¿Cuál de estas 3 posibilidades de replicación es la que ocurre? Marcaje del DNA bacteriano con N15 Experimento de Meselson-Stahl (1958) 1. Bacteria crecida en N14 2. Bacteria crecida en N15 3. Incubación en presencia de N14 4. Centrifugación de generaciones sucesivas CONCLUSIÓN: La Replicación es semi-conservativa Reacción básica de la replicación de ADN ADN polimerasa (ADN)n+1 + PPi ADNn + dNTP Mg2+ dNTP ADNn molde PPi (ADN)n+1 • Las ADN polimerasas añaden dNTPs complementarios al molde de la cadena madre • Se necesita un 3’OH libre para que las ADN polimerasas actúen • Las ADN polimerasas requieren Mg2+ como cofactor Se produce un ataque nucleofílico del 3’OH al fosfato del dNTP entrante La síntesis de ADN ocurre en sentido 5’ 3’ Acorde a la estructura del ADN y la función de las ADN polimerasas: • Cada cadena de ADN original sirve de molde para una cadena nueva • Los precursores son desoxiribonucleósidos 5’ TRI-fosfato (dNTPs: dATP, dTTP, dGTP, dCTP) • Las cadenas de ADN originales se separan y se sintetiza la complementaria de cada una de manera simultánea •Se requiere la función de otras enzimas además de la ADN polimerasa durante la replicación ADN polimerasas ADN polimerasas de bacterias Exonucleasa Pulgar Palma Actividad de polimerasa 5’ 3’ Actividad de exonucleasa 3’ 5’ La fidelidad de la ADN polimerasa III es de 109 Origen de Replicación bacteriano OriC En bacteria hay un solo origen de replicación Secuencias repetidas en tandem (13 pb) Cajas DnaA (9 pb) 1. Activación por metilación de A en GATC 2. Unión de DnaA “abre el DNA” 3. Unión de DnaB y DnaC- actividad helicasa ATP dependiente 4. Unión de SSB para mantener separadas las cadenas de DNA DNA B (helicasa) Rompe los puentes de hidrógeno entre las bases La HELICASA es un hexámero que une a la cadena guía del ADN Proteínas de unión a cadena sencilla (SSB) mantienen las hebras separadas La unión de SSB es cooperativa y ayuda a la polimerasa facilitando su actividad Se producen cebadores de ARN para generar el 3’OH libre que la ADN polimerasa requiere DNA primasa RNA polimerasa que sintetiza los cebadores de RNA ¿ En qué sentido se replica el cromosoma bacteriano ? La REPLICACIÓN es BIDIRECCIONAL molde 3’ 5’ molde molde 5’ 3’ molde Hay DOS Horquillas de replicación en sentido opuesto Esquema de una horquilla de replicación Hebra “guía” contínua discontínua Fragmentos de Okazaki Hebra “retrasada” El crecimiento de ambas cadenas es en sentido 5’ 3’ En una horquilla de replicación, la DNA pol III es la que replica las dos hebras al mismo tiempo. La replicación de la hebra retrasada se interrumpe cada 1000 nt aproximadamente Subunidades de la ADN polimerasa III de E. coli Sub # por holoenzima Mr Función 2 132,000 Actividad polimerasa 2 27,000 Exonucleasa 3’5’ 2 10,000 Se requiere para la union de DnaB 2 71,000 1 52,000 1 35,000 ’ 1 33,000 1 15,000 1 12,000 4 37,000 Unión estable al molde, dimerización del núcleo Complejo que carga las subunidades al DNA Pinzas que forman una rueda (abrazadera) sobre el DNA y aseguran óptima procesividad Núcleo de la polimerasa Modelo del dímero La DNA pol III es altamente procesiva gracias a las subunidades que forman una abrazadera complejo proteínas Función en la horquilla de replicación Video Describe la función de cada una de las diferentes subunidades de la DNA pol III bacteriana Considerando la siguiente secuencia como parte de un cromosoma en proceso de replicación: 5’.....ATTCGTACGATCGACTGACTGACAGTC.....3’ 3’.....TAAGCATGCTAGCTGACTGACTGTCAG.....5’ Si la polimerasa se encuentra replicando de derecha a izquierda ¿Cuál es la hebra guía y cuál la retrasada? Dibuja la horquilla de replicación (esquema) cuando la polimerasa se encuentra a mitad de la secuencia e indica las cadenas continua y discontinua, cebadores de RNA y enzimas participantes.