establecimientos colaboradores deberán ser acreditados en sus respectivos países. Conviene que todos los laboratorios utilicen, siempre que sea posible, un mismo método de prueba estándar, o cuanto menos ensayos que ofrezcan parecidos niveles de sensibilidad y especificidad de diagnóstico. Además, todos ellos deben caracterizar los sueros candidatos de igual manera, y proporcionar datos sobre la repetibilidad. Ateniéndose a los resultados obtenidos por el conjunto de laboratorios, el Laboratorio de referencia (coordinador del estudio) deberá evaluar la reproductibilidad. Cuando no exista un único ensayo estándar adoptado de manera generalizada, puede ser necesario buscar un consenso para instituir los sueros de referencia internacional. Tal ha sido el caso de los sueros de referencia para las técnicas de neutralización viral e inmunoenzimáticas utilizadas para el diagnóstico serológico de la rinotraqueítis infecciosa bovina. El Manual de la OIE (12) contiene las descripciones de algunas de las modalidades de dichas técnicas, que además de pruebas prescritas representan, por defecto, los métodos de referencia. Sin embargo, diversos laboratorios de diagnóstico vienen aplicando estas pruebas con modificaciones varias en su práctica cotidiana. Un estudio a nivel europeo puso de manifiesto notables diferencias en la sensibilidad analítica que proporcionaban muchas de esas pruebas de detección de la rinotraqueítis infecciosa bovina (15). Como consecuencia, se realizó un proyecto encaminado a consensuar tres sueros de referencia internacionales a partir de los resultados de diversos laboratorios colaboradores, cada uno de los cuales utiliza su propia versión modificada de la prueba estándar (16). Seguridad y estabilidad De acuerdo con las directrices elaboradas por la Comisión de Normas de la OIE (6), es necesario preparar los sueros de referencia internacionales de tal manera que queden exentos de productos infecciosos. Se recomienda que los sueros provengan de animales libres de patógenos específicos o, cuando sea posible, de animales gnotobióticos. A la hora de efectuar el traslado internacional de los sueros de referencia, se aconseja irradiarlos con dosis de entre 25 y 3 0 kilogray (de 2,5 a 3,0 Mrad). Los sueros bovinos deben proceder de una • fuente libre de encefalopatía espongiforme bovina. Para 548 asegurar su estabilidad se recomienda liofilizarlos, e incluir un diluyente estéril para la reconstitución. Después de la liofilización será preciso reconstituir varios frascos de los sueros estándar y evaluarlos de nuevo. Sueros de referencia nacionales y de trabajo Los sueros internacionales de referencia suelen prepararse en forma de grandes lotes de pequeñas alícuotas (de 0,5 ml a 1 ml). Constituyen una mercancía valiosa, y como tal es preciso considerarlos y tratarlos. No deben utilizarse más que para ciertos fines específicos ( 1 3 ) . Como queda dicho, los sueros de referencia internacionales han de servir para calibrar métodos de prueba en el laboratorio nacional de referencia. Hecho esto, se utilizarán los sueros de referencia a modo de prototipos para la preparación y estandarización cruzada de los sueros de referencia nacionales. La preparación de esos sueros nacionales o secundarios es competencia de la autoridad nacional correspondiente. Esos estándares se utilizarán luego para calibrar ensayos en laboratorios regionales, provinciales o estatales. El suero de referencia nacional servirá para la estandarización cruzada de los sueros terciarios o de trabajo, que luego servirán para la aplicación cotidiana del ensayo en el laboratorio de diagnóstico. También pueden utilizarse para elaborar curvas de referencia o a modo de control interno de calidad. Notas de información Como lo recomiendan las directrices elaboradas por la Comisión de Normas de la OIE (7), para facilitar la elección y/o preparación de reactivos de referencia nacionales las notas de información deben presentar los siguientes datos: a) descripción del animal donante del suero positivo o negativo, con indicación de su especie, edad, estado reproductivo y origen (esto es, producción natural, libre de agentes patógenos específicos, gnotobiótico, etc.); b) carácter de la respuesta inmunitaria (inducida por infección natural, infección experimental, inmunización, etc.); c) detalles sobre el microorganismo utilizado para inducir la respuesta inmunitaria (origen, cepa, serotipo, etc.); d) detalles sobre la infección experimental o los protocolos de inmunización (vía de administración, dosis, sistemas de inmunización, método y períodos de recolección de muestras, etc.); Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 17 (2) e) ensayos de referencia utilizados para seleccionar los sueros candidatos positivos y negativo y para caracterizar la respuesta inmunitaria (ELISA, IDGA, NV, etc.); f) muestra de las curvas de titulación de los sueros positivos y criterios para la selección de diluciones adecuadas para un determinado nivel de actividad; g) eventual presencia de anticuerpos heterólogos, si se tiene conocimiento de ello, y pruebas utilizadas para detectarlos; h) descripción de los métodos de esterilización, incluido el tipo y la dosis de irradiación y el estado de la muestra en el momento de su esterilización (esto es, líquido, congelado, liofilizado, etc.); i) número de lote y fecha de preparación; j) condiciones recomendadas manipulación y conservación. para su reconstitución, Conclusión Las normas internacionales para los métodos de ensayo y los sueros de referencia son necesarias para garantizar la conformidad de las pruebas de diagnóstico utilizadas por las distintas partes implicadas en una transacción comercial con unos requisitos mínimos de rendimiento de diagnóstico. Estos métodos normalizados y sueros de referencia permiten establecer un marco a partir del cual pueda inferirse el rendimiento diagnóstico de una prueba concreta realizada en un laboratorio determinado. Se describió en este artículo los aspectos esenciales que se deben considerar a la hora de elaborar, evaluar y documentar técnicamente los métodos de ensayo normalizados y los sueros de referencia utilizados en las pruebas de diagnóstico por detección de anticuerpos. Estas consideraciones deberían conducir a mejorar la armonización internacional de las pruebas de diagnóstico y a obtener resultados más confiables en los diagnósticos realizados en el ámbito de los intercambios internacionales. 549 Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 17 (2) Bibliografía 1. Gardner I.A., Hietala S. & Boyce W.M. (1996). - Validity of using serological tests for diagnosis of diseases in wild animals. In Cría y patología de los animales salvajes (M.E. Fowler, edit.). Rev. sci. tech. Off. int. 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