Ciclo celular, regulación del crecimiento celular, cinética de

Ciclo celular, regulación del crecimiento
celular, cinética de proliferación celular
Dr. Hernán G. Farina
Universidad Nacional de Quilmes
Laboratorio de Oncología Molecular
Etapas de la fase M
Se pueden distinguir tres tipos de
microtúbulos en el huso mitótico:
los microtúbulos polares, que se
solapan en la línea media del huso;
los microtúbulos cinetocóricos, que
se
adhieren
al
cinetocoro
especializado
que
forma
el
centrómero de cada cromosoma
duplicado; y los microtúbulos
astrales, que parten en todas las
direcciones
desde
los
centrosomas.
La DNA polimerasa actúa como una enzima autocorrectora que elimina sus propios
errores de polimerización a medida que avanza por el ADN.
Regulación del ciclo
celular
Kinasas heterodiméricas que controlan el ciclo celular:
Subunidades reguladoras: Ciclinas que aumentan y disminuyen
en fase con el ciclo celular
Sus subunidades catalíticas se denominan kinasas dependientes
de ciclinas (Cdk) porque carecen de actividad kinasa a no ser que
se asocien con una ciclina.
Cada subunidad catalítica Cdk puede asociarse con diferentes
ciclinas y la ciclina asociada determina que proteínas serán
fosforiladas por el complejo Cdk-ciclina.
La degradación de las ciclinas comienza poco después del inicio de la anafase.
La secuenciación de cDNA codificadores de varias ciclinas mitóticas de
diversos eucariontes ha demostrado que todas las proteínas codificadas
poseen una secuencia homóloga, cerca del extremo N-terminal,
denominada caja de destrucción.
Regulación de las concentraciones de ciclinas mitóticas
Al inicio de la mitosis el MPF fosforila residuos de serina específicos
en las tres láminas nucleares y así se produce la despolimerización de
estas.
La despolimerización de las proteínas láminas produce la
desintegración de la malla que es la lámina nuclear, lo que contribuye a
la ruptura de la envoltura nuclear.
El MPF fosforila proteínas que integran el complejo condensina. Este
complejo fosforilado es capaz de inducir superenrrollamientos en el
ADN.
La fosforilación de proteínas asociadas a los microtúbulos por parte
del MPF es probable que sea necesaria para generar los cambios en la
dinámica microtubular que traen como consecuencia la formación del
huso mitótico y los ásteres.
La función de la cohesina es regulada por el inhibidor de la anafase.
Conforme las células entran en anafase, este inhibidor es
poliubiquitinizado por el APC y degradado por el proteasoma. Como
consecuencia se permite separar las cromátides hermanas hacia los
polos opuestos.
La fosforilación de la cadena liviana de la miosina inhibe su interacción
con la proteína miosina para la formación del anillo contractil.
La actividad de todos los complejos Cdk-ciclina de mamífero parece ser regulada por
fosforilación y desfosforilación.
Las células de mamífero expresan varios inhibidores de kinasas dependientes de
ciclinas que contribuyen al control del ciclo celular. Estos se agrupan en dos clases;
los de la familia CIP (proteínas inhibidoras de Cdk) que fijan e inhiben todos los
complejos de ciclinas, y Cdk 1, 3, 4 y 6 (ej.: p21, p27 y p57); y los de la familia INK4
(inhibidores de kinasa 4) que fijan e inhiben sólo los complejos Cdk4-ciclinaD y
Cdk6-ciclinaD (ej.: p16).
Etapas en las cuales los puntos de control pueden detener el paso a través del ciclo celular. El
daño del ADN debido a la radiación o a la modificación química, impide que las células que
están en G1 entren en la fase S y que las células en G2 entren en mitósis. El ADN no replicado
impide la entrada en la mitosis. Los defectos en la formación del huso mitótico o en la fijación
de los cinetocoros a los microtúbulos del huso impiden la activación del sistema de
poliubiquitinización del APC, que conduce a la degradación del inhibidor de la anafase. En
consecuencia, las células no entran en la anafase hasta que todos los cinetocoros estén
unidos a los microtúbulos del huso
HPV
Virus DNA doble cadena
Genoma = 8 kilobases
6 proteínas tempranas
E1 Replicación y control transcripcional
E2
E4: Formación de estructuras tipo
Filamentos intermedios
E5: Inhibe la acidificación de los endosomas
y desciende la expresión de MHC clase 1
E6 Interrumpen el control del ciclo celular
E7
2 Proteínas Tardías
L1 Proteínas de la capside
L2
Funciones de E6
HDM2
E6
p16INK4αα
E6-AP
E6-AP
E6
p53
p21
p53
E1
E3
Ubiquitina
p53
pRB
p53
26 S
CiclinaD1
Aumenta los niveles de p21
Reparación del DNA
Regulación del ciclo Celular
Detención en G1
Ciclina/CDKs
Apoptósis
Regula la transcripción de
HDM2 = homólogo de E6AP
p53
E7
CDKs
PCNA
E2F
Ciclina E
CR1
CR2
E7
P
pRB
P
pRB
Ciclina A
pRB
pRB
pRB
26S
p21
pRB
E2F
Progresión el
cilco celular
PCNA
Ciclina E
CR1
Ciclina A
p53
E7
CR2
CR1
CDK-2
Ciclina E
CR2
E7
p27
P
P
p27
CR1
CR2
E7
p27
p27
26S
Regulación de p27
P
P
Otras funciones de E7
Interacciona con varias proteínas:
H1 Kinasa
M2 Piruvato Kinasa
Proteína del nucleosoma que forma parte del complejo Histona desacetilasa, Mi2B
-E7
=
Eliminación
de
pRB
y
p27
Activa Cicline E y A
AP-1 (factor de transcripción)
y Síntesis de ciclinas
Inactivación de p21cip-1 y p27kip-1
Aumenta la integración de DNA foráneo al genoma celular
E6 + E7 = Eliminación de p53,
p21, y p27
Aumenta la sensibilidad a carcinógenos químicos
La fosforilación de E7 por casein kinasa 2, produce la transición G1-S, debido a la
regulación alterada de ciclina E. CiclinaE/CDK2 es el regulador clave de la iniciación de
la fase S.
Inhibe la activación del promotor IFN-β
β
Inhibe la expresión de los genes inducibles por IFN-α
α
Progresión del ciclo celular
CIGB-300 Impairs the CK2-Phosphorylation
on the HPV E7 Transforming Protein
Concept of CIGB-300:
Impairment the CK2 phosphorylation on its substrates by out-competing the enzyme
Selected Binders
-Systemic administration of a peptide that impairs the protein kinase (CK2) phosphorylation reduces
solid tumor growth in mice. Perera Y, Farina HG, Hernández I, Mendoza O, Serrano JM, Reyes O., Gomez
DE, Gomez RE, Acevedo BE, Alonso DF, Perea SE. Int J Cancer. 2008 Jan 1;122(1):57-62. ISSN. 0020-7136.
United States.
-CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer
properties both in vitro and in vivo. S.E. Perea, O. Reyes, I. Baladron, Y. Perera, H. Farina, J. Gil, A.
Rodriguez, D. Bacardi, J.L. Marcelo, K. Cosme, M. Cruz, C. Valenzuela, P.A. López-Saura, Y. Puchades, J.M.
Serrano, O. Mendoza, L. Castellanos, A. Sanchez, L. Betancourt, V. Besada, R. Silva, E. López, V. Falcón, I.
Hernández, M. Solares, A. Santana, A. Díaz, T. Ramos, C. López, J. Ariosa, L.J. González, H. Garay, D.
Gomez, R. Gomez R, D.F. Alonso, H. Sigman, L. Herrera, B. Acevedo. Molecular and Cellular Biochemistry,
316: 163-167, 2008. ISSN. 0300-8177. Netherlands.
-Anticancer peptide CIGB-300 binds to nucleophosmin/B23, impairs its CK2-mediated phosphorylation,
and leads to apoptosis through its nucleolar disassembly activity. Yasser Perera, Hernán G. Farina,
Jeovanis Gil, Arielis Rodriguez, Fernando Benavent, Lila Castellanos, Roberto E. Gómez, Boris E. Acevedo,
Daniel F. Alonso, and Silvio E. Perea. Mol Cancer Ther 2009;8(5),1189-1196. ISSN 1535–7163.
Philadelphia, EE.UU.
1
0.5
Proof of concept with
synthetic peptide
clon24
clon22
clon18
clon15
clon14
clon12
clon6
clon10
0
clon5
Random cyclic peptide
phage library
1.5
clon4
Biopanning
2
clon1
LNDSSEEEDEICK2 phosphoaceptor site
PC89
CRIII
control
CRII
CIGB-300
P15
Tat cpp
HPV-16 E7 phosphorylation
(relative levels)
CRI
Relative levels of phosphorylation
HPV E7 as a CK2 Substrate Model
2
1.5
1
0.5
0
Control
CIGB-300
Tat
Perea et al,
Cancer Res, 2004
Important Features on the Mechanism of Action of CIGB-300
Cell: 40X (30 sec)
Pharmacology
Nucleolus:100X (30 min)
CIGB-300 linked to
fluorescein
Pull-down in vivo with CIGB- Colocalization of
CIGB-300 with B23/NPM
300 biotynilated
In vivo
Phosphorylation of B23/NPM
by CK2
In h ib ic io n d e la F o s f o r ila c in d e B 2 3 ( % )
CIGB-300 rapidly penetrates inside
tumor cells and accumulates at the
nucleolus
120
100
80
Once at the nucleolus, CIGB-300
physically conteracts with B23/NPM
and impairs its CK2-mediated
phosphorylation
B23/NPM
60
40
20
0
TBB 100 µM
CIGB-300
50µM
CIGB-300
100µM
CIGB-300 F20-2 100 µM F20-2 200 µM
200µM
Tratamiento
Western Blot
Connection with cell proliferation
1
APOPTOSIS
2
CIGB-300
CIGB-300 induces
nucleolar disambly thus
impairing the ribosomal
biogenesis
Non-drug
Colocalization of
Fibrillarin + B23/NPM
3
4
1
2
3
4
Disambly stages
Perera et al,
Mol Cancer Ther, 2009