¿Qué es la PCR?

Ta de fusión de oligonucleótidos (tm)
%
¿Qué es la PCR?
T
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR:
polymerase chain reaction) es una técnica de
amplificación de secuencias de DNA in vitro
T
% G + C
tm = 2 (A + T) + 4 (G + C)
tm = 81.5 + 16.6 (log 10 [K+]) + 0.41 (%[G + C]) – (675/n)
3’ …. TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAAGCTATC .... 5’
5’ …. AGGTCGAATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG .... 3’
3’ …. TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAAGCTATC .... 5’
5’
AGGTCGAATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG .... 3’
3’ …. TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAAGCTATC
5’
5’ …. AGGTCGAATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG .... 3’
3’ …. TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAAGCTATC .... 5’
5’
AGGTCGAATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG .... 3’
3’ …. TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAAGCTATC .... 5’
5’
AGGTCGAATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG .... 3’
3’ …. TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAAGCTATC
5’
5’ …. AGGTCGAATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG .... 3’
3’ …. TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAAGCTATC
5’
5’ …. AGGTCGAATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG .... 3’
3’ …. TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAAGCTATC .... 5’
5’
AGGTCGAATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG .... 3’
3’ …. TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAAGCTATC
5’
5’ …. AGGTCGAATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG .... 3’
PCR
Desnaturalización
Extensión
1er de
ciclo
Unión
oligos
Extensión
Unión
2ndode
ciclo
oligos
Desnaturalización
1
La PCR según Mullis
Eritrocitos sanos

Desnaturalización

Unión cebadores

Eritrocitos falciformes
(100oC)
Polimerización (37oC)
Individuos
Sanos
Glu
Individuos
con anemia
Val
DNA polimerasa termoestable
Thermus aquaticus: Taq polimerasa
Diagnóstico de un tipo de anemia falciforme
Sano
5’ …CGACTCCTGAG .... 3’
3’ …GCTGAGGACTC .... 5’
DdeI
110 p.b.
Enfermo
5’ …CGACTCCTGTG .... 3’
3’ …GCTGAGGACAC .... 5’
DdeI
110 p.b.
Comparación entre Klenow yTaq polimerasa
Saiki et al. Science. (1988) 239: 487
2
Termoestabilidad de la Taq
N-terminal:13 Pro
Actividad correctora de pruebas (KlenTaq)
Fragmento completo:
• 17 nuevos aminoácidos
- hidrófobos
- aromáticos
• 4 Lys
4 Arg
Actividad exonucleasa: unión de NMP a
Klenow
Taq
Hebra 2: Asp355
Phe309
Glu357
Desaparecido
Thr358
Desaparecido
Hélice C: Asp424
Leu356
Leu345
Val307
Interfase (hélices G,Q,R):
• Asn524
Trp428
• Asp819
Phe724
• Arg858
Leu763
• Arg909
Tyr811
NÚCLEO HIDROFÓBICO MAYOR EN TAQ
Pasos en la PCR
KLENOW
•
Desnaturalización
100oC
•
Unión cebadores y
polimerización
Elementos de la PCR
Taq POLIMERASA
•
•
•
DNA Molde
•
Cebadores (oligonucleótidos)
•
DNA polimerasa termoestable
95oC
•
Desoxinucleótidos trifosfatos
Unión cebadores
•
Desnaturalización
(45-55 oC)
37oC
•
Tm
Polimerización
72oC
Tampón de reacción
•
pH
•
Cationes divalentes
•
Cationes monovalentes
Rendimiento extracción DNA en tejidos humanos
Optimización de la PCR
Fuente de DNA
Cantidad de partida
Rendimiento
Sangre
30 µl
0.5 - 1 µg
Suspensiones
celulares
5 10 5 células
2 - 5 µg
Células bucales
Lavado bucal
0.1 - 1 µg
Semen
30 µl
5 - 10 µg
Raíz de pelo
1 raíz
10 - 200 ng
Bloque de tejido
50 mg
0.1 - 10 µg
3
Ta de fusión de oligonucleótidos (tm)
Diseño de cebadores
%
T
• LONGITUD: 18-25 nucleótidos complementarios
• COMPOSICIÓN: G+C entre 40% y 60%
• DIMERIZACIÓN: No deben unirse entre si

• CONCENTRACIÓN: 0.1-0.5 µM de cada cebador

T
% G + C
tm = 2 (A + T) + 4 (G + C)
tm = 81.5 + 16.6 (log 10 [K+]) + 0.41 (%[G + C]) – (675/n)
Grado de homología y tm
Nuevas DNA polimerasas termoestables
• 100 % homología
5´ TCCAGCTTAAGCTACCAAA 3´ tm = 52oC
3’ AGGTCGAATTCGATGGTTT--------- 5’
• 75 % homología
3´ tm = 36oC
5´ TCCAGCTTAAGCTACCAAA
3’ ACGTCTAATACGATGGCTT--------- 5’
Log Nf
Eficiencia de la amplificación en la PCR
Otros componentes de la reacción
14
Log de Nf
12
10
8
6
4
2
0
0
10
20
30
40
50
60
Número de ciclos
Número de ciclos (n)
Nf = No
(1+Y) n
Nf = número final de moléculas
No = número inicial de moléculas
Y= eficiencia
n= n o de ciclos
Ejemplo
Nf = 10 12
No = 3 x 10 5 (1µg DNA)
Y = 0,7
n = 28.8
4
Razón
↑ Especifidad
Recomendaciones
Eliminar P no deseados
• Cambiar cebadores
• ↑ T hibridación
Optimización de la técnica
• Cambiar [Mg 2+]
• Cambiar polimerasa
↑ Fidelidad
• ↓ No ciclos
Reducir el error
• ↑ [molde]
• Cambiar polimerasa
Razón
↑ Rendimiento
↑ Moléculas
Recomendaciones
• ↑ [molde]
• ↓ T hibridación
↑ Fidelidad
↓ errores
Aplicaciones
• ↑ No ciclos
• Clonaje de genes
• Cambiar polimerasa
• Diagnóstico
• ↑ t extensión

• ↑ t extensión
• Cambiar polimerasa
• Cambiar [Mg 2+]
• ↓ t desnaturalización
• ↑ [molde]
Ventajas de la PCR en clonación
• Evolución molecular
• Cuantificación de mRNAs

• Secuenciación
• Localización de AN in situ
• Forense
• Otras

Alineamiento de pectin esterasas
• A partir de RNA total y en un solo paso (RTPCR) pueden obtenerse cDNAs específicos
• No es necesario el empleo de librerías para
obtener fragmentos genómicos definidos
FP1
FP2
RP2
RP1
5
PCR anidado (Nested PCR)
Deteccion de mutaciones: SSCP
N-Ras Normal (A)
FP1 FP2
P32
...CAA...
...GTT...
P32
Desnaturalización
FP1+RP1
1a PCR
FP2
...CAA...
RP1
...GTT...
(A)
2a PCR
N-Ras Mutado (B)
P32
RP2 RP1
FP2+RP2
...CT
TA...
...GA
AT...
...CT
TA...
(A/B)
CAA
CTA
GAT
DNA shuffling: β-lactamasa
Evolución molecular. DNA shuffling
3
1
DNAsa I
4
2
PCR con oligos
...GA
AT...
(B)
GTT
PCR sin oligos
P32
[Cefotoxima] (µg/mL)
Posición
Posición
14
42
92
104
182
238
241
TEM-1
0.02
TEM-1
(MIC
0.02)
A
A
G
E
M
G
R
ST-1
320
ST-1
(MIC
320)
V
A
G
K
T
S
R
ST-2
640
ST-2
(MIC
640)
A
G
S
K
T
S
H
ST-4
10
ST-4
(MIC
10)
A
A
G
K
T
S
R
• TEM-1: β-lactamasa
• ST-1: descendiente de TEM-1 tras 3 ciclos de
mutagénesis/recombinación/selección
Mutaciones útiles
Mutaciones nuevas
• ST-2: descendiente de ST-1 por retrocruzamientos
• ST-4: construcción diseñada resultante
6