elementos reguladores de la transcripcion, secuencia reguladora y

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
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kNúmero de solicitud: 9750002
kInt. Cl. : C12N 5/14
11 Número de publicación:
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ESPAÑA
C12N 15/11
C12N 15/29
C12N 15/82
A01H 4/00
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SOLICITUD DE PATENTE
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22 Fecha de presentación: 07.05.96
A1
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71 Solicitante/s: BOARD OF TRUSTEES OF
THE UNIVERSITY OF KENTUCKY
University of Kentucky
Administracion Building
45502 Lexington, Kentucky, US
k
30 Prioridad: 18.05.95 US 443639
06.06.95 US 471983
22.12.95 US 577483
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72 Inventor/es: Chappell, Joseph;
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74 Agente: Esteban Pérez-Serrano, Ma Isabel
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43 Fecha de publicación de la solicitud: 16.09.99
Cornett, Catherine A. G. y
Yin, Shauhui
43 Fecha de publicación del folleto de la solicitud:
16.09.99
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54 Tı́tulo: Elementos reguladores de la transcripción, secuencia reguladora y métodos que utilizan
tales elementos para esta transcripción.
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ES 2 134 170 A1
57 Resumen:
Elementos reguladores de la transcripción, secuencia
reguladora y métodos que utilizan tales elementos
para esta transcripción.
Son secuencias cualitativas que operan en plantas,
tejido vegetal y células vegetales para expresión inducible de genes, y secuencias cuantitativas para
aumentar la expresión de transcripción de la información genética hacia adelante en plantas, tejido
vegetal y células vegetales; también se dan a conocer métodos y moléculas de ADN recombinante
para mejorar la resistencia de plantas transgénicas a
enfermedades, especialmente donde un promotor inducible controla la expresión de una proteı́na capaz
de hacer aparecer la respuesta hipersensible en una
planta.
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
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DESCRIPCION
Elementos reguladores de la transcripción, secuencia reguladora y métodos que utilizan tales elementos para esta transcripción.
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Campo de aplicación
El campo de esta invención es el de la biologı́a molecular vegetal, y en particular se refiere a elementos reguladores de transcripción, secuencia reguladora cualitativa que regula positivamente la expresión
de genes hacia adelante en tejido vegetal en respuesta a la compulsión de patógeno microbiano invasor,
un elicitor y otras señales quı́micas inductoras, y secuencias reguladoras cuantitativas que aumentan la
expresión de transcripción de secuencias asociadas.
Objeto de la invención
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La invención ahora propugnada consiste en unos “Elementos reguladores de la transcripción, secuencia reguladora y métodos que utilizan tales elementos para esta transcripción”, en secuencias reguladoras
cualitativas, que operan en plantas, tejido vegetal y células vegetales para expresión inducible de genes,
y secuencias reguladoras de transcripción cuantitativa, para aumentar la expresión de transcripción de
la información genética hacia adelante en plantas, tejido vegetal y células vegetales. También se dan a
conocer métodos y moléculas de ADN recombinante para mejorar la resistencia de plantas transgénicas
a enfermedades, especialmente donde un promotor inducible controla la expresión de una proteı́na capaz
de hacer aparecer la respuesta hipersensible en una planta.
Antecedentes de la invención
En las plantas, la resistencia a enfermedad por patógenos fungales, bacterianos y virales está asociada
a una respuesta del vegetal que se llama respuesta de hipersensibilidad (HR). En la HR, el lugar de la
planta que el fitopatógeno potencial invade experimenta muerte de células localizada, y se postula que
este aspecto muerte de células vegetales localizada de la HR, detiene el microorganismo o virus invasor,
protegiendo ası́ el resto de la planta. Otras defensas de la planta incluyen la producción de fitoalexinas
(antibióticos) y/o enzimas lı́ticas capaces de prevenir el ingreso de patógenos, y/o modificaciones de la
pared celular que fortalecen la pared de célula vegetal contra ataque fı́sico y/o enzimático.
Las plantas con HR, incluido el tabaco, pueden comprender producción de fitoalexinas, como parte
de la respuesta a microorganismo invasores. Una de las clases de compuestos producidos por el tabaco
(Nicotiana tabacum) en respuesta a invasores microbianos son los sesquiterpenos antimicrobianos.
Cultivos de suspensiones de células han proveı́do información útil referente a la regulación de la sı́ntesis
de terpenos. Los isoprenoides son por naturaleza ubicuos, y las primeras porciones de la vı́a biosintética
son compartidas con la vı́a biosintética para otros compuestos isoprenoides tales como los esteroles, los
carotenoides, el dolicol y le ubiquinona, y reguladores del desarrollo (el ácido gibberélico, por ejemplo)
que se clasifican como metabolitos primarios. Los compuestos isoprenoides clasificados como metabolitos
secundarios no son indispensables para el desarrollo, e incluyen mono-, sesqui- y diterpenoides. Estos
isoprenoides metabolitos secundarios son importantes mediadores de interacciones entre la planta y su
medio ambiente.
Una variedad de composiciones pueden servir como elicitores de la sı́ntesis de fitoalexinas por las
plantas. Estas incluyen, pero sin limitación, uno o más iones tóxicos - por ejemplo, iones mercurio -,
otras composiciones definidas quı́micamente, inhibidores metabólicos. glicanes de pared celular, ciertas
glicoproteı́nas, ciertas enzimas, esporas fungales, quitosanes, ciertos ácidos grasos y ciertos oligosacáridos
derivados de paredes de células vegetales. (Ver, por ejemplo, L. Sequeira, Annu. Rev. Microbiol. 37,
1983, págs. 51-79, y las referencias ahı́ citadas). Se ha demostrado que la actividad de la sintasa de
epi-5-aristoloqueno (EAS) en el tabaco es inducida por fragmentos de pared celular de ciertas especies de
Phytophthora y por la celulasa de Trichoderma viride, pero no por la pectoliasa de Aspergillus japonicus
(Chappell et al., Plant Physiol. 97, 1991, págs. 693-698). También el ataque de otros patógenos vegetales
o de una cepa afı́n no-virulenta puede inducir la sı́ntesis de fitoalexinas; por ejemplo, la Pseudomonas
lachrymans induce sı́ntesis de sesquiterpenoides en el tabaco (Guedes et al., Phytochemistry 21, 1982,
págs. 2987-2988).
Las elicitinas son proteı́nas, producidas por patógenos vegetales y potenciales patógenos vegetales,
que inducen la HR en las plantas de tabaco. Se han publicado secuencias que codifican aminoácidos y nucleótidos para una elicitina de Phytophthora parasitica (Kamoun et al., Mol. Plant-Microbe Interactions
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6, 1993, págs. 573-581). Virus patogénicos en vegetales incluido, pero sin limitación, el virus del mosaico
del tabaco (TMV) inducen HR en plantas infectadas. También bacterias que infectan plantas pueden
inducir HR y, por ende, resistencia a la plaga; bacterias representativas que elicitan la HR incluyen, pero
sin limitación, la Agrobacterium species, la Hanthomonas species y la Pseudomonas syringae. Hongos
fitopatogénicos (y también ciertas cepas no-virulentas) inducen la HR, incluyendo éstos sin limitación la
Phytophthora parasitica y la Peronospora tabaci.
Cuando cultivos de células de tabaco en suspensión se tratan con un elicitor, se reprime la sintetasa
de escualeno, deteniendo ası́ la afluencia de precursores biosintéticos comunes hacia los esteroles. La
inducción concomitante de expresión del gen ciclasa de sesquiterpeno causa la afluencia de precursores
hacia los sesquiterpenos. El primer paso en la vı́a desde el difosfato de farnesilo hasta el capsidiol ditoalexina de sesquiterpeno en el tejido de tabaco inducido por elicitor es catalizado por la sintasa de
epi-5-aristoloqueno (EAS), una ciclasa de sesquiterpeno. La secuencia codificadora y la secuencia de
aminoácidos deducida para unos de los miembros de la familia de genes EAS del tabaco se han publicado
(Facchini y Chappell, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1992, págs 11088-11092). La expresión de transcripción de uno o más miembros de la familia de genes de EAS es inducida en respuesta a elicitores.
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Hay en la técnica una necesidad largo tiempo sentida de métodos para proteger plantas, en particular
los cereales, contra infección por patógenos vegetales, incluidos pero sin limitación virus, hongos y/o
bacterias fitopatogénicos. Especialmente importantes desde los puntos de vista económico y ambiental
son los métodos biológicos o “naturales”, más que los basados en la aplicación de productos quı́micos
a cereales. También hay en la técnica una necesidad largo tiempo sentida de secuencias reguladoras de
transcripción para uso en controlar la expresión de secuencias de ADN en plantas transgénicas.
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Descripción de la invención
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En general, invención propone una molécula de ácido nucleico recombinantes que incluye un elemento
regulador de la resistencia a plagas vegetales inducible. Esa molécula de ácido nucleico recombinante es,
en general, idéntica en un 80 % a un elemento regulador de la resistencia a plagas vegetales de presentación natural e inducible; es decir, hasta un 20 % de los pares de bases de la referida secuencia de ADN
se pueden reemplazar por un par de bases alternativo (por ejemplo, reemplazar G-C por A-T, T-A o
C-G), siempre que la actividad promotora de transcripción de la secuencia alterada sea igual o mayor que
la de la secuencia aludida. En materializaciones preferidas, la molécula de ácido nucleico recombinantes
acorde con la invención se obtiene de un gen que codifica una ciclasa deterpeno (esto es, una ciclasa de
sesquiterpeno). Por ejemplo, el elemento regulador recombinantes de la invención se obtiene de un gen
sintasa de epi-5-aristoloqueno que incluye la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 3A (SEQ ID
NO: 14) o un fragmento de la misma con resistencia a plagas vegetales e inducible. En materializaciones
preferidas, la molécula de ácido nucleico recombinante acorde con la invención tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 3A (SEQ ID NO:14).
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En otras materializaciones preferidas, la molécula de ácido nucleico de la invención incluye cualquiera
de las secuencias siguientes: nucleótidos 463-473 de la SEQ ID NO:2; nucleótidos 406-486 de la SEQ ID
NO:2; nucleótidos 463-572 de la SEQ ID NO:2; nucleótidos 371-463 de la SEQ ID NO:2; y nucleótidos
411-457 de la SEQ ID NO:2.
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En materializaciones preferidas, la molécula de ácido nucleico recombinantes de la invención se obtiene de una dicotiledónea (de una solanácea como la Nicotiana, por ejemplo. En otras materializaciones
preferidas, el ácido nucleico de la invención se obtiene de una monocotiledónea, una gimnosperma o una
conı́fera.
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En otras materializaciones preferidas más, la molécula de ácido nucleico de la invención es ADN
genómico, ADN sintetizado quı́micamente o una combinación de ambos; ADN genómico y ADNc; ADN
sintetizado quı́micamente y ADNc; o ADN genómico, ADNc y ADN sintetizado quı́micamente.
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En materializaciones preferidas, media la inducción de la molécula de ácido nucleico de la invención un
patógeno vegetal como un hongo (Phytophthora, por ejemplo), una bacteria (por ejemplo, Pseudomonas)
o un virus (el del mosaico del tabaco, por ejemplo), como ya se describió aquı́. En otras materializaciones
preferidas media esa inducción un elicitor (fungal o bacteriano, por ejemplo).
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En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico de la invención está funcionalmente vinculada con la
transcripción inducibles de secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido heterólogo, y opera
regulándola. De preferencia, el polipéptido heterólogo es capaz de conferir a una planta resistencia
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a enfermedades. Por ejemplo, el polipéptido heterólogo puede ser una elicitina (una elicitina fungal
como el polipéptido ParA1 proveniente de Phytophthora, una elicitina bacteriana como la harpina, o un
polipéptido farmacéutico como el activador de plasminógeno de tejidos) media(n) la expresión de tal
polipéptido heterólogo uno o más agentes externos (por ejemplo, el etileno o jazmonato de metilo). En
otras materializaciones, la molécula de ácido nucleico de la invención es capaz de expresar el polipéptido
heterólogo de manera especı́fica para una célula.
En otro aspecto, la invención propone un vector que incluye la molécula de ácido nucleico inventiva,
un método para dirigir la expresión de un polipéptido introduciendo el vector en una célula (de planta
transgénica, por ejemplo), y una celula que contiene el vector.
En otro aspecto, la invención propone un método para impartir resistencia a plagas a una planta
transgénica, método que incluye los pasos de: (a) producir una célula de planta transgénica que incluye
el ácido nucleico acorde con la invención integrado en el genoma de dicha célula; y (b) desarrollar la
planta transgénica a partir de la célula vegetal, método por el cual la expresión de la molécula de ácido
nucleı́co acorde con la invención confiere a la planta transgénica resistencia a plagas.
En materializaciones preferidas, la planta transgénica de acuerdo con los métodos de la invención es
una dicotiledónea (por ejemplo, un miembro de las Solanaceae como la Nicotiana), una monocotiledónea,
una gimnosperma o una conı́fera.
En otro aspecto, la invención propone un método para aumentar la expresión de transcripción de una
secuencia de ADN de avance en una célula de planta transgénica, método que comprende los pasos de:
(a) producir una célula de planta transgénica que incluye el ácido nucleico de lainvención posicionado
para aumentar la transcripción directa de una secuencia de ADN, e integrado en el genoma de la célula
de planta transgénica; y (b) desarrollar la planta transgénica a partir de la célula vegetal.
Además de los rasgos antedichos, la presente invención provee: secuencias reguladoras de transcripción
cualitativas, que regulan la expresión de gen directa en tejido vegetal en respuesta a uno o más elicitor(es),
a otros compuestos inductores definidos, o en respuesta a la compulsión de un fitopatógeno invasor (secuencia reguladora de transcripción inducible); y secuencias reguladoras de transcripción cuantitativas,
que aumentan la transcripción de secuencias directa (secuencia incrementadora de transcripción). Como
se ejemplificaron aquı́ especı́ficamente, estas secuencias reguladoras de transcripción se encuentran en la
naturaleza atrás del y funcionalmente enlazadas al gen sintasa de epi-5-aristoloqueno (EAS4) del tabaco;
cuando se enlazan funcionalmente a una secuencia codificadora (y en presencia de un elementos promotor funcionalmente enlazado proveniente de un gen EAS4 o de un gen expresable en planta heteróloga),
estas secuencias median la expresión de transcripción inducible de esa secuencia codificadora, si invade
la planta o el tejido vegetal un potencial fitopatógeno (por ejemplo un virus, un hongo o una bacteria), o
bien en respuesta a elictores tales como la celulasa de Trichoderma viride o fragmentos de pared celular
vegetal o fungal para plantas, tejido vegetal y/o células vegetales cultivadas en suspensión. Ese potencial
fitopatógeno puede ser: un virus incluidos, pero sinlimitación, el del mosaico del tabaco o el del mosaico
veteado del tabaco; una bacteria incluidas, pero sin limitación, la Pseudomonas syringae, la Xanthomonas campestris o la Agrobacterium tumefaciens; o un hongo incluidos, pero sin limitación, una especia de
Phytophthora (por ejemplo, la P. parasitica) o de Peronospora (por ejemplo, la P. tabaci). El promotor
EAS4, que incluye el(los) elemento(s) regulador(es) de transcripción inducible(s), y la(s) secuencia(s)
incrementadora(s) de transcripción, se dan a conocer aquı́ como SEQ ID NO:2. En la SEQ ID NO:2,
la secuencia homóloga CAAT del promotor EAS4 está situada en los nucleótidos 513-516, y el “motif”
secuencia TATA está situado en los nucleótidos 540-543.
Ejemplos de elementos reguladores de transcripción inducibles dentro de la secuencia inversa del EAS4
de N. tabacum están desde el nucleótido 458 hasta el nucleótido 473 de la SEQ ID NO: 2; desde el nucleótido 454 hasta el 473; y desde el nucleótido 413 hasta el 473 de la SEQ ID NO: 2.
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Otro aspecto de la presente invención es el elemento incrementador de transcripción derivado del
promotor EAS4 y de secuencias asociadas al promotor, cuando se enlaza funcionalmente atrás de una
secuencia de inicio y de una secuencia de ADN heterólogo por expresar.
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Otros aspectos más de la presente invención‘ son células de planta transgénica, tejidos vegetales y
plantas que se han gestado genéticamente para que contengan y expresen una secuencia de nucleótidos
interesante, de preferencia una secuencia codificadora, una secuencia inversa u otra secuencia, bajo el
control regulador del elemento regulador de transcripción inducible. Es un objetivo de esta invención
proveer las secuencias de nucleótidos que median la inducción de la expresión de una secuencia codifica4
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dora hacia adelante en respuesta a exposición a un elicitor, a invasión de una planta por un fitopatógeno
potencial, o a ciertas otras señales inductores exógenas tales como exposición a jazmonato de metilo y a
etileno. Un elemento ejemplar regulador de transcripción inducible por elicitor es el que parte de la región
lindante con el 5’ del gen EAS4 del Nicotiana tabacum; como se ejemplificó aquı́ especı́ficamente, esta
secuencia se presenta en la SEQ ID NO: 2 desde el nucleótido 410 hasta el nucleótido 473. Equivalentes
de la secuencia de nueleótidos ejemplificada son aquellas secuencias de nucleótidos que dirigen de igual
manera la inducción de la expresión de secuencias de nucleótidos hacia adelante. De preferencia, el elemento regulador de transcripción inducible está asociado al promotor EAS4 y a secuencias asociadas con
el promotor (por ejemplo, teniendo la combinación la secuencia de nucleótidos dada desde el nueleótido
410 hasta el nucleótido 573 de la SEQ ID NO: 2, de preferencia desde el nucleótido 361 hasta el 573 de
la SEQ ID NO: 2, y mejor aún desde el nucleótido 1 hasta el 573 de la SEQ ID NO: 2).
Con “elemento regulador de resistencia a plagas” se quiere decir una secuencia de ADN capaz de
regular la expresión de un producto gen asociado a una respuesta defensiva de la planta (respuesta hipersensible, por ejemplo) que, en una planta nativa, se usa para combatir un organismo patogénico. También
están incluidos en este término elementos reguladores (y, como se define más adelante, fragmentos de esos
elementos reguladores) suficientes para hacer que la expresión de gen sea inducible por señales o agentes
externos asociados a la plaga (por ejemplo, los agentes o señales aquı́ descritos inducidos por patógeno o
elicitor). En general, los elementos reguladores de resistencia a plagas están situados en la región 5’ de
un gen, pero no limitados a eso.
Con “inducible” se quiere decir que un elemento regulador es capaz de mediar expresión aumentada
de genes (por ejemplo, producción de ARNm o de polipéptido) en respuesta a una interacción entre una
célula vegetal y un patógeno o un elicitor. También están incluidos en la, invención elementos reguladores
de resistencia a plagas que dirigen la expresión de gen inducible de un modo especifico para la célula o el
tejido.
Con “obtenido de un gen” se quiere decir que la secuencia de nucleótidos de un elemento regulador
está basada en información de secuencia incluida en un gen vegetal de presentación natural (EAS4 del
tabaco, por ejemplo). Una vez identificado, el elemento regulador acorde con la invención se obtiene
de una fuente natural o se puede preparar aplicando cualquier método estándar (por ejemplo, métodos
recombinantes o sı́ntesis quı́mica). Tal molécula de ácido nucleico recombinantes es, en general, al menos
en 80 % idéntica a un elemento regulador de resistencia a plagas inducible de presentación natural; o sea,
hasta un 20 % de los pares de bases de la secuencia de ADN de referencia se pueden reemplazar por un
par de bases alternativo (por ejemplo, G-C reemplazado por A-T, T-A o C-G), siempre que la actividad
promotora de transcripción de la secuencia alterada sea igual o mayor que la de la secuencia de referencia.
Con “fragmento con resistencia a plagas vegetales inducible” se quiere decir cualquier tramo de nucleótidos, sin considerar su longitud, que baste para dirigir expresión aumentada de genes (producción
de ARNm o de polipéptido), en respuesta a una interacción entre una célula vegetal y un patógeno o
un elicitor. El término “fragmento” significa de preferencia uno con 6-10 nucleótidos de longitud. Sin
embargo, los fragmentos de elementos reguladores de ADN de acuerdo con la invención pueden tener
una longitud de 10-100 nucleótidos, de 100-300 nucleótidos ya hasta mayor que 300 nucleótidos. Esos
fragmentos se preparan por métodos rutinarios (digestión con restricción adecuada, o sı́ntesis quı́mica,
por ejemplo). La identificación de un fragmento de ADN con resistencia plagas vegetales inducible en
un gen se lleva a cabo aplicando métodos normales en la técnica (como por ejemplo los descritos aquı́).
En un ejemplo particular, la identificación de un fragmento con resistencia a plagas vegetales inducible
se puede realizar mediante análisis de supresión de promotor estándar. Una estructura que incluye un
promotor de resistencia a plagas que confiere transcripción inducible por patógeno a un gen informante al
cual está funcionalmente enlazado se puede suprimir progresivamente al aldo de 5’ o de 3’, y/o se pueden
hacer supresiones insertas hasta haber disminuido o eliminado el efecto de un patógeno sobre el gen informante. Para confirmar la identificación del elemento inducible por patógeno, se pueden introducir en
seguida en el elemento mutaciones puntuales. Un enfoque alternativo para medir cambios en la transcripción es enlazar el supuesto elemento regulador desde el gen al gen informante. Para probar promotores
completos, se coloca el fragmento de ADN directamente frente al gen informante falto de actividad de
promotor endógeno. Usando esas técnicas, se puede identificar todo fragmento de un elemento regulador
de resistencia a plagas vegetales inducible.
Con “especı́fico de tejido” se quiere decir capaz de aumentar la expresión de un producto de gen (por
ejemplo, un ARNm o un polipéptido) de preferencia en un tejido (xilema, por ejemplo) y no en otro (por
ejemplo, el floema).
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Con “especı́fico de célula” se quiere decir capaz de aumentar la expresión de un producto de gen
(por ejemplo, una molécula de ARNm o un polipéptido) de preferencia en una célula (por ejemplo, de
parénquima) en comparación con otra célula (epidérmica, por ejemplo).
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Con “sintasa de epi-5-aristoloqueno” o “EAS” se quiere decir una enzima capaz de catalizar la ciclación de trans, difosfato de farnesilo-trans al intermedio bicı́clico epi-5-aristoloqueno.
Con “patógeno” se quiere decir un organismo cuya infección en células de tejido vegetal viables elicita
una respuesta a plaga en el tejido vegetal.
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Con “elicitor” se quiere decir cualquiera molécula capaz de iniciar una respuesta defensiva de una
planta. Ejemplos de elicitores incluyen, sin limitación; uno o más iones tóxicos, por ejemplo iones mercurio; otras composiciones definidas quı́micamente, inhibidores metabolicos, glicanes de pared celular,
ciertas glicoproteı́nas, ciertas enzimas, esporas fungales, quitosanas, ciertos ácidos grasos, ciertos oligosacáridos derivados de paredes de células vegetales, y elicitinas (por ejemplo, harpina, criptogeı́na y
parasiceı́na).
Con “elicitina” se quiere decir elicitor proteı́na.
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Con “funcionalmente enlazado” se quiere decir que una(s) secuencia(s) reguladora(s) y ungen están
conectados de manera de permitir expresión del gen cuando se ligan a dicha(s) secuencia(s) las moléculas
apropiadas (proteı́nas activadoras de transcripción, por ejemplo).
Con “polipéptido, heterólogo” se quiere decir todo polipéptido que se expresa en una célula vegetal
tranformada a partir de un gen parcial o enteramente ajeno a (o sea, no de presentación natural en) la
célula vegetal transformada.
Con “polipéptido” se quiere decir toda cadena de aminoácidos, cualquiera sea su longitud o su modificación post-traducción (por ejemplo, glicolización o fosforilación).
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Con “célula vegetal transformada” se quiere decir una célula en la cual (o en un ascendiente de la
cual) se ha introducido una secuencia de nucleótidos recombinante por ejemplo, el promotor EAS4 (-1147
a +67): gen informantez de GUS, o el gen promotor gEAS4600(ciclasa) : elicitina madura parA1) por
medio de técnicas de ADN recombinante (las técnicas descritas aquı́, por ejemplo).
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Con “célula vegetal” se quiere decir toda célula autopropagable lı́gada por una membrana semipermeable y que contiene un plástido. Una célula ası́ también requiere una pared celular, si se desea propagación
adicional. Célula vegetal, como se usa aquı́, incluye sin limitación: algas, cianobacterias, semillas, cultivos de suspensión, embriones, regiones merismáticas, tejido calloso, hojas, raı́ces, brotes, gametofitos,
esporofitos, polen y microesporas.
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Con “transgénica” se quiere decir toda célula que incluye una secuencia de ADN que se ha insertado
artificialmente en una célula y llega a formar parte del genoma del organismo desarrollado de esa célula.
Como se usan aquı́, los organismos transgénicos son generalmente plantas transgénicas, y el ADN se
inserta artificialmente en el genoma del organismo.
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Con “ADN substancialmente puro” se quiere decir ADN que está libre de los genes o los nucleótidos
auxiliares que, en el genoma de presentación natural en el organismo del cual se deriva el ADN de la
invención, lindan con el gen o elemento regulador. En consecuencia, el término incluye por ejemplo un
ADN recombinante que se incorpora a un vector; a un plásmido o virus autónomamente duplicador; o al
ADN genómico de un procariota o un eucariota; o que existe como molecula separada (por ejemplo, un
ADNc o un fragmento genómico o de ADNc producido por PCR o por digestión de una endonucleasa de
restricción) independiente de otras secuencias. También incluye un ADN recombinante, parte integrante
de un gen hı́brido que codifica una secuencia de polipéptidos adicional o un elemento regulador.
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Otros rasgos y ventajas de la invención se evidenciarán de la siguiente descripción de sus materializaciones preferidas y de las Reivindicaciones.
Descripción de los dibujos
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La Figura 1 presenta datos de experimentos de expresión para GUS regulado por las secuencias de
regiones de promotor EAS3 y EAS4 en comparación con una estructura de CaMV 3SS:GUS (promotor
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35S de Virus del Mosaico de la Coliflor; gen informante de glucuronidasa-beta). Estos experimentos se llevaron a cabo en protoplastos de tabaco en los cuales se habı́an electroporado las estructuras de ADN. Los
niveles “no inducidos” de expresión correspondientes a las estructuras de EAS-GUS fueron relativamente
altos, porque en la preparación de los protoplastos se usaron enzimas fungales que digieren las paredes
de células vegetales. La coordenada y indica unidades de actividad de GUS, y abajo de cada barra del
gráfico se dan las extensiones de las secuencias inversas de EAS. Como anteriormente, la numeración se
refiere al lugar de inicio de transcripción natural EAS4 (o de la correspondiente base de EAS3); en el
EAS4 (SEQ ID NO: 2), un lugar de inicio está en el nucleótido 573; en el EAS3 (SEQ ID NO: 1), un
potencial lugar de inicio de transcripción está en el nucleótido 489.
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Las Figuras 2A-B presentan información concerniente a la expresión de gen informante dirigida por
el actual elemento regulador de transcripción inducible de la invención. La Figura 2A presenta un esquema de experimentos llevados a cabo con la región de promotor EAS4 que controla la expresión del
gen informante de GUS en plantas transgénicas transformadas de modo estable. La Figura 2B presenta
los resultados de ensayos de “ganancia de función” para las secuencias asociadas al promotor EAS4 que
regulan la expresión del gen informante de GUS a través del promotor mı́nimo CaMV 35S. En ambas
Figuras, la 2A y la 2B, la numeración para la región inversa de EAS4 refleja numeración referente al lugar
de inicio de transcripción natural del gen de EAS4 (ver también SEQ ID NO: 2) en la cual el lugar de
inicio de transcripción corresponde al nucleótido 573). En las Figuras 2A y 2B, la expresión GUS está
medida en unidades de fluorescencia por miligramo de proteı́na.
Las Figuras 3A-B son ilustraciones esquemáticas que muestran la secuencia de ADN de la región más
allá de 5’ del gen de EAS4 y la estructura del gen informante de GUS que porta el promotor EAS4 (-1148
a +67). La Figura 3A muestra la secuencia de nucleótidos de la región más allá de 5’ del promotor EAS4
(-1148 a +67). Los conjuntos CAAT y TATA están marcados en negrita. El lugar de inicio de transcripción está marcado como +1. La Figura 3B es una ilustración esquemática que muestra la estructura de
promotor EAS4 (-1148 a +67: gen informante de GUS. La secuencia lindante con 5’ del promotor EAS4
(-1148 a +67) se fusionó, en marco de lectura correcta, con el gen informante de GUS en el vector binario
pBI101.1.
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Las Figuras 4A-B presentan datos concernientes a expresión del gen GUS inducida por elicitor en
hojas, tallos y raı́ces de plantas de tabaco transgénicas que contenı́an EAS4 (-1148 a +67): gen informante de GUS. La Figura 4A es un gráfico que ilustra actividad de GUS inducida por elicitor en hojas de
tabaco, en el transcurso de 18 horas. 06i, 08n y 09p representan cada cual un linaje independientemente
transformado de tabaco transgénico que contiene la estructura promotor EAS4 (-1148 a +67): gen informante de GUS. Agua (como control) y 25 nM de criptogeı́na se infiltraron, simétrica y simultáneamente
en la hoja (de modo abaxial), y luego las zonas de tejido de hojas infiltradas se colectaron para analizar la
actividad de GUS durante 18 horas. Los datos expuestos son los resultados, expresados como promedios,
de dos experimentos separados. La Figura 4B es un gráfico en barras que muestra la actividad de GUS
inducida por elicitor en lostallos y raı́ces de tabaco transgénico que contenı́an el promotor EAS4 (-1148
a +67): gen informante de GUS. 03f y 09p representan dos linajes independientemente transformados de
tabaco transgénico. C-O (encuadres en blanco) representa actividad de GUS existente en raı́ces y tallos
segmentados no tratados con elicitor. C-18 y E-18 (encuadres sombreado y negro) representan actividad
de GUS en raı́ces y tallos segmentados 18 horas después de incubación en agua o en 100 nM de elicitor
criptogeı́na, respectivamente. Se evaluaron cinco plantas independientes por cada linaje transgénico.
La Figura 5 es un gráfico en barras que ilustra actividades de GUS inducida por patógeno de la
subespecie 0 y la subespecie 1 de Phytophthora parasitica variedad Nicotianae, en el tabaco transgénico.
Hojas desprendidas de un linaje de tabaco transgénico (09p) que contenı́an el promotor EAS4 (-1148
a +67): gen informante de GUS se inocularon con tapones miceliales tomados de cultivos de 2 dı́as de
Phytophthora parasitica var. Nicotianae, y luego se incubaron en una cámara para desarrollo a 27◦C, con
luz fluorescente constante por 24 horas. Las hojas testigos se inocularon con tapones de agar de harina
de avena estéril. Las zonas de tejido infectadas se examinaron en seguida respecto de la actividad de
GUS. Los valores indicados por cada barra son las medias y los errores estándar correspondientes a tres
experimentos separados.
La Figura 6 es un gráfico en barras que ilustra la comparación de la actividad de GUS inducida por
patógeno y por elicitor en plantas transgénicas tratadas con Pseudomonas syringae pv. Syringae 61 y
su mutante hrpH y con el elicitor bacteriano de proteı́na harpina purificado. Hojas de uno de los linajes
de tabaco transgénico (09p) que contenı́an el promotor EAS4 (-1148 a +67): gen informante de GUS se
infiltraron ora con 50 µg/ml de elicitor harpina de Erwinia amylovora purificado, ora con suspensiones
de células de P. syringae pv. Syringae 61 de tipo silvestre o de su mutante hrpH (A600 = 0,05). Tras
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incubación por 12 horas, se analizó en seguida la actividad de GUS en zonas, de tejido infiltradas. Los
valores de control representan la actividad de GUS observada en muestras del tejido de hojas que se
infiltró con agua. Los valores indicados por cada barra son el promedio de los resultados obtenidos de 5
plantas.
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Las Figuras 7A-B muestran un análisis con sombreado lateral de la inducción de sintasa de epi-5aristoloqueno (EAS) en tejido de plantas de tabaco. Las proteı́nas se extrajeron de hojas, tallos y raı́ces
de tabaco tratados con el control y con el elicitor. Cantidades iguales de proteı́nas (25 µg por faja para
hoja y tallo, 15 µg por faja para raı́z) se separaron mediante SDS-PAGE y se traspasaron a membranas de
nitrocelulosa. Luego los sombreados se trataron con antisuero de EAS y franjas inmunoreactivas visualizadas usando anticuerpos caprinos antilaucha copulados con fosfatasa alcalina. La Figura 7A reproduce
análisis por sombreado lateral en muestras de tejido de hoja y tallo. La Figura 7B reproduce al análisis
por sombreado lateral en muestras de tejido de raı́ces.
Las Figuras 8A-L son fotografı́as en colores que ilustran la localización de actividad de GUS inducida
por elicitor en tabaco transgénico que contenı́a el promotor EAS4 (-1147 a +67): gen informante de GUS.
Tejidos de hoja provenientes de uno de los linajes representativos del tabaco transgénico se infiltraron con
25 o con 50 nM del elicitor criptogeı́na. Tras aproximadamente 8 horas de incubación, se tiñeron cortes
de tejido usando 1 mM de X-gluc (5-bromo-4-cloro-3-indoı́l-glucurónido-beta), para analizar la actividad
de GUS. Segmentos de tallo y raı́z se incubaron con agua o con 100 nM del elicitor criptogeı́na durante
aprox. 12 horas, antes de sombrear. La Figura 8A es una fotografı́a en colores que muestra la actividad de
GUS inducida por elicitor, en una hora de tabaco transgénico que contenı́a promotor EAS4 (-1147 a +67)
; gen informante de GUS, después de tratamiento con dos preparados -criptogeı́na y parasiceı́na - ambos
con concentraciones de 25 y 50 nM (signados respectivamente C25 y C50 , P25 y P50 en la Figura 8A). La
Figura 8B es una fotografı́a en colores de una sección transversal de hoja, que muestra la actividad de
GUS inducida por elicitor después de tratamiento con criptogeı́na (ampliación x75).
La Figura 8C es una fotografı́a en colores que muestra la actividad de GUS inducida por elicitor en
una sección transversal de un segmento de tallo tratado con criptogeı́na (ampliación x7,5). La Figuras
8D-F son fotografı́as en colores que muestran ampliaciones sucesivamente mayores (x15, x60 y x75, respectivamente) de la seccion transversal de tallo manchada con GUS de la Figura 8C. La Figura 8G es
una fotografı́a en colores que muestra una punta de raı́z tratada con agua y manchada para determinar
actividad de GUS (ampliación x60). La Figura 8H es una fotografı́a en colores que muestra la actividad
de GUS inducida por elicitor en una sección longitudinal de una punta de raı́z tratada con criptogeı́na
(ampliación x60). La Figura 8I es una fotografı́a en colores de una sección longitudinal de una raı́z después
de tratamiento con agua y manchado para estimar actividad de GUS (ampliación x75). La Figura 8J es
una fotografı́a en colores que muestra la actividad de GUS en una sección longitudinal de una raı́z tratada
con criptogeı́na (ampliación x75). La Figura 8K es una fotografı́a en colores de una sección transversal
de raı́z tratada con agua y sombreado para observar actividad de GUS (ampliación x95). La Figura 8L
es una fotografı́a en colores que muestra actividad de GUS en una sección transversal de una raı́z tratada
con criptogeı́na (ampliación x95). C = criptogeı́na; P = parasiceı́na; c = corteza; ca = cambio; e =
epidermis; p = parénquima en empalizada; pe = peridermis; ph = floema; pi = parénquima medular; s
= parénquima esponjoso; t = tricoma; x = xilema y vc = cilindro vascular.
La Figura 9 es un esquema de las manipulaciones genéticas que conducen a generación de plantas
resistentes a plagas. La secuencia que codifica la elicitina ParAl se aı́sla por PCR de modo de tener
extremos BamHI y SstI. El gEAS4600 -GUS-pBI101, que dirige la expresión del gen informante de GUS
bajo control regulador del promotor EAS, se digiere con BamHI y SstI para liberar el gen informante
de GUS. Luego en amplı́mero parA1 digerido con BamHI/SstI se liga al gran fragmento producido tras
la digestión de gEAS4600 -GUS-pBI101, para obtener gEAS4600-parA1-pBI101, del cual se sintetiza la
elicitina parA1 en células o tejido vegetales, después de inducción con un elicitor adecuado.
La Figura 10 es un gráfico en barras que ilustra los grados de enfermedad de linajes independientes de
tabaco transgénico (Nicotiana tabacum cv. KY160) que contenı́an el gen de elicitina madura parAl bajo
control del gen promotor gEAS4600(cicleasa) después de inocular las hojas desprendidas con subespecie 0
o subespecie 1 de Phytophthora parasitica var. nicotianae. La coordenada y indica el total de lesiones
(número de lesiones por hoja) después de 72 horas. La coordenada x indica las plantas testigos y distintos
linajes de tabaco transgénico que se probaron respecto de resistencia a plagas. KY160 denota N. tabacum
cv. KY160 no transformado; G designa linajes de N. tabacum cv KY160 transgénico que se transformaron con una estructura que contenı́a el promotor gEAS4600(cicleasa) fusionado con GUS, M designa
linajes independientes de N. tabacum cv. KY160 transgénico que se transformaron con una estructura
que contenı́a el promotor gEAS4600(cicleasa)) fusionado con la secuencia codificadora de elicitina parA1
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madura; S denota linajes independientes de N. tabacum cv. KY160 transgénico que se transformaron
con una estructura que contenı́a el promotor gEAS4600(cicleasa) fusionado con una secuencia codificadora
de una elicitina parA1 madura que incluye una secuencia lı́der. Barra sombreada denota inoculación de
hoja, desprendida con la subespecie O de P. p. var. Nicotianae. Barra negra denota inoculación de hoja
desprendida con subespecie 1 de P. p. var. Nicotianae.
Realización preferente de la invención
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La sintasa de epi-5-aristoloqueno (EAS) es una enzima clave en la sı́ntesis de fitoalexinas sesquiterpenoides, por ejemplo en plantas solanáceas incluidas, pero sin limitación, la Nicotiana species (tabacum,
por ejemplo), la Capsicum annum y el Hyoscyamus muticus. La EAS cataliza la reacción del difosfato
de farnesilo a gemacreno A(+) a carbocatión de eudesmano a epi-5-aristoloqueno. Otras plantas, tales
como las crucı́feras, también tienen enzimas ciclasa de sesquiterpeno.
Los tratamientos que inducen en tejido vegetal o células vegetales respuestas defensivas del huésped
tales como la sı́ntesis de fitoalexina incluyen fragmentos de pared celular de Phytophthora species y celulasa de Trichoderma viride. Sin embargo, la pectoliasa de Aspergillus japonicum no actúa como elicitor
en cultivo de células de tabaco. Se ha demostrado que elicitores que inducen la sı́ntesis de fitoalexina
sesquiterpenoide operan en el nivel de controlar la transcripción de enzimas biosintéticas claves (Vogeli
y Chappell, Plant Physiol. 94, 1990, págs. 1860-1866). Patrones similares se han observado en otras,
plantas, pero no se han descrito secuencias de control de transcripción que medien inducción de genes en
respuesta a la provocación de fitopatógenos.
El tabaco (N. tabacum) contiene una familia de genes de EAS con unos 12-15 miembros; se ha publicado la secuencia codificadora de EAS4 (Facchini y Chappell, supra, 1992). Sin embargo, desde entonces
estos Inventores han, descubierto que el EAS3 no aparece expresado en respuesta a tratamiento con el elicitor y, sorprendentemente, que las secuencias de nucleótidos más atrás del EAS3 no aparecen mediando
la inducción de un gen informante en una estructura de gen quimérica, en cultivo de células inducido por
elicitor. Se advierte que el lugar de inicio de la traducción se identificó incorrectamente en la publicación
de Facchini y Chappell en 1992. La secuencia de nucleótidos de una clona genómica de EAS4 que aparece
en Facchini y Chappell supra (1992) se presenta en la SEQ ID NO: 7, dándose en la SEQ ID NO: 8 la
secuencia de aminoácidos deducida.
Otros aspectos de las defensas de una planta contra invasión e infección por un microorganismo fitopatogénico incluyen la respuesta hipersensible, que se caracteriza por necrosis, esto es, muerte programada
de células en el área localizada de ataque por el patógeno vegetal. Los tratamientos con elicitor ya descritos también pueden inducir la respuesta necrótica.
Las elicitinas son proteı́nas producidas por fitopatógenos fungales, proteı́nas que inducen una respuesta
hipersensible en una planta infectada. General pero no necesariamente, el resultado de la respuesta inducida por elicitina en el tejido vegetal infectado (o amenazado) es la muerte localizada de células. Estas
respuestas median resistencia total o parcial a infección destructiva por el microorganismo invasor potencialmente fitopatogénico. Para los fines de la presente invención, se considera quedar dentro de una
definición general de elicitina la proteı́na de un fitopatógeno, probado o potencial, que induce la respuesta
hipersensible en un tejido vegetal tras invasión del tejido de esa planta o después de expresión de esa
secuencia codificadora en el tejido de la planta.
Una elicitina relativamente conocida, de un hongo fitopatogénico, es la proteı́na ParA1 de Phytophthora parasitica. El ente parA1 es un miembro de una familia de genes (Ricci et al., Eur. J Biochem. 183,
1989, págs. 555-563). Las secuencias codificadoras y de aminoácidos del producto gen parA1 se describen
en Kamoun et al., Mol. Plant-Microbe Interact. 4, 1993, págs. 423-432, y aquı́ en las SEQ ID Nos: 12 y
13.
Otras proteı́nas de fitopatógeno con potencial actividad de elicitina se han caracterizado en cuanto a
secuencias de aminoácidos y a otras propiedades. (Veánse, por ejemplo: Nespoulous et al., Planta 186,
1992, págs. 551-557; Huet et al., Phytochemistry 31, 1992, págs. 1471-1476; Huet y Pernollet, FEBS
Lett. 257, 1992, págs. 302-306; Kamoun et al., Mol. Plant-Microbe Interact. 5, 1993, págs. 22-33). Se
han caracterizado varios genes novirulentos provenientes de bacterias patogénicas que corresponden a la
actividad de elicitina. Por ejemplo, N.T. Keen describió, en Annu. Rev. Phytopathol. 24, 1990, págs.
447-463, un gen no-virulento de Fulva fulvia. Hammond-Kosack et al. han descrito, en Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 91, 1994, págs. 10445-10449, el gen avr de Cladosporium fulvum, que actúa de igual manera
que la elicitina de P. parası́tica.
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También ciertos fitopatógenos bacterianos expresan proteı́nas con efectos sobre la respuesta hipersensible similares a los de la elicitina ParA1 de P. parası́tica. Para los fines de la presente invención, estas
proteı́nas quedan dentro del alcance del término “elicitina”. Múltiples homólogos del gen no-virulento
avrBs3 de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria se han detectado en otras variedades patogénicas de
X. campestris (Bonas et. al., Mol. Gen. Genet. 218, 1989, págs. 127-136 et al., J. Bacteriol 173, 1991,
págs. 7142-50) y en otras especies de Xanthomonas (De Feyter y Gabriel, Mol. Plant-Microbe Interact,
4, 1991, págs. 423-432; Hopkins et al., Mol.Plant-Microbe Interact. 5, 1992, págs. 451-459). El gen avrD
de Pseudomonas syringae pv. tomato puede conferir avirulencia; la P. syringae pv. glycinea expresa un
producto gen avrD alterado (Kobayashi et al., Mol. Plant-Microbe Interact. 3, 1990, págs. 103-111).
Se entiende que las proteı́nas elicitinas, para ser útiles en la presente invención como se aplica a generar
plantas transgénicas con cualidades de resistencia mejorada a plagas usando una secuencia que codifica
elicitina expresada bajo el control regulador de un elemento regulador de transcripción de respuesta a
un patógeno (y con un promotor mı́nimo funcional en esas plantas), deben ser capaces de promover expresión de genes defensivos (incluidos, pero sin limitación, los genes que rigen la sı́ntesis de fitoalexinas,
la respuesta hipersensible y/o la necrosis localizada) en dichas plantas. En la técnica se conocen muchas
combinaciones funcionales de planta y fitopatógeno, y el especialista experto sabe probar cómo opera
determinada elicitina sobre determinado tejido (o células) vegetal(es) para originar muerte programada
de células, sı́ntesis de fitoalexina y otras respuestas similares. Además, se entiende que el tratamiento de
células o tejidos vegetales con composiciones tales como ciertas celulasas fungales o ciertos fragmentos de
polisacárido vegetal también pueden inducir respuesta defensiva del huésped (o sea, respuesta hipersensible). Esos tratamientos se usan como modelos para efectivo ataque o invasión por patógenos.
Molécula de ácido nucleico recombinante de presentación no-natural, por ejemplo molécula de ADN
recombinante, es una que no se presenta en la naturaleza; es decir, o se ha producido por procesos naturales aplicando métodos conocidos en la técnica pero dirigida por el hombre para obtener un resultado
deseado, o se ha producido artificialmente de partes derivadas de fuentes heterólogas, pudiendo esas partes ser moléculas de presentación natural o sintetizada quı́micamente, y haberse unido por ligación u otro
medio conocido en la técnica.
Planta transgénica es una que se ha modificado genéticamente para que contenga y exprese secuencias
de ADN heterólogas, como moléculas de ARN o como proteı́nas. Según se ejemplificó aquı́ especı́ficamente,
una planta transgénica está modificada genéticamente para contener y expresar una secuencia de ADN
heteróloga funcionalmente enlazada a y bajo control regulador de secuencias controladoras de transcripción por la cuales no es normalmente regulada, o sea, bajo control regulador de las secuencias de control
de transcripción inducible del gen EAS4 de Nicotiana tabacum. Como se usa aquı́, planta transgénica
también se refiere a aquellas que son progenie de la planta transgénica inicial que portan y son capaces
de expresar la secuencia codificadora heteróloga, bajo control regulador las secuencias controladoras de
transcripción cualitativa y/o cuantitativa aquı́ descritas. Esta definición abarca las semillas que contienen
embriones transgénicos.
Cuando se desea producir un gen heterólogo o una secuencia codificadora que interesan, en condiciones de potencial invasión por patógenos o de tratamiento con un inductor (elicitor, por ejemplo), esa
secuencia codificadora se enlaza funcionalmente en la orientación directa a un promotor adecuado y bajo
el control regulador de las secuencias reguladoras inducibles, en la misma orientación que el promotor,
de modo que se produce un ARNm directo (esto es, funcional para expresión por traducción). Una señal
de término de transcripción funcional en una célula vegetal se puede colocar adelante de la secuencia
codificadora, y un marcador elegible capaz de expresarse en una planta se puede enlazar en covalencia a
la unidad de expresión inducible de modo que, una vez introducida esta molécula de ADN en un tejido o
célula vegetal, es posible seleccionar su presencia y células o tejidos vegetales no transformados ası́ serán
destruidos o impedidos de crecer. Análogamente, una secuencia codificadora heteróloga sé puede expresar
bajo control regulador del elemento regulador de transcripción inducible o del elemento incrementador
de transcripción en cultivo de células de planta transgénica en suspensión, produciéndose la inducción en
respuesta a la adición de un elicitor al medio de cultivo de células.
Cuando se desea inhibir la expresión de genes en una planta que está siendo invadida por un patógeno
microbiano, como un hongo fitopatogénico, entonces se puede enlazar funcionalmente una porción o la
totalidad de esa secuencia codificadora o secuencia de ADNc a un promotor funcional en células vegetales,
pero con la orientación de la secuencia codificadora opuesta a la del promotor (esto es, con orientación
inversa), de modo que el ARN transcrito sea de secuencia complementaria de la del ARNm, y de modo
que la expresión de la molécula inversa se induzca en respuesta a la invasión por patógeno. Además,
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puede haber una señal de término de transcripción adelante de los nucleótidos que dirigen la sı́ntesis del
ARN inverso.
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Estos inventores han aislado una secuencia de ADN que media expresión inducible de un gen hacia
adelante en células vegetales, en respuesta a invasión por un potencial fitopatógeno y/o a tratamiento
con un elicitor y otras señales quı́micas. Por ejemplo, una combinación de etileno y jazmonato de metilo
puede servir para inducir expresión hacia adelante de genes mediante la secuencia reguladora de transcripción cualitativa. Se entiende que puede haber dentro de esa secuencia reguladora una multiplicidad de
“motifs” de secuencia, donde los distintos “motifs” responden cada cual a una o más señales ambientales,
diferentes. Como se ejemplificó especı́ficamente, esta secuencia reguladora de transcripción se deriva del
ente EAS4 de N. tabacum, y está dada en la SEQ ID NO: 7. La secuencia de aminoácidos deducida
para la proteı́na EAS se da en la SEQ ID NO: 8. El marco de lectura abierto del gen EAS4, que está
interrumpido por seis intrones, se provee en la SEQ ID NO: 7.
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Una búsqueda por computadora, en Banco de Genes, de secuencias de nucleótidos homólogas a la
SEQ ID NO: 2 reveló cero secuencias de nucleóticos conocidas con homologı́a significativa.
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Facchini y Chappell supra (1992) describieron la disposición de los genes EAS en el genoma de N.
tabacum, usando una sonda de EAS y experimentos de hibridación con sombreado inferior. En condiciones sumamente severas, se hibridaron múltiples fragmentos, indicando el análisis que en el genoma de
tabaco hay una familia de genes con unos 12-16 miembros. Pero en estos experimentos la sonda incluı́a
la secuencia codificadora de EAS, y no la secuencia del promotor ni las secuencias reguladoras asociadas
al promotor.
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Genes homólogos de EAS se pueden identificar y aislar de especies vegetales distintas del N. tabacum
a base de grados significativos de homologı́a de sus secuencias de nucleótidos; es decir, la hibridación
ADN:ADN en condiciones desde moderadas hasta muy severas con una sonda secuencia codificadora de
EAS del tabaco permite identificar el correspondiente gen sacado de otras especies vegetales. Una discusión de las condiciones de hibridación se puede hallar, por ejemplo, en Hames y Higgis, Nucleic Acid
Hybridization (1985), IRL Press, Oxford, R.U. Las secuencias que tienen aproximadamente min. 70 % de
homologı́a con secuencia de nucleótidos generalmente se pueden identificar en condiciones medianamente
severas. En tales condiciones, en general se prefiere usar una sonda de min. 100 bases. Con máximo
preferencia, en el caso presente la sonda se derivará de la porción codificadora de la secuencia que codifica EAS4. Rótulos de sondas para hibridación,’ pueden incluir, pero sin limitación, grupos radiactivos,
grupos fluorescentes, y ligandos tales como la biotina a los cuales se unen coligantes especı́ficos (a su
vez rotulados). Es el rótulo el que permite a la molécula de ácido nucleico “blanco” detectar la sonda
de hibridación. Como alternativa, la conocidı́sima y extensamente accesible tecnologı́a de la reacción en
cadena de polimerasa (PCR) se usa ventajosamente para amplificar cuyo orden de nucleótidos es considerablemente homólogo al de una secuencia “blanco”.
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Se entiende que las secuencias de ácido nucleico distintas de la secuencia codificadora de EAS dada
a conocer en la SEQ ID NO: 7 actuarán como secuencias codificadoras sinónimas de la secuencia codificadora de EAS4 ejemplificada. Secuencias de Acido nucleicos son sinónimas si las secuencias de
aminoácidos codificadas por ellas son las mismas. La degeneración del código genético es muy conocida
en la técnica; esto es, por varios aminoácidos que sirve de codón para el aminoácido. También es muy
sabido en las técnicas biológicas que es posible hacer en secuencias de proteı́na ciertas substituciones de
aminoácidos sin afectar la función de la proteı́na. En general, moderadas substituciones de aminoácidos,
o susbtituciones por aminoácidos similares, se toleran sin afectar la función de la proteı́na. Aminoácidos
similares pueden ser los que tienen similares propiedades de tamaño y/o carga; por ejemplo, aspartato
y glutamato, isoleucina y valina, son ambos pares de aminoácidos similares. La similitud entre pares de
aminoácidos se ha determinado en la técnica de varias maneras. Por ejemplo, Dayhoffet al., en Atlas of
Protein Secruence and Structure t. 5, Supl. 3, 1978, págs. 345-352, incorporadas aquı́ como referencia,
proveen tablas de frecuencia para substituciones de aminoácidos que se pueden emplear como medida de
la similitud entre aminoácidos. Las tablas de frecuencia de Dayhoff et al. se basan en comparaciones
entre secuencias de aminoácidos para proteı́nas con una misma función que provienen de una variedad
de fuentes evolutivamente distintas.
Genes de ciclasa de terpeno se pueden hallar en plantas solanáceas - incluidos el N. tabacum y el
Hyoscyamus muticus dados a conocer aquı́ - y en los miembros de la familia mentas (Labitaceae) y las
Euphorbiaceae - incluidos, pero sin limitación, los que se ha demostrado contienen secuencias considerablemente homólogas - y en substancialmente todas las plantas. De preferencia, homólogas del EAS4
se elegirán de entre las Solanaceae. Esas secuencias se pueden identificar mediante experimentos de hi11
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bridación de ácidos nucleiclos o clonadas en vectores de expresión, por reacción cruzada al anticuerpo
especı́fico de EAS del tabaco, o por cualquier otro medio conocido en la técnica, incluido el uso de la
tecnologı́a de PCR llevada a cabo empleando oligonucleotidos correspondientes a porciones de la SEQ ID
NO: 7, de preferencia en la región que codifica EAS. El anticuerpo se puede preparar después de inmunizar un animal de ensayo con EAS purificada, como lo describieron Vageli et al. en Plant Physiology 93,
1990, págs. 182-187, o usando un conjugado de péptidos donde la secuencia de aminoácidos del péptido
se toma de una porción hidrófila de la secuencia de aminoácidos de la EAS (SEQ ID NO: 8). Técnicas
de producción de anticuerpos monoclonal y policlonal son fácilmente accesibles para la técnica. (ver, por
ejemplo, de Campbell, “Monoclonal Antibody Technology” en Laboratory Techniques in Biochemistry
and Molecular Biology t. 13, 1994, eds. Burdon y Knippenberg, Elsevier, Amsterdam; de Harlow y Lane,
“Antibodies: A Laboratory Manual”, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.)
Como alternativa, se puede analizar un acopio de ADNc (en un vector de expresión) con un anticuerpo especı́fico para EAS, o bien se puede preparar un anticuerpo especı́fico para péptido EAS usando
secuencia(s) de regiones hidrófilas de la proteı́na EAS (SEQ ID NO: 8) y tecnologı́a muy conocida en la
especialidad.
Una secuencia reguladora de transcripción inducible se puede enlazar funcionalmente a cualquiera secuencia de promotor funcional en plantas, como lo entiende el técnico experto; cuando hay que copular a
un promotor un elemento regulador, generalmente se usa un promotor truncado (o mı́nimo), por ejemplo
él promotor truncado 35S de Virus del Mosaico de la Coliflor (CaMV). También se pueden usar versiones
truncadas de otros promotores constitutivos, para proveer regiones homólogas a CAAT y TATA; esas
secuencias de promotor se pueden derivar de genes de ADN-T de la A. tumefaciens tales como el nos, el
ocs y el mas, y de genes de virus vegetales como el gen 19S del CaMV. Se entenderá que las metas de un
técnico experto van a determinar la elección de ciertos promotores usados con las secuencias reguladoras
de transcripción inducibles. Además, se entiende que si se ha de expresar una proteı́na capaz de generar
la respuesta muerte de células, entonces de preferencia no hay expresión básica de transcripción (ni de
traducción), en ausencia del inductor. La minimización de expresión básica es menos crı́tica en aplicaciones para expresión inducible de gen, cuando el producto gen no tiene toxicidad significativa para las
células vegetales que lo producen.
Un promotor mı́nimo contiene las señales de secuencia de ADN necesarias para ligación de la polimerasa, de ARN e inicio de la transcripción. En el caso de promotores polimerasa II de ARN, el promotor
se identifica por un “motif” secuencia homóloga de TATA situado unos 20-50 pares de bases atrás del
lugar de inicio de transcripción. Por convención, el técnico experto a menudo marcalos nucleótidos atrás
del inicio de transcripción con números cada vez más altos (en la dirección –>5’) desde el lugar de inicio.
Generalmente, la transcripción dirigida por un promotor mı́nimo es baja y no responde positiva ni negativamente a señales ambientales o de desarrollo en el tejido vegetal. Un promotor mı́nimo ejemplar para
uso en plantas es el promotor 35S de CaNV truncado, que contiene las regiones -90 a +8 del gen 35S.
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La secuencia reguladora de transcripción inducible (secuencia reguladora de transcripción cualitativa)
se ubica hasta la región entre -167 y -100 respecto del lugar de inicio de la transcripción de EAS4 (nucleótidos 406-473, inicio en el nucleótido 573 de la SEQ ID NO: 2). Se entiende que puede haber una
pluralidad de “motifs” de secuencia que responden a estı́mulos particulares. El enlazar funcionalmente
esta secuencia inmediatamente atrás de un promotor mı́nimo que actúa en una célula vegetal confiere
expresión inducible de una secuencia codificadora funcionalmente fusionada justo adelante del promotor, por ejemplo de una secuencia codificadora heteróloga, y el técnico experto comprende los requisitos
de espaciamiento y otros requisitos para la expresión de traducción de la secuencia codificadora. La
secuencia codificadora heteróloga s de preferencia para una proteı́na elicitinoide de un microorganismo
fitopatogénico (virus, bacteria y hongo), por ejemplo la secuencia que codifica el producto gen parA1
(elicitina) de Phytophthora parasitica, donde es deseable resistencia a plagas por la vı́a de la respuesta de
hipersensibilidad a un potencial patógeno invasor de plantas. Las proteı́nas harpinas de ciertas bacterias
fitopatogénicas también pueden servir como inductores de expresión mediada por las secuencias reguladoras de transcripción inducibles derivadas del EAS4. La inclusión de una secuencia adicional lindante
con 5’ desde el gen EAS4 permite mayores niveles de expresión de gen hacia adelante. Se prefiere el uso
de una secuencia que incluye la región -266 a +1 de EAS4 (nucleótidos 307-573 de la SEQ ID NO: 2), y
se privilegia más la secuencia que incluye la región -567 a +1 (nucleótidos 1-573 de la SEQ ID NO: 2).
Una alternativa al uso de la fusión de la secuencia reguladora de transcripción de EAS4 con un promotor mı́nimo heterólogo es el uso de la región promotora de EAS4 en conjunto con los elementos reguladores
asociados al promotor hacia atrás. En tal aplicación se prefiere el uso de los nucleótidos 307-463 y mejor
aún, para mayores niveles de expresión hacia adelante, los nucleótidos 371-463, 311-462 y 10-573 de la
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SEQ ID NO: 2).
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En una planta como la Nicotiana tabacum, el elemento regulador de transcripción inducible instantáneo dirige la inducción de expresión de gen hacia adelante, en respuesta a fitopatógenos invasores
a ciertas composiciones tales como algunas celulasas fungales y ciertos fragmentos de pared de células
vegetales y fungales. Los fitopatógenos que pueden provocar esta expresión incluyen, pero sin limitación,
Xanthomonas, Pseudomonas syringae, especies de Phytophthora incluida laparasitica, y especies de Peronospora (tabaci, por ejemplo).
Secuencias codificadoras adecuadas para expresión en una planta se enlazan funcionalmente adelante
de la estructura de promotor regulada. Plantas transgénicas se pueden generar usando el gen quimérico
compuesto esencialmente del promotor regulado, cualesquiera secuencias incrementadoras de transcripción adicionales, y la secuencia codificadora deseada que incluye las señales desecuencia necesarias para
su traducción. Cuando se ha de inducir ventajosamente resistencia a plagas en respuesta a invasión de un
tejido de planta transgénica por un potencial fitopatógeno, o en respuesta a tratamiento con unelicitor y
otra señal quı́mica, que induce expresión del genEAS4, la secuencia codificadora lo es de preferencia para
una elicitina de un microorganismo fitopatogénico, por ejemplo el producto gen parA1 de Phytophthora
parasitica (descrito en Kamoun et al. supra, 1993). En literatura cientı́fica fácilmente disponible se han
descrito otras proteı́nas elicitinoides incluidas las de especias de Phytophthora, Peronospora y Xanthomonas, entre otras.
Secuencias codificadoras alternativas que se pueden expresar bajo control regulador del presente elemento regulador de transcripción inducible para mejorar la resistencia de una planta (transgénica) o de
un tejido vegetal expuestos a un fitopatógeno viral, bacteriano o fungal incluyen, pero sin limitación, la
quitinasa, la proteı́na de capa del TMV y otra proteı́na de capa de virus vegetal, el gen del virus NIa y
otros.
Adicional o alternativamente, la inducción de la estructura regulada se puede efectuar, por ejemplo,
tratando la planta transgénica o el tejido vegetal con un elicitor o con una bacteria, un virus o un hongo
(de preferencia no-patogénico para la planta huésped) capaz de inducir expresión mediante un elemento
regulador de transcripción inducible de una secuencia codificadora no capaz de activar la HR, o se podrı́a
obtener directamente la resistencia a plagas. Las secuencias codificadoras que se pueden expresar ventajosamente incluyen la de una proteı́na insecticida como una de las proteı́nas cristalinas del Bacillus
thuringiensis, que expresadas protegerı́an la planta contra plagas de insectos.
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La sı́ntesis de fitoalexina a partir del gen de EAS4 nativo, la inducción de la expresión de gen por el
presente promotor EAS4 regulado, o el elemento regulador de transcripción inducible combinado con al
menos un promotor mı́nimo heterólogo, se pueden inducir tratando el tejido o células de planta con una
extensa variedad de productos quı́micos definidos, filtrados de cultivos fungales crudos, extractos de pared
celular de hongos, y oligosacáridos de paredes celulares vegetales y fungales (Albersheim y Valent, J. Cell
Biol, 78, 1978, págs. 627-643). Otros compuestos capaces de inducir la HR incluyen ciertas celulasas - de
Trichoderma viride, por ejemplo - y ciertos fragmentos de pared celular de planta y hongo, entre otros.
Una planta transgénica se puede producir por cualquier medio conocido en la técnica incluidos, pero
sin limitación, el traspaso de ADN mediado por Agrobacterium tumefaciens, de preferencia con un vector
de ADN-T inhabilitado; la electroporación y el bombardeo con partı́culas. (Véanse: Davey et al., Plant
Mol. Biol. 13, 1989, págs. 275; Walden y Schell, Eur. J. Biochem 192, 1990, pág. 563; Joersbo y
Burnstedt, Physiol. Plant. 81, 1991, pág. 256; Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.
42, 1991, pág. 205; Gasser y Fraley, Sci. 244, 1989, pág. 1293; Leemans, Bio/Technology 11, 1993,
pág. 522; Beck et al., Bio/Technology 11, 1993, pág. 1524, Koziel et al., Bio/Technology 11, 1993, pág.
194; y Vasil et al., Bio/Technology 11, 1993, pág. 1533). Son muy conocidas en la especialidad técnicas
para introducir ADN tanto en monocotiledóneas como en dicotiledóneas, y también lo son técnicas para
cultivar esos tejidos vegetales y regenerarlos. Monocotiledóneas que se han transformado y regenerado
exitosamente incluyen el trigo, el maı́z, el centeno, el arroz y el espárrago. Por ejemplo, la Patente de
E.U. No. 5,350,689 (Shillito et al., 1994) describe plantas de Zea mays regeneradas a partir de protoplastos y de células derivadas de protoplastos. Para producción eficiente de plantas transgénicas, se
desea que el tejido vegetal usado en la transformación posea una gran capacidad de regeneración. Se
ha preparado tejido de álamo temblón transgenico, y se ha regenerado plantas transgénı́cas (Devellard
et al., C.R. Acad. Sci. Ser VIE 314, 1992, págs. 291-298K; Nilsson et al., Transcrenic Res. 1, 1992,
págs. 209-220; Tsai et al., Plant Cell Rep. 14 1994, págs. 94-97). Se han transformado también otros
álamos (Wilde et al., Plant Physiol. 98, 1992, págs. 114-120). También hay disponible tecnologı́a para
manipulación, transformación y regeneración, de plantas gimnospermas en el laboratorio. Por ejemplo,
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la Patente E.U. 5,122,466 (Stomp et al., 1992) describe la transformación biobalı́stica de conı́feras, siendo
los tejidos “blancos” preferidos el meristemático, el de cotiledón y el de hipocótilo. La Patente E.U. No.
5,041-382 (Gupta et al., 1991) describe enriquecimiento de células embrionarias de conı́fera.
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Son conocidı́simos técnicas y agentes para introducir y seleccionar la presencia de ADN heterólogo en
células y/o tejidos vegetales. Son muy conocidos marcadores genéticos que permiten selección de ADN
heterólogo en células vegetales, por ejemplo genes portadores de resistencia a un antibiótico como la kanamicina, la higromicina, la gentamicina o la bleomicina. El marcador permite seleccionar células vegetales
exitosamente transformadas que crecen en el medio que contiene el antibiótico apropiado, porque ellas
portarán el correspondiente gen de resistencia.
En otras técnicas para gestar genéticamente células y/o tejido vegetales con un casete de expresiones
que comprende un promotor inducible, o un promotor quimérico, fusionado a una secuencia codificadora
heteróloga y una secuencia de término de transcripción han de introducirse en el tejido o célula vegetal por
transformación mediada por Agrobacterium, electroporación, microinyeccion, bombardeo con partı́culas
u otras técnicas conocidas en la especialidad. El casete de expresiones de preferencia contiene además un
marcador que permite seleccionar el ADN heterólogo en la célula vegetal, por ejemplo un gen portador
de resistencia a un antibiótico como la kanamicina, la gentamicina, la higromicina o la bleomicina.
La secuencia reguladora de transcripción, en particular el elemento regulador de transcripción inducible (o el promotor EAS4 con el elemento inducible y de preferencia con el incrementador de transcripción),
sirve para controlar la expresión de genes en células de plantatransgénica en cultivo de células en suspensión, como alternativa a la expresión en plantas transgénicas. Por ejemplo, el promotor EAS4 que
incluye las señales de inicio de transcripción, el elemento regulador de transcripción inducible y el elemento
incrementador de transcripción se pueden usar para mediar la expresión inducible de una o más secuencia(s) codificadora(s) heteróloga(s) en células de planta transgénica, en cultivo de células en suspensión.
Cuando se desea, la expresión de la secuencia codificadora que interesa se induce agregando al cultivo
un elicitor y otra señal quı́mica inductora. Las células cultivadas en suspensión responden fácilmente
a elicitores, comparadas con plantas intactas. La(s) secuencia(s) codificadora(s) heteróloga(s) puede(n)
codificar proteı́nas que median sı́ntesis de compuestos farmacéuticos, sı́ntesis del polihidroxibutiratobeta y otros metabolitos secundarios, celulosa, almidón, azúcares, aceites; o bien la(s) secuencia(s) heteróloga(s) puede(n) codificar proteı́nas farmacéuticas, proteı́nas de toxina insecticida, proteı́nas antifungales, proteı́nas antivirales (como las proteı́nas de capa para mediar resistencia a infección viral),
la proteı́na N1a, las quitinasas, las glucanasas, las proteı́nas o secuencias para esterilidad masculina,
proteı́nas para mejorar el contenido o calidad nutritivos, o bien programas o patrones especı́ficos para
el desarrollo y/o el tejido. Se entiende que para expresar secuencias codificadoras heterólogas se pueden
usar plantas transgénicas tal como se pueden usar células de planta transgénica.
Cuando se ha de inducir plantas transgénicas para sintetizar fitoalexinas o para expresar una secuencia codificadora heteróloga bajo el control regulador del promotor EAS4 o del elemento regulador de
transcripción, inducible derivado del mismo, y/o también la secuencia incrementadora de transcripción
derivada del promotor EAS4, el elicitor debe penetrar la cutı́cula de la planta, para tener un efecto
inductivo. Como alternativa, se puede herir el tejido vegetal para facilitar o permitir la absorción del
elicitor en dicho tejido. Una extensa variedad de composiciones inductoras, incluidos elicitores y otras
señales quı́micas tales como la combinación de etileno y jazmonato de metilo, se pueden introducir efectivamente en los cultivos en suspensión de células de planta transgénica, donde hay considerablemente
menor obstáculo a la absorción y/o detección de los elicitores. Cuando para inducir expresión de genes
sirven el etileno y el jazmonato de metilo, se usan el etileno en concentración aproximada de 1-50 p.p.m.
y el jazmonato de metilo en concentración aproximada de 0,1-1mM.
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En los ejemplos siguientes se usan varios métodos muy conocidos y accesible para los expertos en las
técnicas de biologı́a molecular, en la manipulación del ADN recombinante en tejido vegetal, y en el cultivo
y regeneración de plantas transgénicas. Las enzimas se obtienen de fuentes comerciales y se emplean de
acuerdo con las recomendaciones de los proveedores o con otras variaciones conocidas en la especialidad.
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Los reactivos, tampones y condiciones de cultivo también son conocidos en la especialidad. Referencias
que proveen procedimientos biomoleculares estándar incluyen: Sambrook et al., “Molecular Cloning”, 2a¯
edic. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N.Y.; R. Wu (edit.), Methods in Enzymology
218 (1993); Wu et al., (eds.) Methods in Enzymology 100 y 101 ; Glover (edit.), “DNA Cloning” ts. I
y II (1985), IRL Press, Oxford, R.U.; y Hames y Higgins (eds.), “Nucleic Acid Hybridization” (1985),
IRL Press, Oxford, R.U. Referencias relacionadas con la manipulación y transformación de tejido vegetal
incluyen: R.A. Dixon(edit.), “Plant Cell Culture: A Practical Approach” (1985), IRL Press, Oxford,
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R.U.; Schuler y Zielinski, “Methods in Plant Molecular Biology” (1989), Academic Press, San Diego,
Cal.; I. Potrykus, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42, (1991), pág. 205; Weising et al., Annu,
Rev. Genet. 22, (1988), pág. 421; van Wordragen et al., Plant Mal. Biol Rep. 19, (1992), pág. 12;
Davey et al., Plant Mol. Biol. 13, (1989), pág. 273; Walden y Schell, Eur. J. Biochem 192, (1990),
pág. 563; Joersbo y Brunstedt, Physiol. Plant. 81, (1991), pág. 256 y otros trabajos citados en las
referencias precedentes. Las abreviaturas y nomenclatura, donde se las emplea, se consideran normales
en este campo y son de uso común en revistas especializadas como las citadas aquı́.
Todas las referencias mencionadas en esta Solicitud se han incorporado aquı́ para consulta.
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Los ejemplos siguientes se proveen con fines ilustrativos y no están destinados a limitar el alcance de
la invención aquı́ reivindicada. Se pretende que cualesquiera variaciones en los métodos y composiciones
ejemplificados que se le ocurran al técnico experto queden comprendidos en el alcance de la presente
invención.
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Ejemplos
Ejemplo 1
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Anticuerpos especı́ficos para EAS
Se prepararon anticuerpos monoclonales y policlonales especı́ficos para EAS, como lo describieron Vogeli et al. en Plant Physiology 93, 1990, págs. 182-187. Como anticuerpos policlonales, se pudieron hacer
preparados de anticuerpo adicionales, usando como antı́geno EAS purificada o usando una secuencia de
péptidos conjugada con una proteı́na portadora por medio de técnicas muy conocidas. La secuencia de
aminoácidos de un péptido para producir anticuerpo se escoge de una región particularmente hidrófila
de la proteı́na. (Para técnicas de producción de anticuerpos ver, por ejemplo: Campbell, “Monoclonal
Antibody Technology. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology”, t. 13 (1994),
Burdon y Knoppenberg eds., Elsevier, Amsterdam; Harlow y Lane, “Antibodies: A Laboratory Manual”
(1988), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).
Ejemplo 2
Determinación de Secuencias ADN y de Proteı́na
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Se llevaron a cabo determinaciones de secuencia de ADNs mono- y bifilar, por el procedimiento de
terminación de cadena de didesoxinucleótidos (Sanger et al., Proc. Natl. Acad-Sci. USA 74, 1977, págs.
8073-8077), con un juego Sequenase de la United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio o un sistema
a base de fluorescencia automatizado (Applied Biosystems, Foster City, California).
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Ejemplo 3
Formación de una Clona de EAS de Longitud total
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Cultivos en suspensión de células de Nicotiana tabacum L. cv. KY14 se trataron con celulasa de
Trichoderma viride (Tipo RS, Onozuka), en concentración final de 0,5 µg/ml durante fase de desarrollo rápido, para inducir la expresión de EAS. Sirvieron como testigos cultivos de células en suspensión
paralelos que no recibieron celulasa. Las células se colectaron, por filtración a vacı́o moderado, 4 horas
después de la adición de elicitor celulasa al cultivo inducido.
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Se preparó un acopio de ADNc en pcDNAII (Invitrogen, San Diego, Cal.) proveniente de ARN poliA+
extraı́do de las células de N. tabacum tratadas 4 horas con elicitor. El acopio se examinó por hibridación
diferencial, usando ARN polia+ preparado de los cultivos inducido y testigo. Las clonas que resultaron
ser positivas se reexaminaron por análisis de selección hibrida-traducción in vitro-inmuno-precipitación,
como lo describieron Alwine et al., en Methods Enzymol. 68, 1979, págs. 220-242.
Se usó una clona de ADNc de EAS, supuestamente positiva, como sonda de hibridación para aislar
clonas adicionales de ADNc y genómicas. El acopio genómico ası́ analizado fue uno construido en lamdaEMBL3 usando ADN parcialmente digerido con MboI, preparado del ADN de hipocótilo de N. tabacum
L. cv. NK326 (Clontech, Palo Alto, Cal.). Este análisis dio 8 clonas independientes, cada una de las
cuales parecı́a representar un ente cromosómico distinto. Las clonas genómicas EAS4 y EAS3 fueron
descritas por Facchini y Chappell supra 81992), pero ahora se sabe que estaban incompletas.
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Facehini y Chappell supra (1992) habı́an identificado erróneamente los lugares de inicio de traducción
de las secuencias codificadoras de EAS3 y EAS4, en la clona genómica ahı́ descrita. Se ha determinado
que los lugares de inicio de traducción correctos para las secuencias codificadoras de EAS3 y EAS4 son
codones de metionina a 165 pares de bases atrás de los codones de ATG anteriormente identificados como
lugares de inicio. El lugar de inicio para EAS4 corregido se proyectó usando una combinación de ensayos
de extensión de iniciador para identificar el lugar de inicio de transcripción y datos de secuenciación de
aminoácidos en el terminal N de enzima purificada, antes indicados aquı́.
Se preparó por PCR un amplı́mero de 110 pares de bases, para proveer una secuencia de ADN correspondiente a los amino-ácidos 56-92 de la proteı́na EAS4 (ver SEQ ID NO: 12 y Facchini y Chappell supra,
1992). Este amplı́mero se usó como sonda de hibridación para analizar un acopio de ADNc en pcDNAII
(Invitrogen, San Diego, Cal.) preparado a partir de ARN polia+ proveniente de cultivo de células de
tabaco, 4 horas después de tratamiento con elicitor (celulasa de Trichoderma viride). Este amplı́mero
se hizo usando un iniciador directo (ATGCTGTTAGCAACCGGAAGG; SEQ ID NO: 3) y un iniciador
inverso (ATCCAAAATCTCATCAATTTC; SEQ ID NO: 4), y la plantilla de EAS4 genómica, en una
PCR estándar (Saiki et al., Science 239, 1988, págs. 487-491). El amplı́mero de 110 pares de bases se
aisló después de electroforesis en gel de poliacrilamida, usando papel DE-81 (Whatman International,
Inc., Clifton, N.J.). Luego el fragmento aislado se radio-rotuló con (alpha-32P)-dCTP, usando un “kit”
iniciador aleatorio de Strategene (La Jolla, Cal.) para uso como sonda hibridación en las inoculaciones
en altura (“lifts”) de colonias del acopio de ADNc, descrito anteriormente (Hanahan y Meselson, Gene
10, 1980, págs. 63-67). La clona más larga obtenida en estos experimentos resultó carecer de 80 pares de
bases de la secuencia codificadora de 5’.
Para obtener una clona de longitud total, se adoptó un enfoque de RT/PCR. Se preparó ADNc con
primer filamento, a partir de ARN polia+ preparado de células de tabaco después de la inducción con
elicitor ya descrita (Facchini y Chappell, supra, 1992), usando el iniciador inverso que tiene la secuencia
ATGAGTCCTTACATGTGA (SEQ ID NO: 5). Esta secuencia corresponde a los nucleótidos 459-477
adelante del lugar de inicio de traducción. La reacción con transcriptasa inversa se llevó a cabo en una
reacción de 10 µl de tampón para sı́ntesis de primer filamento (1 µg de ARNpoliA+, 25 pM de iniciador
inverso, 10mM de DTT, 2,5 mM de cada uno de dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 8 uds. de RNasa Block
I (Stratagene, La Jolla, Cal.) usado conforme a las instrucciones del fabricante (Stratagene), durante 1
hora a 37◦ C. Esta reacción se terminó tratando por 5 min. a 99◦ C. Luego se agregaron a la reacción
de primer filamento 40 µl de mezcla maestra para PCR; la mezcla maestra para PCR contiene 10 mM
de Tris-HC1 pH 8,3, 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl2 , 0,01 % de Tween-20, 0,01 % (p/v) de gelatina,
0,01 % de NP-40, 2,5 mM de cada uno de desoxinucleótido y trifosfato, 1 ud. de polimerasa TaqI y 25 pM
de iniciador hacia adelante (GGGAGCTCGAATTCCATGGCCTCAGCAGCAGCAGTTGCAAACTAT,
SEQ ID NO. 6, con los lugares de reconocimiento de EcoRI y NcoI subrayados y el lugar de inicio de
traducción ATG en negrita). La PCR se llevó a cabo en condiciones estándar (Back et al., Arch, Biochem,
Biophys. 315, 1994, págs. 523-532).
El producto de reacción de 492 pares de bases se digirió con EcoRI y HindIII y se subclonó en el
pbluescript SK (Stratagene) cortado análogamente. En seguida, un fragmento de HindIII/XhoI proveniente de otra clona de ADNc parcial se clonó en los lugares correspondientes de la clona de secuencia
de terminal 5’, generando una clona de ADNc de longitud total llamada pBSK-TEAS. El ADN de pBSKTEAS se transformó en Escherichia coli usando un protocolo de CaCl2 (Sambrook et al., supra, 1989)
La determinación de la secuencia de ADN del inserto confirmó que este plásmido tenı́a la estructura
esperada y deseada (procedimiento de terminación de cadena de didesoxinucleótidos, United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio).
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Ejemplo 4
Identificación de Secuencias homólogas de EAS
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Se aisló ADN genóico de hojas de tabaco, como lo describieron Murray y Thompson en Nucleic Acids
Research 8, 1980, págs. 4321-4325. Tras digestión de alı́cuotas con enzimas de restricción deseadas, las
muestras de ADN digerido se sometieron a electroforesis sobre geles de agarosa al 0,8 % y los ADNs
separados por tamaño se traspasaron a membranas de nilón. Manchas de ADN se hibridaron con cEAS1
radio-rotulada con iniciador aleatorio y que está truncada en el extremo 5’ de la región codificadora
(preparada como en Sambrook et al., supra, 1989), a 60◦ C en 0,25M de tampón fosfato de sodio pH 8,
0, 0, 7 % SDS, 1 % de albúmina de suero bovino, 1mM de EDTA. Luego la mancha se lavó dos veces, a
45◦C, con 2X SSC, 0,1 % de SDS, y dos veces con 0,2X SSC, 0,1 % de SDS (1X SSC es 0,15 M de NaCl,
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0,015 M de citrato de sodio, pH 7,0). Se estimaron niveles relativos de hibridación, de auto-radiogramas,
usando un densitometro a video (MilliGen/Biosearch, Ann Arbor, Michigan).
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Facchini y Chappell, supra (1992) informaron que resultados de hibridación con sombreado inferior
indicaban que en el genoma del N. tabacum habı́a 12-16 ejemplares de homólogos de EAS. Para abordar
la presencia de secuencias significativamente homólogas a la EAS del tabaco y el número aparente de
ejemplares de esas secuencias por genoma, se llevaron a cabo experimentos de hibridación con sombreado
inferior, usando ADN aislado de otras especies vegetales.
Los ADNs genómicos digeridos con endonucleasa de restricción se separan mediante electroforesis sobre gel de agarosa (0,81 % de agarosa) , y luego se traspasan a una membrana Hybond-N+ (Amersham
Corp., Arlington Heights, Illinois). La sonda radio-rotulada comprende secuencias codificadoras de EAS,
y las hibridaciones se llevan a cabo esencialmente como lo describieron Sambrook et al., supra (1989). Se
usan condiciones moderadamente severas (hibridación 4X SSC a 65◦C, último lavado en 1X SSC a 65◦ C).
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Como alternativa, se puede llevar a cabo PCR usando ADN “blanco” como plantilla e iniciadores
derivados de la secuencia codificadora de EAS4 en regiones altamente conservadas (ver SEQ ID NO: 7),
empleando técnicas muy conocidas.
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Ejemplo 5
Detección de Proteı́na EAS
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La actividad enzimática de un producto de expresión se puede confirmar usando las técnicas descritas
en Facchini y Chappell, supra, (1992) y en Back et al., Arch. Biochem Biophys. 315, 1994, págs. 527-532.
Para detectar la presencia de material proteı́na EAS reactante en cruz, se prepararon fracciones de
proteı́na total a partir de alı́cuotas de 100 µl de cultivo bacteriano, recolectado y concentrado por 2 min.
de centrifugación en una microcentrı́fuga. Tras descartar el sobrenadante de cultivo, se resuspendieron
pellas de células en 100 µl de 50 mM de Tris-HC1 pH 6,8, 10 mM de ditiotreitol, 2 % de dedocilsulfato
de sodio, 0,01 % de azul de bromofenol, 101 de glicerol. Para detección inmunológica, alı́cuotas de 15
µgl se someten a electroforesis sobre gel de SDS-poliacrilamida al 11,5 %; para tinción de las proteı́nas
con azul de Coomassie, se someten de igual manera a electroforesis alicuotas de 35 µl. Para las muestras
de proteı́na soluble, las células se procesan como en el procedimiento para determinar la actividad enzimática (véase Back et al., supra, 1995 o Facchini y Chappell, supra, 1992). Para detección inmunológica
se someten a electroforesis, como ya se dijo, alı́cuotas de 10 µl; para la tinción con azul de Coomassie, se
sometieron a electroforesis alı́cuotas de 10-50 µl.
Después de electroforesis, las proteı́nas se tiñen con azul de Coomassie o se traspasan a membranas
de nitrocelulosa como se describió (Towbin y Gordon, Journal of Immunological Methods 72, 1984, págs.
313-340), para inmunodetección. Tras 30 min. de incubación en 5 % de leche poco grasa en 1X TBS (20
mM de Tris-HC1 pH 7,5, 500 mM de NaCl), las manchas de nitrocelulosa se incubaron toda la noche en
la misma solución que contenı́a anticuerpo monoclonal especı́fico para EAS del tabaco (dilución 1 : 1000;
Vogeli et al., Plant Physiolocy 93, 1990, pags. 182-187). En seguida, anticuerpos caprinos antilaucha enlazados a fosfatasa alcalina y el colorante cromogénico especı́fico se incubaron, para visualizar la ligación
del anticuerpo especı́fico para EAS a las proteı́nas inmovilizadas sobre las membranas de nitrocelulosa
(Leary et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 80, 1983, págs. 4045-4049).
Ejemplo 6
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La Clona genómica de EAS4
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La clona de ADNc truncado en 5’, cEAS1, descrita en Facchini y Chappell, supra, 1992 se usó como
sonda de hibridación para analizar un acopio genómico de N. tabacum ev. NK326 en el vector lamdaEMBL3 (Clontech., Palo Alto, California). Se determinaron secuencias de ADN usando subclonación de
rutina y protocolos de secuenciación de ADN.
Las secuencias de ADN, y de aminoácidos deducida, de la clona genómica de EAS4 se presentan en
las SEQ ID Nos: 7 y 8.
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Ejemplo 7
Generación de Plantas transgénigas
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Para estudiar la función de porciones de la región del gen EAS4 no traducida hacia atrás, fragmentos
de este ADN atrás de 5’ terminados en HindIII/BamHI se clonaron en el pBI101 (Clontech, Palo Alto,
Cal.) para poder monitorear la expresión del gen informante de glucuronidasa-beta (GUS) en células
de planta transformada. La secuencia lindante con 5’ del gen de EAS3 se da en la SEQ ID NO: 1, y la
secuencia lindante con 5’ del gen de EAS4 se da en la SEQ ID NO: 2. En estas dos secuencias, el lugar
de inicio de traducción (ATG) es los tres últimos nucleótidos. Por técnicas de extensión de iniciador,
el lugar de inicio de transcripción se estimó en el nucleótido 573 de la SEQ ID NO: 2. Los conjuntos
“motifs” CAAT y TATA se identifican en los nucleótidos 429-432 y los nucleótidos 456-459 de la SEQ ID
NO: 1 (EAS3), y en los nucleótidos 513-516 y los nucleótidos 540-543 de la SEQ ID NO: 2 (EAS4).
Los linajes de células vegetales transformadas se produjeron usando un protocolo de transformación
de em Agrobacterium tumefaciens modificado. Los plásmidos recombinantes que contenı́an las secuencias
por introducir en tejido vegetal se traspasaron a la cepa GV3850 de A. tumefaciens, mediante copulación
triparental con E. coli TB1 (pRK2013). Hojas de N tabacum en diversas etapas de desarrollo se cortaron en trozos de 1 cm2 y se sumergieron en una suspensión de células agrobacterianas (aprox. 104 -105
células/ml). Después de 3-10 min., se lavaron los segmentos de hoja en agua estéril, para sacar células
bacterianas en exceso y ası́ aminorar problemas de excesivo desarrollo bacteriano sobre los segmentos de
hoja tratados. Tras un secado breve (de 30-60 seg.), los segmentos de hoja tratados se colocaron sobre la
superficie de un medio de Cultivo de Tejidos Vegetales (PTCM) sin antibióticos, para promover infección
de tejido y traspaso de ADN desde las bacterias al tejido vegetal. El PTCM contiene, por litro: 4,31 g
de la Basal Salt Mixture de Murashige y Skoog (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri); 2,5 mg de
bencilamino purina (disuelta en NaOH 1N), 10 ml de solución de 0,1 mg de Acido indolacético/ml; 30 g
de sacarosa; 2 ml de Gamborg’s Vitamin Solution (Sigma Chemical Co., St Louis, Miss.) y 8 g de agar.
El pH se ajustó entre 5,5 y 5,9 con NaOH. Al cabo de 2 dı́as, los segmentos de hoja se traspasaron a
PTCM que contenı́a, por litro, 300 mg de kanamicina y 500 µg de mefoxina (Merck, Rahway, N. Jersey).
La kanamicina es selectiva de tejido vegetal transformado, y la mefoxina es selectiva contra las células
agrobacterianas.
Es necesario minimizar la exposición del tejido explantado a células agrobacterianas durante el proceso de transformación, para limitar la posible inducción de la secuencia codificadora de parA1 mientras
se producen las células de planta transgénica, la cual causarı́a una respuesta de muerte de células. En
consecuencia, la técnica biobalı́stica para introducir genes suicidas de células que contienen ADN heterólogo bajo el control regulador del elemento regulador de transcripción inducible es una útil técnica
de transformación alternativa, porque no necesariamente supone el uso de enzimas digestoras de pared
de células agrobacterianas o fungales (que es necesario para generar protoplastos para electroporación)
tipos de enzima que conducen ambos a inducción de las secuencias codificadoras bajo el control de ese
elemento regulador.
Las plantas transgénicas se regeneraron esencialmente como lo describieron Horsch et al. en Science
227, 1985, págs. 1229-1231.
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Las plantas transgénicas resultantes se probaron en cuanto a expresión del gen informante de glucuronidasabeta (GUS), usando el ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucurónico como lo describieron
Jefferson et al. en EMBO Journal 6, 1987, págs. 3901-3907, en condiciones de control (sin tratar) y
en condiciones inductoras. Una condición inductora es la aplicación intercelular de celulasa de T. viride
a tejido de tabaco en las plantas transgénicas, usando un pipeteador mecánico para aplicar 50-100 µl o
10-100 nM de proteı́na (criptogeı́na, por ejemplo) que induce composición a tejido intersticial; los testigos
recibieron aplicación simulada, pero no se trataron con el elicitor de celulasa. En algunos experimentos,
se hirió el tejido de tabaco con un escalpelo, para facilitar su exposición a los compuestos.
Ejemplo 8
Análisis de Supresión de Promotor y de Región asociada a Promotor
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En reacciones separadas, con la secuencia de ADN derivada de EAS4 enmarcada por -567 a +67
respecto del lugar de inicio de transcripción (nucleótidos 6-642, SEQ ID NO: 2, EAS4) se reemplazó el
promotor 35S de Virus del Mosaico de la Coliflor, CaMV (Benfey et al., EMBO Journal 9, 1990, págs.
1677-1684), en el vector pB1221 informante de GUS (Clontech., Palo Alto, Cal.) luego, después de la
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endonucleasa de restricción, se aislaron mutantes de supresión en las regiones traseras de EAS4. El
análisis de las estructuras de promotor gEAS-GUS se llevó a cabo en protoplastos de células de tabaco
electroporadas (Figura 1) y en linajes de tabaco transformados de modo permanente (Figura 2A, Tabla
1). Datos preliminares para la expresión transitoria demostraron que la SEQ ID NO: 1 no funcionaba
para inducibilidad de elicitor, y que la SEQ ID NO: 2 funcionaba regulando la expresión de genes.
Los datos de expresión transitoria obtenidos con los protoplastos de N. tabacum en los cuales se introdujeron diversas estructuras de promotor EAS3 y EAS4-GUS se indican en la Figura 1. Supresiones
progresivas desde el extremo 5’ de las regiones de promotor EAS4 reducen los niveles de expresión, pero
la inducibilidad se mantiene para las estructuras -262, -202 y -110 (referidas al punto de inicio de transcripción, nucleótido 573 de la SEQ ID NO: 2). Estos datos indicaron que a través de una u otra estructura
de región promotora EAS3 se expresan solamente niveles muy bajos de GUS. Asimismo, el promotor 35S
de CaMV solo no es inducido por el tratamiento con elicitor.
Los datos en las Figuras 2A y 2B indican que la supresión de material genético entre -567 y -160
reduce el nivel de expresión de gen hacia adelante pero no elimina la inducibilidad de la expresión. Por
consiguiente, las secuencias de ADN entre -567 y -160 parecen contener actividad incrementadora de
transcripción. La mayor parte de la actividad incrementadora de transcripción parece quedar entre -567
y -212, pero un incremento adicional parece ser mediado por información de secuencia entre -212 y -160
respecto del lugar de inicio de transcripción, lugar que es el nucleótido 573 (-568 es el nucleótido 1, -212
es el nucleótido 361 y -160 es el nucleótido 413, todos en la SEQ ID NO: 2).
En los datos de ensayo de Ganancia de Función, Figura 2B, la información de secuencia de ADN
necesaria para mediar inducción en respuesta a tratamiento con elicitor está situada entre -160 y -87
respecto del lugar de inicio de transcripción de EAS4 (o sea, entre los nucleótidos 413 y 486 de la SEQ ID
NO: 2). En estos experimentos, las secuencias derivadas de EAS se colocaron frente a un promotor 35S
de CaMV truncado (Benfey et al., EMBO J. 9, 1990, pags. 1677-1684). Esta figura también demuestra
que la región reguladora de transcripción derivada de EAS4 opera cuando está fusionada a un promotor
mı́nimo heterólogo.
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En un análisis más extensivo de transformantes independientes, se insertaron a la región trasera -567
a +67 de EAS4 entera o superiores de la misma en 5’ atrás del gen informante de GUS (glucuronidasabeta), en vector pBI101 (Clontech., Palo alto, Cal.), y se ensayaron niveles de expresión del informante
de GUS en condiciones inductoras y no-inductoras. Bastaron 160 pares de bases atrás del lugar de inicio
de transcripción de EAS4 para dirigir la expresión regulada del gen informante de GUS, pero la presencia
de secuencias traseras adicionales medio expresión aumentada. Estructuras que contenı́an un mı́nimo de
167 pares de bases atrás del lugar de inicio de transcripción de EAS4 dieron expresión transitoria de gen
en protoplastos electroporados, y confieren inducibilidad por elicitor de la expresión de gen informante de
GUS (un mı́nimo de aumento de la expresión del gen X2,5). En cambio, la región trasera de EAS3 (SEQ
ID NO: 1) no parece favorecer altos niveles de expresión del gen informante en el sistema de expresión
transitoria, ni parece conferir inducibilidad por elicitor al gen informante hacia adelante.
En parte, se esperaba la expresión de gen informante de GUS inducible por elicitor en el sistema con
protoplastos, porque esos protoplastos se generaron usando enzimas digestoras de pared celular fungal,
y se ha demostrado que esas enzimas elicitan producción de fitoalexina y expresión de gen ciclasa de
sesquiterpeno en plantas (Chappell et al., Plant. Physiology 97, 1991, págs. 693698). Una explicación
posible de por qué responden los protoplastos a tratamiento con un segundo elicitor es que se permite a
las células recuperarse por 6-8 horas, antes del segundo tratamiento. Esta fase de recuperación permite
a las células volver a un estado sensible a elicitor.
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El pBI101 es comercialmente obtenible de Clontech (Palo Alto, Cal.). Contiene el promotor 35S de
CaMV atrás del gen informante de GUS, en un vector pUC19; sirve, pues, como vector para experimentos
de expresión transitoria en los cuales se introduce el vector recombinante en protoplastos vegetales. La
presencia de este plásmido y sus derivados se selecciona por desarrollo sobre kanamicina. Asimismo, un
casete de GUS falto de promotor en el plásmido binario de Agrobacterium, vector pBIN19 (M. Bevan,
Nucl. Acids Res. 12, 1984, pág. 8711), porta una kanamicina expresable en plantas determinante de
resistencia.
Ejemplo 9
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Identificación de Elementos regulador de Transcripción inducible
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Los dominios lindantes con el 5’ clonas de EAS3 y EAS4 genómicas se proyectaron mediante experimentos de protección con nucleasa S1 y de extensión de iniciador (Sambrook et al., supra, 1989).
Subclonas que comprendı́an hasta 1 kb desde 5’ al lugar de inicio de traducción se secuenciaron y se
fusionaron al gen informante de glucuronidasa-beta (GUS) en pBI101, para estudios en tejido de plantas
transgénicas. Los plásmidos recombinantes resultantes se introdujeron en seguida por electroporación en
protoplastos de tabaco. Se midió la actividad de GUS en ensayos de expresión transitoria, y además se
aislaron linajes de células de tabaco transformado de modo permanente, para estudios de inducción y
expresión de GUS.
Se prepararon estructuras que contenı́an un mı́nimo aproximado de 200 pares de bases de secuencia
de nucleótidos atrás del lugar de inicio de transcripción de EAS4 en el vector pBI101 modificado, y se
hizo un gen informante de glucuronidasa-beta (GUS) que se analizó en cuanto a capacidad de inducir
expresión de GUS regulada. 200 pares de bases de secuencia lindante resultaron suficientes para inducir expresión de gen transitoria en protoplastos electroporados y confieren inducibilidad de elicitor a la
expresión de GUS (inducción min. 2,5 veces mayor). Experimentos similares con la secuencia lindante
EAS3 indicaron que 200 pares de bases desde la unidad EAS3 no apoyaban altos niveles de expresión de
GUS ni sensibilidad al elicitor, en células de planta transformada. Celulasa y elicitinas provenientes de
Phytophthora (Ricci et al., Eur. J Biochem 183, 1989, págs. 555-563) sirven para inducir expresión de
genes mediada por las secuencias reguladoras derivadas de EAS4.
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Otros estudios más, relacionados con la identificación de secuencias importantes para mediar expresión
de genes en respuesta a invasión por patógenos, diseñados usando celulasa o elicitinas, se llevaron a cabo
después de mutagénesis de oligonucleótidos dirigida por lugar. (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82, 1985, págs. 488-492) de la región supuestamente reguladora de EAS4. El reemplazo de CA de tipo
silvestre por GT en -233 y -234 respecto del lugar de inicio de transcripción de EAS4 (nucleótidos 334 y
335 de la SEQ ID NO: 2) no pareció alterar la expresión del gen informante de GUS medida después de
incubación por 20 horas en presencia de elicitor (celulasa).
Estudio preliminares de interferencia de la metilación y de retardación de gel, llevados a cabe esencialmente como los describieron Sambrook et al., supra (1989), indicaron que una secuencia octamérica
centrada alrededor del -233 referido al lugar de inicio de traducción (centrada en el 334 de la SEQ ID
NO: 2) liga proteı́nas provenientes de núcleos de células vegetales. Datos de interferencia de la metilación
sugirieron que el G en la posición -233 era de preferencia protegido contra metilación por dimetilsulfato
(DMS), si primero se dejaba interactuar con extractos nucleares. Los resultados de estudios de retardación de gen fueron compatibles con los obtenidos en los experimentos de protección contra metilación.
Cuando fragmentos de ADN que contenı́an la region desde -343 a -140 respecto del lugar de inicio de
traducción (nucleótido 230-433 de la SEQ ID NO: 2) se examinaron después de reacción a extractos
nucleares, apareció retardada la mobilidad en electroforesis de gel de acrilamida natural. La ligación de
proteı́na fue anulada por el cambio de GT a CA en la posiciones -234 y -233. Resultados similares se
observaron en extractos celulares testigos e inducidos por elicitor, y esta mutación de 2 pares de bases
no varió la expresión de gen informante. Por eso, se concluye que la región centrada en -233 no está
directamente involucrada en la inducción de expresión del gen en respuesta a invasión por patógenos o a
tratamiento con elicitor.
Experimentos preliminares indican que las secuencias de ADN de EAS4 entre -253 y -48 respecto
del lugar de inicio de transcripción (entre los nucleótidos 320 y 525 de la SEQ ID NO:2) tiene efectos
cualitativos y cuantitativos sobre la expresión del gen informante hacia adelante. Las secuencias entre
-110 y -1 de EAS4 respecto del lugar de inicio de la transcripción de EAS4 (nucleótidos 463-572 de la
SEQ ID NO: 2) medianı́a respuesta inducible, mientras que las secuencias entre -202 y -110 referidos al
lugar de inicio de la transcripción de EAS4 (nucleótidos 371-463 de la SEQ ID NO: 2) elevan los niveles
de la expresión de gen informante tanto inducida como no-inducida.
Ejemplo 10
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Formación de un Promotor EAS4 quimérico (- 1148 a +68):Gen informante de GUS
En otra serie de experimentos, examinamos la activación del promotor EAS4 (-1148 a +67) en plantas de tabaco transgénicas. Para obtener la secuencia lindante con 5’ del promotor gen EAS4 de tabaco
(-1148 a +67), se aisló de la clona genómica gEAS4 ya descrita un fragmento HindIII-HindIII de aprox.
1,9 kb que contenı́a una porción de la secuencia 5’ de EAS4. Luego el fragmento aislado se clonó en el polienlazador vector plásmido pBluescript KS (+) (Stratagene). Aplicando metodologı́a de PCR estándar,
se usó el plásmido pKS (+) resultante, que contenı́a el fragmento HindIII-HindIII, como plantilla de
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ADN para generar un subfragmento de promotor EAS4 con aprox. 1,2 kb (-1148 a +67) que tenı́a secuencias de 1148 pares de bases atrás y de 67 pares de bases adelante del lugar de inicio de transcripción
de EAS4. La secuencia de nucleótidos de este fragmento se muestra en la Figura 3A. El fragmento de
HindIII-BamHI con 1215 pares de bases que contenı́a el promotor EAS4 (-1148 a +67) se ligó en seguida,
en marco de lectura correcta, con la región codificadora de GUS en el vector binario pBI101.1. La Figura
3B ilustra esquemáticamente la estructura de fusión de genes resultante promotor EAS4 (-1148 a +67):
gen informante de GUS.
Ejemplo 11
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Expresión, inducible por Elicitor y Patógeno, de un Promotor EAS4 quimérico (-1148 a +67):Gen GUS,
en Tabaco transgénico
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Para evaluar la función del promotor EAS4 de tabaco (-1148 a +67), se monitoreó como sigue la
expresión de gen de la estructura informante de GUS mostrada en la Figura 3B, en plantas de tabaco
transgénico tratadas con un elicitor o un patógeno.
El promotor EAS4 (-1148 a +67) :gen informante de GUS mostrado en la Figura 3B se traspasó
a la cepa GV3850 de Agrobacterium tumefaciens inhabilitada, usando el procedimiento de copulación
triparental descrito por Schardl et al. (Gene 61, 1987, págs. 1-11). Luego plantas de tabaco Nicotiana
tabacum cv. Xanthi) se transformaron con el Agrobacterium inhabilitado que alojaba la estructura informante, aplicando el método de transformación de discos de hoja descrito por Horsch et al. (Science 227,
1985, págs. 1229-1231). Como plantas testigos, también se regeneraron linajes de tabaco transgénico que
expresaban el gen informante de GUS bajo control del promotor 35S de virus del mosaico de la colifor
(CaMV). Semillas de plantas de tabaco transgénico regeneradas se hicieron germinar sobre un medio
que contenı́a 100 µg de kanamicina/litro. En seguida, las plantas resistentes a kanamicinaresultantes
se traspasaron a tierra y se cultivaron en un invernadero. Estas plantas se probaron luego en cuanto a
expresión del gen informante de GUS, en el ensayo ya descrito, usando condiciones de control (con agua)
y condiciones inductoras (tratamiento con elicitor y con patógeno).
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Para determinar la inducibilidad por elicitor de la expresión del gen GUS inducida por el promotor
EAS4 (1148 a +67), se monitoreó la actividad de GUS en las hojas de plantas de tabaco transgénico
tratadas con el elicitor fungal proteı́na criptogeı́na o con agua, como sigue. La mitad de una hoja totalmente extendida (8a
¯ hoja a contar del pie de la planta), sacada de una planta de tabaco transgénico de
2 meses, se infiltró desde el lado abaxial usando una pipeta con aprox. 50 µl de 25 nM de criptogeı́na
(preparada según el método de Ricci et al., Eur. J. Bioch 183, 1989, págs. 555-563); la otra mitad de la
hoja se infiltró de igual manera con aprox. 50 µl de agua. A diversas horas después de la infiltracil, se
colectaron de plantas intactas las zonas de la hoja infiltradas con criptogeı́na y con agua, y se analizaron
en cuanto a actividad de GUS.
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Como se muestra en la Figura 4A, hojas de tres distintos linajes de tabaco transgénico que se habı́an
infiltrado con 25nM de criptogeı́na revelaron que se habı́a inducido expresión del gen de GUS o= 4 horas
después del tratamiento con elicitor. En cambio, el tratamiento con elicitor no indujo (datos no indicados) el promotor 35S de CaMV:gen informante de GUS. Además, el tratamiento con agua (Figura 4A)
no indujo actividad de GUS en hojas de plantas transgénicas que contenı́an el promotor EAS4(-1148 a
+67) :gen informante de GUS. En el nivel microscópico, la actividad de GUS resultó estar restringida a
exclusivamente áreas del tejido de hojas provocadas con elicitor, indicando que el promotor EAS4(-1148
a +67) no era inducido por una señal secundaria (Figura 8A).
Para caracterizar la especificidad por órgano de la expresión de gen GUS inducida por el promotor
EAS4 (-1148 a +67), se trataron raı́ces y tallos de plantas de tabaco transgénico con elicitor criptogeı́na,
y se analizaron en cuanto a actividad de GUS como sigue. Las raı́ces se obtuvieron de plantas de tabaco transgénico y se mantuvieron sobre medio de Murashige y Skoog estéril, hasta que se probaran.
Los tallos (sacados de 1-1 21 pulg. abajo del ápice) se obtuvieron de plantas de tabaco transgénico de 2
meses cultivadas en invernadero. Antes del tratamiento con elicitor, las raı́ces y los tallos se cortaron
en segmentos de aprox. 15-30 µM. Las raı́ces y los tallos segmentados se incubaron en seguida sobre
papel-filtro humedecido con 100 nM de criptogeı́na o agua, durante 18 horas a temperatura ambiente.
Posteriormente, se analizó la actividad de GUS en segmentos de raı́z y tallo usando el ensayo ya descrito.
La Figura 4B muestra que la actividad de GUS fue inducida tanto en la raı́ces como en los tallos
de dos linajes de tabaco transgénico distintos, después de 18 horas de tratamiento con criptogeı́na. Se
observó un aumento X15 de la actividad de GUS en los tallos y raı́ces, respecto de las muestras tratadas
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con agua (muestras testigos). Las raı́ces exhibieron mayor actividad de GUS que los tallos. Estos resultados indican que el promotor EAS4 (-1148 a +67) es inducible en tejido de raı́ces y tallos en respuesta
a tratamiento con elicitor.
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Para determinar si patógenos fungales inducı́an el promotor EAS4 (-1148 a +67): gen informante de
GUS, se analizó como sigue la actividad de GUS en las hojas de tabaco transgénico tratadas con dos
subespecies diferentes de Phytophthora parasitica var. Nicotianae. Hojas apicales nuevas se desprendieron de plantas de tabaco transgénico de aprox. 45 dı́as y se inocularon con un relleno de micelio (de
1 cm de diámetro) de cultivos de subespecie 0 o subsespecie 1, de 2 dı́as, de Phytophthora parasitica
var. Nicotianae desarrolladas sobre agar de harina de avena como lo describieron Tedford et al. (Plant
Disease 74, 1990, págs. 313-316). Luego las hojas inoculadas se incubaron 24 horas sobre papel-filtro
humedecido con agua destilada, en una cámara para desarrollo a 25◦ C con luz fluorescente constante.
Las hojas testigos se inocularon con rellenos de agar de harina de avena inactivo. En seguida, los tejidos
inoculados se recogieron y se analizaron en cuanto a actividad de GUS según ya se describió.
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Como se muestra en la Figura 5, se indujo actividad de GUS en las hojas de tabaco transgénico
cuando se trataron con la subespecie 0 o la subespecie 1 de Phytophthora parasitica var. Nicotianae.
Aunque la subespecie 0 y la subespecie 1 de Phytophthora parasitica var. Nicotianae tı́picamente inducen
sı́ntomas morbosos distintos, no se observó diferencia significativa entre los sı́ntomas morbosos causados
por estas dos subespecies en las hojas transgénicas de N. tabacum cv. Xanthi. Además, observamos que la
subespecie 0 y la subespecie 1 de P. parasitica indujeron igualmente bien la expresión de gen informante
de GUS.
Para determinar si inducı́an la expresión del gen GUS patógenos bacterianos o elicitores, se analizó
como sigue la actividad de GUS en las hojas de tabaco transgénico tratadas con Pseudomonas syrigae
pv. Syringae 61 y su mutante hrpH y con el elicitor harpina Erwinia amylovora. Se desprendieron hojas
epicales nuevas de una planta de tabaco transgénico de aprox. 45 dı́as y, usando una pipeta conforme
a los métodos ya descritos, se infiltraron esas hojas con una suspensión de células (A600 = 0,05) de
Pseudomonas syringae pv. Syringae 61 o su mutante hrpH, o con elicitor harpina (50 g/ml), usando una
pipeta por los métodos ya descritos. Hojas testigos se infiltraron con agua. Al cabo de aprox. 12 horas,
se colectó tejido que se analizó en cuanto a actividad de GUS como ya se describió.
Como se muestra en la Figura 6, la actividad de GUS se indujo en las hojas de tabaco transgénico
después de 12 horas, cuando se trataron con Pseudomonas mutante hrpH o elicitor harpina. En cambio,
se detectó poca actividad de GUS en hojas transgénicas tratadas con agua. Además, unas 12-15 horas
después del tratamiento se observó desarrollarse una respuesta hipersensible dentro de las zonas de tejido
infiltradas con P. syringae pv. Syringae 61 o con proteı́na harpina purificada. Estos resultados indican
que el promotor EAS4 (-1148 a +67) se activa en respuesta a patógenos bacterianos o a un elicitor derivado de bacteria.
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Ejemplo 12
Análisis por manchado inmunológico
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La expresión de EAS en diferentes tejidos de plantas transgénicas en respuesta a tratamiento con
criptogeı́na se analizó por métodos de sombreado lateral estándar, como sigue. Se extrajeron proteı́nas
de tejidos de tabaco testigos y tratados con elicitor criptogeı́na, por homogeneización con 80 mM de
tampón fosfato de potasio (pH 7,0) que contenı́a 20 % (p/v) de glicerol, 10 mM de metabisulfito de sodio,
10 mM de ascorbato de sodio, 15 mM de MgCl2 y 5mM de mercaptoetanol-beta, según lo descrito por
Vogeli y Chappell, supra.
Como se muestra en las Figuras 7A-B, no se detectó proteı́na de EAS en las hojas de plantas de
tabaco, en experimentos con sombreado lateral. En cambio, se indujo proteı́na de EAS en las hojas
de plantas transgénicas después de tratamiento con elicitor. En tallos y raı́ces segmentados, se detectó
proteı́na de EAS en ausencia de tratamiento con elicitor, indicando que uno o más miembrosde la familia
multigénica EAS - pero no el EAS4 determinadopor los datos de localización histoquı́mica ya descritos
se activan al lesionarlos.
Ejemplo 13
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Patrón de Expresión especı́fica para Célula del Promotor EAS4 (-1148 a +67): Gen informante de GUS,
en Tabaco transgénico
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Las Figuras 8A-K muestran los resultados obtenidos cuando tejidos de distintos linajes transgénicos
de tabaco se tiñeron para observar actividad de GUS después de tratamiento con elicitinas. Los datos
expuestos en las Figuras 8A-K son representativos de una serie de observaciones hechas en diferentes
momentos con varios linajes de tabaco transgénico que expresaban el promotor EAS4 (-1148 a +67):gen
informante de GUS mostrado en la Figura 3B. La actividad de GUS se ubicó en tejidos transgénicos
tiñendo cortes con solución de 1mM X-gluc(5-bromo-4-cloro-3 –indolil-β-glucurónido) que contenı́a 50
mM de NaPO4 pH 7, 0, 05 % de Triton X-100 y 0,1 % de mercaptoetanol-beta durante 12 horas a 37◦C, y
luego se fijó en 50 % de etanol, 5 % de ácido acético glacial y 10 % de formaldehı́do, por 2 horas. De tejidos
apropiados se sacó clorofila, incubando los cortes en 70 % de etanol. Los cortes de tejido vegetal teñidos
se observaron con un microscopio Zeiss IIIRS, y se fotografiaron usando una cámara fotomicrográfica
MC63.
Como se muestra en las Figuras 8B-F, la actividad de GUS se presentó en zonas de hojas transgénicas
infiltradas con elicitor, indicando que el promotor EAS4 (-1148 a +67) se activaba, en respuesta a infiltración de criptogeı́na o parasiceı́na, en todo el tejido vegetal menos en las capas de células epidérmicas,
donde se observó actividad mı́nima de GUS. Un patrón de tinción igualmente débil se observó en células
epidérmicas de raı́z y tallo (Figuras 8G y 8L). Mientras se halló actividad mı́nima de GUS en las células
epidérmicas de hojas transgénicas, se observó actividad de GUS en tricomas tanto de hoja como de raı́z
de plantas transgénicas (Figuras 8B y 8L).
Además, como se muestra en las Figuras 8C-F y 8L, se observó actividad de GUS inducible por elicitor
en cierta capa subepidérmica, en cortes de tallo y de raı́z. La Figura 8F indica que la actividad de GUS
en el tejido de tallo también se presentó en las capas de tejido del cambio, el floema y el xilema primario;
actividad mı́nima de GUS se observó en regiones corticales del tallo. Además, como en el tejido de tallo,
se ubicó actividad de GUS en el sistema vascular de las raı́ces (Figura 8L).
No se observó ninguna actividad de GUS en pétalos de flores, incluso en tejido pigmentado y nopigmentado, ni antes ni después de tratamiento con criptogeı́na.
30
Ejemplo 14
Análisis de Supresión de 5’ del Promotor EAS4 (-1148 a +67), en Plantas de Tabaco transgénicas
35
En otra serie de experimentos, se generaron varias estructuras del promotor EAS4 con supresión de
5’ (-1147 a +67), usando metodologı́a de PCR estándar. Estas formas del promotor con supresión se
fusionaron en seguida al gen informante de GUS, en uno y otro de los vectores pBI101 y pB1221, y luego
se transformaron en tabaco como se describió antes.
TABLA 1
40
supresiones
de 5’
Actividad de GUS
MU/mq de proteı́na/min
Factor de
Inducción
N◦ de linajes
transgénicos
distintos probados
Control
(infiltr.
con agua)
Tratado con
elicitor
-1148
173
1889
10,9
11
-567
120
921
7,7
12
-212
23
187
8,1
11
-160
2
34
17,0
9
-115
3
3
1
12
-63
0
0
0
13
45
50
55
60
Como se muestra en la Tabla 1, la supresión en el promotor EAS desde -1148 hasta -567 disminuyó
23
ES 2 134 170 A1
5
10
15
la actividad de GUS inducible a un 50 % del nivel de la encontrada en plantas con promotor EAS4 de
longitud total (-1148 a +67). Una nueva supresión del promotor hasta -212 redujo la actividad de GUS
inducible en un promedio de 90 %, y la supresión hasta -160 disminuyó la actividad de GUS al 2 % de
la exhibida por plantas que tenı́an un promotor EAS4 de longitud total (-1148 a +67). La supresión
hasta -63 (un promotor que todavı́a contiene conjuntos CAAT y TATA putativos) anuló por completo
la expresion del gen quimérico en hojas testigos y hojas tratadas con elicitor. Estos datos indicaron que
múltiples elementos reguladores positivos que controlan los niveles cuantitativos de expresión de EAS4
en el tabaco están contenidos dentro de la región -1148 a -160.
Una comparación entre los resultados obtenidos suprimiendo hasta -567 y hasta -212 también indicó
que la- secuencia contenida dentro de -567 a -212 influı́a en los niveles de expresión, porque la supresión
desde -567 hasta -212 redundó en niveles de expresión 4 veces menores, con pérdida de grandes cantidades de actividad de GUS. Aunque una supresión hasta -160 restó mucha actividad de GUS inducible, la
secuencia adelante de -160 resultó bastar para dirigir expresión de gen inducible en tejido de hojas. Como
se muestra en la Figura 9B, se observó una inducción 17 veces mayor en tejido de hojas tratadas con
elicitor. Estos datos demostraron que entre -160 y -115 está situado un elemento cualitativo que controla
la inducibilidad de elicitor.
Ejemplo 15
20
Plantas transgénicas resistentes a Plagas
25
30
35
40
45
50
La secuencia codificadora de parA1 se aisló de la subespecie 0 de Phytophthora parasitica, como sigue: ADN genómico se aisló y se usó como plantilla en una PCR con un iniciador de
avance SIG (CGTTGGATCCCCACCTCATCCGAAATGAAC; SEQ ID NO: 9, lugar de BamHI subrayado); los nucleótidos 25-27 corresponden al lugar de inicio de traducción y al iniciador inverso GGCTGAGCTCCTGGACGFCAGAGATCAAACC; SEQ ID NO: 10; el lugar de SstI subrayado, para amplificar la, región codificadora de péptido lider. Para aislar un amplı́mero correspondiente a la secuencia que codifica la elicitina ParA1, se usaron el iniciador de avance MAT
(GCCGGATCCTTATGACTAGTTGCACCACCACGCAGCAAACTG, SEQ NO: 11; subrayados, el lugar de BamHI GGATCC y el lugar de SpeI ACTAGT; lugar de inicio de traducción, en los nucleótidos
12-14) y el iniciador inverso de antes (SEQ ID NO: 10), con ADN genómico como plantilla.
Para subclonar en pBluescript (Stratagene, La Jolla, Cal.) o en estructura pEAS4, se dirigió el ADN
de amplı́mero con BamHI y SstI. Cuando se usa la secuencia codificadora de la proteı́na madura, la estructura de elicitina/pEAS4 madura se puede digerir con SpeI para insertar una secuencia lı́der de planta
en el extremo 5’ del marco de lectura abierto. El vector de pEAS4-GUS se digiere con BamHI y SstI,
purificándose el fragmento de ADM grande después de electroforesis sobre gel de agarosa.
La Figura 9 ilustra las manipulaciones moleculares que conducen a la generación de plantas resistentes
a plagas. La secuencia codificadora de la elicitina ParA1 seaı́sla por PCR, para tener extremos BamHi y
SstI. El gEAS4600(ciclasa)-GUS-pBI101, que dirige la expresión del gen informante de GUS bajo el control regulador del promotor EAS, se digiere con BamHI y SstI para liberar el gen informante de GUS.
Luego el amplı́mero parA1 digerido con BamHI/SstI se liga al fragmento grande obtenido de la digestión
de gEAS4600(ciclasa)-GUS-pBI101, para producir gEAS4600(ciclasa)-parA1-pBI101, del cual se sintetiza la
elicitina ParA1, en seguida de inducción con un elicitor adecuado, después de haber transformado células
o tejido vegetales.
Para evaluar su resistencia a fitopatógenos, se regeneraron plantas de tabaco transgénica (Nicotiana
tabacum cv. KY160) que contenı́an el gen de elicitina madura parA1 (aminoácidos 21-118 de la SEQ
ID NO: 12) bajo control del promotor gEAS4600(ciclasa), usando la técnica de traspaso de genes mediado
por Agrobacterium ya descrita. En seguida, las plantas transgénicas resultantes se probaron en cuanto
resistencia a plagas contra la subespecie 0 o la subespecie 1 de aislados de Phytophthora parasitica var.
Nicotianae, usando el ensayo de hojas desprendidas estándar descrito por Tedford et al., supra.
55
60
Como se muestra en la Figura 10, varios linajes de tabaco transgénico independientes que contenı́an el
gen de elicitina madura parA1 bajo control del promotor gEAS4600(ciclasa) indicaron resistencia a ambas
subespecies, 0 y 1, de P. p. var. Nicotianae mayor que la de las plantas testigos (esto es, comparadas
con el N. tabacum cv. KY160 no-transformado o con el N. tabacum cv. KY160 transgénico que contenı́a
el promotor EAS4600(ciclasa): gen informante de GUS).
Aunque se han descrito en detalle diversas materializaciones de la presente invención, es evidente que
24
ES 2 134 170 A1
a los expertos en la técnica se les podrán ocurrir modificaciones, extensiones, adaptaciones y optimizaciones. Ha de entenderse expresamente que tales modificaciones, adaptaciones, etc. quedan dentro del
espı́ritu y alcance de la presente invención, expuestos en las Reivindicaciones.
5
(2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA ID N◦ 1
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
(A) LONGITUD: PARES DE EASES 512
10
(B) TIPO: ACIDO NUCLEICO
(C) CLASE DE CADENA: BIFILAR
15
(D) TOPOLOGIA: LINEAL
(ii) TIPO DE MOLECULA: ADN
(iii) HIPOTETICA: NO
20
(iv) INVERSA: NO
(vi) FUENTE DE ORIGEN
25
(A) ORGANISMO: NICOTIANA TABACUM
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA ID N◦ .1
30
35
40
45
(2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA ID N◦ 2
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
50
(A) LONGITUD: PARES DE BASE 642
(B) TIPO: ACIDO NUCLEICO
55
(C) CLASE DE CADENA: BIFILAR
(D) TOPOLOGIA: LINEAL
(ii) TIPO DE MOLECULA: ADN
60
(iii) HIPOTETICA: NO
(iv) INVERSA: NO
25
ES 2 134 170 A1
(vi) FUENTE DE ORIGEN
(A) ORGANISMO: NICOTIANA TABACUM
5
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA ID N◦ 2
10
15
20
25
30
(2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA ID N◦ 3
35
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
(A) LONGITUD: PARES DE BASE 21
40
(B) TIPO:ACIDO NUCLEICO
(C) CLASE DE CADENA: MONOFILAR
(D) TOPOLOGIA:LINEAL
45
(ii) TIPO DE MOLECULA: OTRO ACIDO NUCLEICO
(A) DESCRIPCION: DESC/ “OLIGONUCLEOTIDO PRIMER PARA PCR”
50
(iii) HIPOTETICA:NO
(iv) INVERSA:SI
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA ID. N◦ 3
55
ATGCTGTTAG CAACCGGAAG G
(2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA ID N◦ 4
60
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
(A) LONGITUD:PARES DE BASE 21
26
21
ES 2 134 170 A1
(B) TIPO: ACIDO NUCLEICO
(C) CLASE DE CADENA:MONOFILAR
5
(D) TOPOLOGIA:LINEAL
(ii) TIPO DE MOLECULA:OTRO ACIDO NUCLEICO
(A) DESCRIPCION: DESC/“OLIGONUCLEOTIDO PRIMER PARA PCR”
10
(iii) HIPOTETICA:NO
(iv) INVERSA:SI
15
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA ID N◦ 4
ATCCAAAATC
TCATCAATTT
C
21
(2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA ID N◦ 5
20
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
(A) LONGITUD: PARES DE BASE 18
25
(B) TIPO:ACIDO NUCLEICO
(C) CLASE DE CADENA:MONOFILAR
(D) TOPOLOGIA:LINEAL
30
(ii) TIPO DE MOLECULA:OTRO ACIDO NUCLEICO
(A) DESCRIPCION: DESC/“OLIGONUCLEOTIDO PRIMER PARA PCR”
35
(iii) HIPOTETICA:NO
(iv) INVERSA:SI
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA ID N◦ 5
40
ATGAGTCCTT ACATGTGA
18
(2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA ID N◦ 6
45
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
(A) LONGITUD: PARES DE BASE 45
(B) TIPO:ACIDO NUCLEICO
50
(C) CLASE DE CADENA:MONOFILAR
(D) TOPOLOGIA:LINEAL
55
(ii) TIPO DE MOLECULA:OTRO ACIDO NUCLEICO
(DESCRICION):DESC/“OLIGONUCLEOTIDO PRIMER PARA PCR”
(iii) HIPOTETICA:NO
60
(iv) INVERSA:SI
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA ID N◦ 6
27
ES 2 134 170 A1
GGGAGCTCGA ATTCCATGGC CTCAGCAGCA GCAGTTGCAA ACTAT 45
(2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA ID N◦ 7
5
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
(A) LONGITUD:PARES DE BASE 4253
(B) TIPO:ACIDO NUCLEICO
10
(C) CLASE DE CADENA:BIFILAR
(D) TOPOLOGIA:LINEAL
15
(ii) TIPO DE MOLECULA:ADH
(iii) HIPOTETICA:NO
(iv) INVERSA:NO
20
(vi) FUENTE DE ORIGEN
(A) ORGANISMO:NICOTIANA TABACUM
25
(ix) CARACTERISTICA:
A) NOMBRE/CLAVE:CDS
B) LOCALIDAD: 1216..1327
30
(ix) CARACTERISTICA:
A) NOMBRE/CLAVE:CDS
35
B) LOCALIDAD:1454..1718
(ix) CARACTERISTICA:
A) NOMBRE/CLAVE:CDS
40
B) LOCALIDAD:1805..2182
(ix) CARACTERISTICA:
45
A) NOMBRE/CLAVE:CDS
B) LOCALIDAD:2259..2477
(ix) CARACTERISTICA:
50
A) NOMBRE/CLAVE:CDS
B) LOCALIDAD:2609..2741
55
(ix) CARACTERISTICA:
A) NOMBRE/CLAVE:CDS
B) LOCALIDAD:2902..3148
60
28
ES 2 134 170 A1
(ix) CARACTERISTICA:
A) NOMBRE/CLAVE:CDS
5
B) LOCALIDAD:3261..3555
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA ID N◦ 7
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
29
ES 2 134 170 A1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
30
ES 2 134 170 A1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
31
ES 2 134 170 A1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
32
ES 2 134 170 A1
5
10
15
(2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA ID N◦ 8
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
20
(A) LONGITUD: AMINO ACIDO 550
(B) TIPO:AMINO ACIDO
25
(D) TOPOLOGIA: LINEAL
(ii) TIPO DE MOLECULA:PROTEINA
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA ID N◦ 8
30
35
40
45
50
55
60
33
ES 2 134 170 A1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
34
ES 2 134 170 A1
5
10
(2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA ID N◦ 9
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
(A) LONGITUD: PARES DE BASE 30
15
(B) TIPO:ACIDO NUCLEICO
(C) CLASE DE CADENA:MONOFILAR
20
(D) TOPOLOGIA:LINEAL
(ii) TIPO DE MOLECULA:OTRO ACIDO NUCLEICO
(A) DESCRIPCION:/DESC=“OLIGOMUCLEOTIDO PRIMER PARA PCR”
25
(iii) HIPOTETICA:NO
(iv) INVERSA:NO
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA ID N◦ 9
30
CGTTGGATCC CCACCTCATC
CGAAATGAAC
30
◦
(2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA ID N 10
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
35
(A) LONGITUD: PARES DE BASE 30
(B) TIPO:ACIDO NUCLEICO
(C) CLASE DE CADENA:MONOFILAR
40
(D) TOPOLOGIA:LINEAL
(ii) TIPO DE MOLECULA:OTRO ACIDO HUCLEICO
45
(A) DESCRIPCION:/DESC=“OLIGOMUCLEOTIDO PRIMER PARA PCR”
(iii) HIPOTETICA:NO
(iv) INVERSA:SI
50
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA ID N◦ 10
GGCTGAGCTC CTGGACGCAG AGATCAAACC
◦
(2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA ID N 11
55
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
(A) LONGITUD: PARES DE BASE 42
(B) TIPO:ACIDO NUCLEICO
60
(C) CLASE DE CADENA:MONOFILAR
(D) TOPOLOGIA:LINEAL
35
30
ES 2 134 170 A1
(ii) TIPO DE MOLECULA: OTRO ACIDO NUCLEICO
(A) DESCRIPCION:/DESC-“OLIGONUCLEOTIDO PRIMER PARA PCR”
5
(iii) HIPOTETICA:NO
(iv) INVERSA:SI
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA ID N◦ 11
10
GCCGGATCCT TATGACTAGT TGCACCACCA
CGCAGCAAAC TG
◦
(2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA ID N 12
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
15
(A) LONGITUD: PARES DE BASE 593
(B) TIPO: ACIDO NUCLEICO
20
(C) CLASE DE CADENA: BIFILIAR
(D) TOPOLOGIA: LINEAR
(ii) TIPO DE MOLECULA:ADN
25
(iii) HIPOTETICA:NO
(iv) INVERSA:NO
(vi) FUENTE DE ORIGEN
30
(A) ORGANISMO: PHYTOPNTHORA PARASITICA
(ix) CARACTERISTICA:
(A) NOMBRE/CLAVE:CDS
35
(B) LOCALIDAD:207..563
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA ID N◦ 12
40
45
50
55
60
36
42
ES 2 134 170 A1
5
10
15
(2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA ID N◦ 13
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
(A) LONGITUD: AMINO ACIDO 118
20
(B) TIPO:AMINO ACIDO
(D) TOPOLOGIA: LINEAL
25
(ii) TIPO DE MOLECULA: PROTEINA
(ix) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA ID N◦ 13
30
35
40
45
50
(2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA, ID N◦ 14
(i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
55
(A) LONGITUD: PARES DE BASE 1368
(B) TIPO:ACIDO NUCLEICO
60
(C) CLASE DE CADENA:AMBAS
(D) TOPOLOGIA:AMBAS
37
ES 2 134 170 A1
(ii) TIPO DE MOLECULA:ADi.c
(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA ID N◦ 14
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
38
ES 2 134 170 A1
REIVINDICACIONES
1. Una molécula de ácido nucleico recombinante, caracterizada por comprender un elemento regulador de resistencia de las plantas a plagas inducible.
5
10
2. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 1, caracterizada por haberse obtenido dicho
elemento regulador de un gen que codifica una ciclasa de terpeno.
3. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 2, caracterizada porque dicha ciclasa de terpeno es una ciclasa de sesquiterpeno.
4. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 3, caracterizada porque dicho elemento regulador dirige la expresión de una sintasa de epi-5-aristoloqueno (EAS).
15
20
5. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 4, caracterizada por comprender la secuencia
de nucleótidos mostrada en la Figura 3A (SEQ ID NO: 14), o un fragmento de la misma, con resistencia
a plagas vegetales inducible.
6. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 5, caracterizada por tener la secuencia de
nucleótidos mostrada en la Figura 3A (SEQ ID NO: 14).
7. La molécula de ácido-nucleico de la Reivindicación 5, caracterizada por comprender los nucleótidos 463-473 de la SEQ ID NO: 2.
25
8. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 5, caracterizada por comprender los nucleótidos 406-486 de la SEQ ID NO: 2.
9. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 5, caracterizada por comprender los nucleótidos 463-572 de la SEQ ID NO: 2.
30
35
10. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 5, caracterizada por comprender los nucleótidos 371-463 de la SEQ ID NO: 2.
11. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 5, caracterizada por comprender los nucleótidos 411-457 de la SEQ ID NO: 2.
12. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 1, caracterizada por haberse obtenido de
una dicotiledónea.
40
13. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 12, caracterizada por ser dicha dicotiledónea
un miembro de las Solanaceae.
14. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 13, caracterizada por ser dicha planta solanácea un miembro del género Nicotiana.
45
50
15. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 1, caracterizada por haberse obtenido de
una monocotiledónea.
16. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 1, caracterizada por haberse obtenido de
una gimnosperma.
17. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 1, caracterizada por haberse obtenido de
una conı́fera.
55
18. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 1, caracterizada porque es de ADN genómico.
19. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 1, caracterizada por ser de ADN sintetizado
quı́micamente.
60
20. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 1, caracterizada porque es una combinación
de ADN genómico y ADN sintetizado quı́micamente.
21. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 1, caracterizada por ser una combinación
39
ES 2 134 170 A1
de ADN genómico y ADNc, o bien una combinación de ADN genómico, ADNc, y ADN sintetizado
quı́micamente.
5
22. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 1, caracterizada porque dicha inducción es
mediada por un fitopatógeno.
23. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 22, caracterizada porque dicho fitopatógeno
es un hongo.
10
24. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 23, caracterizada por ser dicho patógeno
fungal un miembro del género Phytophthora.
25. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 22, caracterizada porque dicha inducción es
mediada por un patógeno bacteriano.
15
26. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 25, caracterizada por ser dicho patógeno
bacteriano un miembro del género Pseudomonas.
20
27. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 22, caracterizada porque dicha inducción es
mediada por un patógeno viral.
28. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 27, caracterizada por ser dicho patógeno
viral el virus del mosaico del tabaco.
25
29. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 1, caracterizada porque dicha inducción es
mediada por un elicitor.
30. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 29, caracterizada porque dicha inducción es
mediada por un elicitor fungal.
30
31. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 29, caracterizada porque dicha inducción es
mediada por un elicitor bacteriano.
35
32. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 1, caracterizada por estar funcionalmente
enlazada a secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido heterólogo.
33. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 32, caracterizada por ser dicho polipéptido
heterólogo capaz de conferir a una planta resistencia a plagas.
40
34. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 33, caracterizada porque dicho polipéptido
heterólogo es una elicitina.
35. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 33, caracterizada porque dicha elicitina es
una elicitina fungal.
45
36. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 35, caracterizada porque dicha elicitina
fungal proviene de Phytophthora.
50
37. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 36, caracterizada por comprender dicha
elicitina un polipéptido de ParA1.
38. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 33, caracterizada por ser dicha elicitina una
elicitina bacteriana.
55
39. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 38, caracterizada porque ser dicha elicitina
bacteriana la heparina.
40. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 32, caracterizada porque dicha inducción es
mediada por un agente externo o más de uno.
60
41. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 32, caracterizada por ser capaz de expresar
dicho polipéptido heterólogo de manera especı́fica para una célula.
40
ES 2 134 170 A1
42. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 32, caracterizada por ser dicho polipéptido
heterólogo una proteı́na farmacéutica.
43. Un vector, caracterizado por comprender el ADN de la Reivindicación 1.
5
44. El vector de la Reivindicación 43, caracterizado por ser capaz de regular de modo inducible la
expresión de una secuencia de nucleótidos en una célula que lo contiene.
10
45. El vector de la Reivindicación 44, caracterizado porque dicha secuencia de nucleótidos codifica
un polipéptido heterólogo.
46. Una planta transgénica, caracterizada por contener, integrada a su genoma, una molécula de
ácido nucleico de la Reivindicación 1.
15
47. Una planta transgénica, caracterizada por contener, integrada a su genoma, una molécula de
ácido nucleico de la Reivindicación 32.
48. Una semilla, caracterizada por provenir de una planta transgénica de la Reivindicación 46.
20
49. Una semilla, caracterizada por provenir de una planta transgénica de la Reivindicación 47.
50. Una célula, caracterizada por provenir de una planta transgénica de la Reivindicación 46.
51. Una célula, caracterizada por provenir de una planta transgénica de la Reivindicación 47.
25
52. Un método para impartir resistencia a plagas a una planta transgénica, que comprende los pasos
de:
30
(a) producir una célula de planta transgénica que comprende, integrada a su genoma, la molécula de
ácido nucleico de la Reivindicación 32; y
(b) cultivar dicha planta transgénica a partir de dicha célula vegetal,
35
caracterizado porque la expresión de la molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 32 confiere
a dicha planta transgénica resistencia a plagas.
53. La planta transgénica de la Reivindicación 52, caracterizada por ser una dicotiledónea.
40
54. La planta transgénica de la Reivindicación 53, caracterizada porque dicha dicotiledónea es un
miembro de las Solanaceae.
55. La planta transgénica de la Reivindicación 54, caracterizada porque dicha solanácea es miembro
del género Nicotiana.
45
56. La planta transgénica de la Reivindicación 52, caracterizada por ser una monocotiledónea.
57. La planta transgénica de la Reivindicación 52, caracterizada por ser una gimnosperma.
50
58. La planta transgénica de la Reivindicación 52, caracterizada por ser una conı́fera.
59. Un método para aumentar la expresión por transcripción de una secuencia de ADN en la dirección
de avance en una célula de planta transgénica, caracterizado por comprender los pasos de:
55
(a) producir una célula de planta transgénica que comprende, integrada a su genoma, la molécula de
ácido nucleico de la Reivindicación 1 posicionada para aumentar la transcripción de una secuencia de
ADN directa; y
(b) cultivar dicha planta transgénica a partir de dicha célula vegetal.
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kES 2 134 170
kN. solicitud: 9750002
kFecha de presentación de la solicitud: 17.01.97
kFecha de prioridad: 18.05.95
OFICINA ESPAÑOLA
DE PATENTES Y MARCAS
11
ESPAÑA
22
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◦
32
INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA
k
51 Int. Cl.6 :
C12N 5/14, 15/11, 15/29, 15/82, A01H 4/00
DOCUMENTOS RELEVANTES
Categorı́a
Documentos citados
Reivindicaciones
afectadas
Y
EP 0392225 A2 (CIBA-GEIGY AG) 17.10.1990, ejemplos 24,38-40.
1-59
Y
EP 0332104 A2 (CIBA-GEIGY AG) 13.09.1989, todo el documento.
1-59
Y
KAMOUN et al. ”A gene encoding a Host-Specific elicitor protein
of Phytophthora parasitica”. 1993. Molecular Plant-Microbe
interactions. Vol. 6 (5). Páginas 573-581.
1-59
Y
BONNET et al. ”Diversity in pathogenicity to tobacco and in
elicitin production among isolates of Phytophthora parasitica.
1994. J. Phytopathology. Vol. 141. Páginas 25-37.
1-59
X
WEHNER et al. ”Molecular structure and genetic regulation of SFA,
a gene responsible for resistance to formaldehyde in
saccharomyces cerevisiae, and characterization of its protein
product. 1993. Mol. Gen. Genet. Vol. 237. Páginas 351-358.
5,7
Y
COLBY et al. ”4S-Limonene synthase from the oil glands of
spearmint (Mentha spicata). 1993. The journal of biological
chemistry. Vol. 268 (31). Páginas 23016-23024.
1-59
Y
BACK et al. ”Expression of a plant sesquiterpene cyclase gene in
Escherichia coli”. 1994. Archives of Biochemistry and Biophysics.
Vol. 315 (2). Páginas 527-532.
1-59
Categorı́a de los documentos citados
X: de particular relevancia
O: referido a divulgación no escrita
Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la
P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación
misma categorı́a
A: refleja el estado de la técnica
de la solicitud
E: documento anterior, pero publicado después de la fecha
de presentación de la solicitud
El presente informe ha sido realizado
× para todas las reivindicaciones
Fecha de realización del informe
19.07.99
para las reivindicaciones n◦ :
Examinador
A. Collados Martı́n Posadillo
Página
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kN. solicitud: 9750002
kFecha de presentación de la solicitud: 17.01.97
kFecha de prioridad: 18.05.95
OFICINA ESPAÑOLA
DE PATENTES Y MARCAS
11
ESPAÑA
22
21
◦
32
INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA
k
51 Int. Cl.6 :
C12N 5/14, 15/11, 15/29, 15/82, A01H 4/00
DOCUMENTOS RELEVANTES
Categorı́a
Documentos citados
Reivindicaciones
afectadas
Y
FACCHINI et al. ”Gene family for an elicitor-induced
sesquiterpene cyclase in tobacco”. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. Vol. 89. Páginas 11088-11092.
1-59
Y
HOHN et al. ”Expression of a fungal sesquiterpene cyclase gene in
transgenic tobacco”. 1991. Plant Physiol. Vol. 97.
Páginas 460-462.
1-59
Categorı́a de los documentos citados
X: de particular relevancia
O: referido a divulgación no escrita
Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la
P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación
misma categorı́a
A: refleja el estado de la técnica
de la solicitud
E: documento anterior, pero publicado después de la fecha
de presentación de la solicitud
El presente informe ha sido realizado
× para todas las reivindicaciones
Fecha de realización del informe
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Examinador
A. Collados Martı́n Posadillo
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