Sesión 1: Metabolismo oxidativo del Fe frente a situaciones de

Sesión 1:
Metabolismo oxidativo del Fe frente a situaciones de estrés en cerebro
METABOLISMO OXIDATIVO DEL Fe EN CEREBRO EN DESARROLLO EXPUESTO A LA
RADIACIÓN γ
Robello E,Puntarulo S
Fisicoquímica-Instituto de Bioquímica y Medicina Molecular (IBIMOL), UBA-CONICET.
Junín 956, 1113AAD, CABA. erobello@ffyb.uba.ar
El objetivo del presente trabajo es caracterizar el metabolismo oxidativo del Fe en
cerebro en desarrollo frente a la exposición a la radiación γin utero y realizar un
análisis comparativo entre dos modelos de irradiación de cultivos celulares: ya sea
irradiando directamente a los cultivos o realizando los cultivos con células irradiadas in
utero.En el modelo de irradiación directade los cultivos no hubo alteraciones en el Fe
total ni en el pool de Fe lábil (LIP), pero se observó un aumento significativo en el
índice de estrés oxidativo [A•]/[AH-]: 1,15±0,05; 2,7±0,4; 2,5±0,1; 2,7±0,2 (x10-2) enel
control y a 1, 2 y 4 h post-irradiación (pi), respectivamente. En los cultivos preparados
con células irradiadasse determinóun aumento significativo en el Fe total a las 4 h pi:
4,2±0,1 y 14±1 pmol/106células para el control y a 4 h pi, respectivamente yel LIP
disminuyó significativamentea consecuencia de la irradiación: 0,39±0,02;
0,27±0,04pmol/106célulaspara el control y a 1 h pi.El índice [A•]/[AH-]no se alteró por
la irradiación in vivoen los cultivos. Estas observaciones sugieren que el protocolo de
aplicación del estrés oxidativo resulta determinante de los mecanismos vinculados a la
respuesta celular. En el caso en estudio de irradiación in vivo, la alteración en el
metabolismo oxidativo del Fe en el cerebro depende de la interacción entre la sangre
fetal y materna. Por otro lado, el modelo de irradiación in vitro de los cultivos celulares
de precursores neuronales no reproduce adecuadamente los resultados observados en
el cerebro entero irradiado in vivo lo que limita la aplicación de este protocolo en el
estudio de este efecto.
METABOLISMO OXIDATIVO DEL Fe. HIPÓTESIS A ESTUDIAR
S Puntarulo
Fisicoquímica-Instituto de Bioquímica y Medicina Molecular (IBIMOL), UBA-CONICET.
Junín 956, C1113AAD, CABA.susanap@ffyb.uba.ar
La hipótesis integral de trabajo desarrollada por este grupo de investigación plantea
que el desarrollo de condiciones de estrés oxidativo y nitrosativo, comparten, al menos
parcialmente, vías de señalización celular que incluyen la activación de los factores
redox-sensibles, mostrando estas vías ciertos aspectos de contacto entre animales y
organismos fotosintéticos. Recientemente se ha enunciado el concepto de hormesis
que se refiere a que células y organismos expuestos a condiciones moderadas de
estrés oxidativo responden induciendo mecanismos protectivos que resultan en
efectos beneficiosos. La respuesta hormética es inducida por dosis bajas de agentes
tóxicos, irradiación, restricción calórica dietaria, ejercicio moderado y estrés por calor.
Hormesis es una respuesta dependiente de la dosis, que dispara mecanismos que
dependen del tipo celular, del nivel de las especies activas alcanzado y de la duración
de la exposición. Datos preliminares de nuestro laboratorio indican que la exposición a
concentraciones moderadas de Fe llevan a controlar adecuadamente el daño
dependiente de isquemia-reperfusión en hígado de rata. Las diferentes líneas de
trabajo que se desarrollan actualmente en este laboratorio estudian la habilidad de
dosis limitadas de Fe de inducir mecanismos que prevengan parcial o totalmente la
toxicidad de tratamientos oxidativos posteriores. Se compararán los mecanismos en
células fotosintéticas (algas, plantas superiores) y células animales (invertebrados,
cerebro de rata). Además, se están caracterizando los efectos de otros tóxicos tales
como el As sobre el cerebro de rata. Este análisis implica el estudio de los cambios
relacionados con la generación de estrés oxidativo en los modelos considerados por los
tratamientos, empleando técnicas de espectroscopía de resonancia electrónica (EPR),
de HPLC y bioquímicas, para la posterior caracterización de los cambios operados en el
mecanismo de señalización cellular.
ESTRÉS OXIDATIVO EN CEREBRO DE RATAS SOMETIDAS A SOBRECARGA AGUDA Y
SUBCRÓNICA DE Fe
NE Piloni y S Puntarulo
Fisicoquímica-Instituto de Bioquímica y Medicina Molecular (IBIMOL), UBA-CONICET.
Junín 956, C1113AAD, CABA. npiloni@ffyb.uba.ar
La hipótesis del proyecto en ejecución es que el exceso de Fe dispara en el cerebro un
fenómeno de hormesis como resultado de la administración aguda y subcrónica del
metal. El objetivo de este trabajo fue caracterizar el efecto de las sobrecargas aguda y
subcrónica de Fe-dextrán sobre el estado oxidativo celular en cerebro, y en corteza (C),
hipocampo (H) y cuerpo estriado (CE). Ratas SpragueDawleyfueron inyectadas en
forma intraperitoneal (ip) con Fe-dextrán. Para el tratamiento subcrónico se empleó
una dosis de 50 mg/kg cada 48 h (6 dosis), o con una única dosis ip de 500 mg/kg de
Fe-dextrán para el tratamiento agudo. En el tratamiento subcrónico, el contenido de
Fe total en cerebro y en las áreas estudiadas aumentó a las 2 h post-administración de
la sexta dosis. La velocidad de generación de radicales lipídicos y el índice de estrés
oxidativo ascorbilo (A●)/ascorbato (AH-) aumentaron en un 44% y 3,9 veces, a las 2 h
post-tratamiento, respectivamente. La actividad de catalasa (CAT) en la C aumentó
significativamente a las 2, 4, 6, y 8 h post-tratamiento. En el tratamiento agudo se
observó un aumento en el contenido de Fe total en homogeneizado de cerebro y en
las áreas, a las 6 h post-tratamiento. El índice A●/AH- aumentó en un 55% y la actividad
de CAT se incrementó significativamente en C, H y CE a las 6 h post-tratamiento. Estos
resultados sugieren que bajo ambos protocolos de administración de Fe, en el cerebro
se disparan mecanismos de protección basados en la actividad de la enzima CAT, sin
embargo el perfil cinético de la respuesta es característico de cada modelo. Si bien las
distintas áreas incorporan significativamente Fe, la defensa antioxidante no es
uniforme. Estudios posteriores serán encarados para la caracterización de este
fenómeno.
SOBRECARGA AGUDA DE Fe: EFECTO SOBRE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE NO
ENZIMÁTICA EN ÁREAS CEREBRALES DE RATA
1
M Reiteri, 2NE Piloni, 1M Hernando, 1CO Cervino y 2S Puntarulo
1
Facultad de Medicina, Universidad de Morón. Machado 914, B1708EOH, Morón,
Buenos Aires. 2Fisicoquímica-Instituto de Bioquímica y Medicina Molecular (IBIMOL),
UBA-CONICET. Junín 956, C1113AAD, CABA.macky_1981@yahoo.com.ar
La hipótesis del amplio proyecto dentro del cual se enmarca el presente trabajo, se
refiere a la posible participación del Fe en el fenómeno de hormesis disparado en
cerebro por la administración aguda de Fe. El objetivo de este trabajo fue caracterizar
el efecto de la sobrecarga aguda causada por la administración intraperitoneal (ip) de
Fe-dextrán (500 mg Fe/kg) sobre la capacidad antioxidante no enzimática en corteza
(C), hipocampo (H) y cuerpo estriado (CE). Los cerebros de ratas SpragueDawley fueron
removidos a las 6 y 8 h pos-inyección (pi) con Fe-dextrán y las tres áreas fueron
separadas. Utilizando las técnicas que serán comentadas en la presentación, se
observó que el contenido de Fe aumentó significativamente con respecto a los
controles en las 3 áreas a los dos tiempos analizados. El contenido de glutatión (GSH)
disminuyó significativamente luego de 6 h (59%) y 8 h pi (27%) en C, sin modificaciones
significativas en H y CE. Además se observó que el contenido de α-tocoferol aumentó
significativamente en el CE a las 8 h del tratamiento con Fe-dextrán con respecto al
control. En las áreas restantes no se observaron diferencias significativas. Estos
resultados preliminares indican que la respuesta antioxidante no resulta uniforme en
todas las áreas cerebrales, sugiriendo que algunas de estas áreas pueden estar menos
propensas que otra a expresar daño oxidativo. Además, se requiere analizar
detalladamente el complejo escenario de interconexión con otros antioxidantes (tanto
enzimáticos como no enzimáticos), que permitirían interpretar el aumento del
contenido de α-tocoferol (probablemente debido a procesos de regeneración con
ascorbato). Cada una de las áreas en estudio serán caracterizadas en cuanto a la
aparición de fenómenos de protección en comparación con cerebros controles, frente
a efectos de estrés posteriores.
INTOXICACIÓN AGUDA CON As: ESTUDIO DE LOS EFECTOS EN EL MEDIO HIDROFÍLICO
CELULAR EN CEREBRO
1,2
2
Bonetto JG, Robello E, 1Villaamil Lepori E, 2Puntarulo S
1
Toxicología y Química Legal, Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA. 2FisicoquímicaInstituto de Bioquímica y Medicina Molecular (IBIMOL), UBA-CONICET. Junín 956,
C1113AAD, CABA.jbonetto@ffyb.uba.ar
La hipótesis del presente proyecto, es que la generación de especies altamente
reactivas juega un papel importante en la toxicidad del arsénico (As) siendo
dependiente de la dosis del elemento en el cerebro. Para ello se decidió analizar el
efecto de la administración intraperitoneal (i.p.) en ratas Wistar de Arsenito de Sodio
(5,8 mg As/kg) que provoca una intoxicación aguda sobre la condición oxidativa en el
medio hidrofílico celular. Se tomaron muestras de sangre y se extrajeron los cerebros a
diferentes tiempos durante el período inicial pos-administración (hasta 31 h).
Mediante el empleo de técnicas específicas (HPLC, EPR, etc), que se discutirán durante
la exposición, se evaluaron los contenidos de As en sangre y cerebro, el índice de
estrés oxidativo en el medio hidrofílico contenido de ascorbilo/contenido de ascorbato
(A•/AH-), y la velocidad de generación de radical hidroxilo (•OH). Se observó un
aumento significativo en el contenido de As en ambos tejidos a partir de las 8 h posinyección, que luego alcanzó una meseta en ambos tejidos. En cerebro, ni la velocidad
de generación de •OH ni el índice A•/AH- presentaron diferencias significativas entre
animales controles y tratados. Estos resultados preliminares sugieren que, en la dosis y
el período de trabajo, no se han desarrollado condiciones detectables de estrés
oxidativo en el medio hidrofílico celular. Se están encarando estudios que nos
permitirán analizar los efectos del As en la fracción lipofílica del ambiente celular en el
cerebro de ratas tratadas con As, y la posible formación de radicales dependientes de
la especiación metabólica del As.
Sesión 2:
El cerebro como blanco de daño en patologías oftálmicas y el rol protector
de los antioxidantes
EVALUACIÓN DEL ESTADO REDOX EN EL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL EN UN
MODELO EXPERIMENTAL DE GLAUCOMA.
Ferreira S, Reides CG, LasagniVitar R, Lerner F, Llesuy S.
Química General e Inorgánica-Instituto de Bioquímica y Medicina Molecular (IBIMOL),
UBA-CONICET. Junín 956, 1113AAD, CABA. smferrer@ffyb.uba.ar
El glaucoma es una neuropatía óptica multifactorial con pérdida de células
ganglionares retinales y atrofia del nervio óptico. La presión intraocular elevada es el
principal factor de riesgo y los mecanismos de daño propuestos incluyen
excitotoxicidad, isquemia, falta de factores tróficos y estrés oxidativo. Si bien el
glaucoma es una patología asociada al ojo, el daño glaucomatoso puede extenderse a
nivel cerebral. Los axones de las células ganglionares retinales confluyen en el núcleo
geniculado lateral y en la corteza visual primaria; la muerte neuronal y la degeneración
transneuronal ha sido demostrada en algunas enfermedades neurodegenerativas.
El objetivo general es evaluar las alteraciones que se producen en la
homeostasis redox en el cerebro de ratas sometidas a un modelo experimental de
glaucoma.
La hipótesis de la investigación es que en el glaucoma se produce un daño
neurodegenerativo en el sistema nervioso central mediado por un desbalance del
estado redox. En la actualidad el grupo se encuentra trabajando en la evaluación de los
marcadores de daño oxidativo a nivel cerebral en periodos tempranos de la
enfermedad, obteniéndose resultados que corroboran el aumento de los
prooxidantes, la disminución de antioxidantes y un incremento de la actividad de
enzimas antioxidantes. Las actividades de enzimas asociadas al metabolismo del
glutatión se encuentran disminuidas.
La evaluación del daño oxidativo a nivel cerebral en el glaucoma y su posible
incremento a medida que transcurre la enfermedad son interrogantes aun abiertos los
cuales sería interesante abordar desde el estudio del perfil redox y en un futuro utilizar
estrategias terapéuticas que retrasen la progresión del daño neurodegenerativo
teniendo en cuenta el daño a nivel del sistema nervioso central más allá de la retina y
del nervio óptico. Esto redundaría en un beneficio en el tratamiento del glaucoma
enfermedad que es la mayor causa de ceguera en el mundo.
PROGRESIÓN DEL DAÑO OXIDATIVO EN LA CORTEZA VISUAL PRIMARIA EN UN
MODELO EXPERIMENTAL DE GLAUCOMA Y EL ROL PROTECTOR DEL ÁCIDO LIPOICO
EN LA PROGRESIÓN DEL DAÑO NEURODEGENERATIVO.
Reides CG, LasagniVitar R, Lerner F, Ferreira S, Llesuy S.
Química General e Inorgánica-Instituto de Bioquímica y Medicina Molecular (IBIMOL),
UBA-CONICET. Junín 956, 1113AAD, CABA. creides@ffyb.uba.ar
El sistema nervioso central es particularmente vulnerable al estrés oxidativo no solo
por su alto metabolismo aeróbico sino también por su elevado contenido en lípidos. El
glaucoma es considerado como una patología asociada al ojo, sin embargo el daño
glaucomatoso puede extenderse a nivel cerebral. Los axones de las células
ganglionares de la retina confluyen en el núcleo geniculado lateral, el cual a su vez
envía sus axones a través de la radiación óptica que va a la corteza visual primaria.
En el modelo de glaucoma experimental utilizado se observa elevación persistente de
la presión intraocular acompañada de ahuecamiento del nervio óptico y pérdida de
células ganglionares de la retina lo que proporciona un modelo reproducible de
animales para el estudio de daño glaucomatoso.
El objetivo general es evaluar las alteraciones que se producen en la homeostasis
redox en corteza visual y núcleo geniculado de ratas glaucomatosas y determinar las
modificaciones de los marcadores daño oxidativo cuando se administra una terapia
antioxidante con ácido lipoico. La hipótesis de la investigación es que en el glaucoma
se genera un daño neurodegenerativo mediado por un desbalance del estado redox y
que ese daño puede ser revertido por la administración con sustancias antioxidantes
que podrían restablecer el estado redox celular alterado.
El tratamiento actual del glaucoma se remite exclusivamente a disminuir la presión
intraocular ya sea con medicación o mediante cirugía. Las estrategias del tratamiento
dirigidas a prevenir la muerte neuronal se denominan neuroprotección. La evaluación
del daño glaucomatoso a nivel de distintas estructuras cerebrales a medida que
transcurre la enfermedad y su posible prevención mediante la utilización de
antioxidantes ofrecería un abordaje terapéutico innovador en esta patología lo que
redundaría en un beneficio en el tratamiento del glaucoma que afecta a 60 millones
de personas en todo el mundo.
HOMOGENEIZADO DE CEREBRO COMO SISTEMA PARA LA DETERMINACIÓN DE LA
CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE EXTRACTOS ACUOSOS DE ALOYSIA TRIPHYLLA.
Lasagni Vitar, RM; Reides, CG; Ferreira, SM; Llesuy, SF.
Química General e Inorgánica-Instituto de Bioquímica y Medicina Molecular (IBIMOL),
UBA-CONICET. Junín 956, 1113AAD, CABA. rlasagni@ffyb.uba.ar
En una dieta normal, el uso de hierbas es una de las principales fuentes de antioxidantes
naturales. La Aloysiatriphylla (“cedrón”) es un miembro de la familia Verbenaceaeque en
la medicina popular es habitualmente preparada en forma de extractos acuosos
(infusión y cocimiento). El cerebro es un órgano con un elevado contenido lipídico. La
utilización de un homogeneizado de este órgano en una proporción de 1/5 es una buena
herramienta para la determinación de la capacidad antioxidante ya que sufre procesos
de oxidación lipídica en forma espontánea a temperatura ambiente o tras la incubación
a 37 °C. La evaluación de la capacidad antioxidante en sistemas in vitro tiene un amplio
uso cuando se debe estimar las propiedades antioxidantes de diferentes sustancias.
El objetivo de este trabajo fue evaluar la capacidad antioxidante de extractos acuosos de
Aloysiatriphylla utilizando homogeneizados de cerebro como sistema para la
determinación del efecto protector sobre la peroxidación lipídica, y compararlo con
otros ensayos comúnmente utilizados como TRAP, ABTS y DPPH. La determinación de la
lipoperoxidacion y del balance oxidativo se realizó por las técnicas de TBARS y de
quimioluminiscencia espontánea (QL), respectivamente. Ambos extractos acuosos
mostraron una fuerte inhibición de la peroxidación lipídica y una mejora en el balance
oxidativo, observándose el efecto protector de los extractos acuosos de Aloysiatriphylla
tanto en la infusión como en el cocimiento. Cuando se comparan estos ensayos con los
del TRAP, ABTS y DPPH se obtienen resultados similares. El uso del homogeneizado de
cerebro como sistema de evaluación del poder antioxidante hace que los resultados
obtenidos se acerquen a los esperados en el sistema in vivo, ya que éste contiene toda
la batería de sustancias constituyentes del tejido.
Sesión 3:
Efecto de metales: Alteraciones fisiológicas.
ALTERACIONES EN LA FISIOLOGÍA HIPOTÁLAMO-HIPOFISARIA PROVOCADAS POR LA
EXPOSICIÓN AL CADMIO, CROMO VI Y ARSÉNICO
Cabilla JP, Duvilanski BH
Instituto de Investigaciones Biomédicas (INBIOMED), UBA-CONICET, Facultad de
Medicina, Paraguay 2155 piso 10, C1121ABG, CABA. jcabilla@ffyb.uba.ar
El cadmio (Cd), cromo VI (Cr VI) y arsénico (As) son metaloides/metales pesados
(M/MP) tóxicos persistentes cuya concentración y acumulación en el ambiente han ido
aumentando progresivamente como consecuencia de las actividades antrópicas.
El Cd es uno de los contaminantes más prevalentes en el ambiente. La exposición al Cd
sucede primariamente a través de las fuentes dietarias, el humo del cigarrillo y el agua
de bebida.
El Cr VI es altamente tóxico y un oxidante muy fuerte principalmente producido
porfuentes antropogénicas.
El As constituye uno de químicos ambientales de máxima preocupación para la salud
humana. En nuestro país existen grandes áreas endémicas de contaminación con As de
origen geológico, afectando a casi el 7% de la población.
Ha sido ampliamente reportado que estos M/MP afectan diferentes órganos y su
liberación hormonal pero se desconocía la acción sobre el eje hipotálamo-hipofisario.
Hipótesis: los M/MP afectan la viabilidad celular y la liberación hormonal
adenohipofisaria por mecanismos de estrés oxidativo.
Objetivo: investigar los efectos y los mecanismos por los cuales el Cd, Cr VI y As afectan
al eje hipotálamo-hipofisario de ratas Wistar, tanto in vivo como in vitro.
Resultados: Cd, Cr VI y As se acumulan en hipotálamo e hipófisis. La exposición a estos
M/MP tanto in vivo como in vitro induce estrés oxidativo en ambos tejidos y además
afecta directamente la liberación hormonal y la viabilidad celular adenohipofisaria. Los
lactotropos fueron significativamente más afectados. Estos M/MP aumentan la
producción de especies reactivas del oxígeno (ROS), causan activación de caspasas e
inducen apoptosis por la vía mitocondrial. Estos efectos deletéreos pueden prevenirse
mediante el uso de antioxidantes (TROLOX, melatonina, N-acetilcisteína).
Conclusiones: Los M/MP generan estrés oxidativo que afecta adversamente al eje
hipotálamo-hipofisario alterando la liberación hormonal y causando muerte celular. El
tratamiento con antioxidantes podría ser útil para revertir estas acciones nocivas.
DMT1: UNA VÍA ALTERNATIVA PARA EL INGRESO DE HIERRO A LA CÉLULA DE
SCHWANN. SU PARTICIPACIÓN EN LA MIELINIZACIÓN PERIFÉRICA
R. Martinez-Vivot, B. Goitia, V. Usach y C.P. Setton-Avruj.
Instituto de Química y Fisicoquímica Biológica (IQUIFIB), UBA-CONICET, Departamento
de Química Biológica, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires,
Junin 956, CABA. rmartinezvivot@gmail.com
Las células de Schwann (CS) se desdiferencian en cultivo, adquiriendo un fenotipo
similar al de sus precursores. Nuestros antecedentes demuestran que la
holotransferrina previene esta desdiferenciación pero la apotransferrina no consigue
evitarla.
El objetivo de este trabajo fue demostrar la existencia de un transporte independiente
de transferrina para la entrada de Fe a las CS. Para ello se evaluó la presencia del
ARNm del DMT1 (transportador de metales divalentes tipo 1) y de la proteína.
La presencia de la proteína del DMT1 se demuestra en homogenato, mielina y CS
aisladas de nervio ciático y se verificó la existencia de su ARNm en CS durante el
desarrollo, además su ubicación en membrana plasmática lo consolida como candidato
para transportador alternativo para la entrada de Fe a las CS. En un proceso de
desmielinización como es la degeneración Walleriana promovida por la compresión del
nervio ciático, se observó que en la zona desmielinizada el ARNm del DMT1 presenta
un máximo 7 días post injuria (dpi), el pico en los niveles de la proteína coincide con el
período de mayor desmielinización (14 dpi). La evaluación del contenido de hierro en
el nervio ipsilateral alcanza un máximo que coincide con el momento de máxima
desmielinización y de remielinización incipiente.
Se propone la existencia de una correlación entre el DMT1 y los procesos de
desmielinización-remielinización frente a una compresión del nervio ciático y al DMT1
como vía de ingreso del hierro a la CS, reforzando el papel crucial del hierro en la
mielinización del SNP.
EL Fe3+ Y LA HOLOTRANSFERRINA INDUCEN LA DIFERENCIACIÓN DE LAS CÉLULAS DE
SCHWANN A TRAVÉS DEL AUMENTO DE AMPc
C. Salisa, C. Daviob, V. Usacha, N. Urtasuna, B. Goitiaa, R. Martinez-Vivota, J.M.
Pasquinia,C.P. Setton-Avruja*
a
Instituto de Química y Fisicoquímica Biológica (IQUIFIB), UBA-CONICET, Departamento
de Química Biológica, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires,
Junin 956, CABA. setton@qb.ffyb.uba.ar
b
Laboratorio de Farmacología de Receptores, Cátedra de Química Medicinal, Facultad
de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires.
La mielinización en el sistema nervioso periférico (SNP) se produce a partir de una
secuencia de eventos que involucran tanto la proliferación como la diferenciación de
las células de Schwann (CS). El mantenimiento de las CS en un fenotipo mielinizante
requiere del contacto axonal permanente, y del aumento de AMPc esencial para la
expresión de las proteínas de mielina.
Hemos demostrado que la holotransferrina (holoTf) agregada al medio de incubación
previene la desdiferenciación de las CS promovida por la deprivación del suero. Sin
embargo, la apotransferrina (apoTf) sólo logro este efecto en CS incubadas en un
medio enriquecido en hierro (Salis et al. 2002).
Es por ello que el objetivo de este trabajo es evaluar si el efecto prodiferenciante de la
holoTf estaría mediado por el Fe.
En CS en cultivo se evaluó el efecto del Fe3+ agregado al medio de cultivo en la forma
de citrato de amonio férrico sobre la expresión de proteínas de mielina. Los resultados
obtenidos demuestran que en estas condiciones experimentales el Fe3+, en
concentraciones similares a las aportadas por la holoTf también evita la
desdiferenciación de las CS en cultivo inducida por la deprivación de suero. El Fe3+ y la
holoTfpromueve el aumento en los niveles de especies oxidantes intracelulares con la
consecuente elevación de los niveles de AMPc, y la activación de PKA seguida por la
fosforilación de CREB. Estos efectos son bloqueados por deferroxamina (quelante de
hierro), H9 (antagonista de la PKA dependiente de AMPc) y N-acetilcisteína (potente
antioxidante). La apoTf fue incapaz de reproducir el efecto prodiferenciante ejercido
por el Fe3+ y por la holoTf.
Nuestros resultados sugieren que el Fe3+sería el responsable del efecto
prodiferenciante promovido por la holoTf a través de la elevación de AMPc
favoreciendo la expresión de las proteínas mayoritarias de mielina esencial para la
maduración de las CS.
Sesión 4:
Estrés y daño oxidativo en cerebro por toxicidad de los metales de
transición hierro, cobre, cobalto y níquel.
TOXICIDAD DE LOS METALES COBALTO Y NÍQUEL EN CEREBRO: DAÑO OXIDATIVO E
INFLAMACIÓN SISTÉMICA
Ferrarotti NF, Semprine JV, MusaccoSebio R; Saporito Magriñá C, Boveris A, Repetto
MG
Cátedra de Química General e Inorgánica - Instituto de Bioquímica y Medicina
Molecular (IBIMOL), UBA-CONICET, Junín 956 1113AAD, CABA.
nidiaferrarotti@yahoo.com.ar
Con el objetivo de analizar los efectos tóxicos de los metales de transición como
inductores de daño oxidativo y toxicidad, estudiamos en primer lugar la oxidación de
fosfolípidos por los metales hierro (Fe), cobre (Cu), níquel (Ni) y cobalto (Co) en
liposomas preparados con una proporción de fosfolípidos 60:40 de
fosfatidilcolina/fosfatidilserina. El H2O2 sólo puede oxidar los fosfolípidos en presencia
de Fe o Cu mediante la reacción de Fenton Haber Weiss, sin embargo el Ni y el Co no
pueden oxidar los fosfolípidos en este modelo. El Co inhibe la oxidación de fosfolípidos
en presencia de Fe y H2O2, mientras que el Ni la potencia en el mismo sistema.
Posteriormente, nos propusimos estudiar la toxicidad de estos metales en un modelo
in vivo. La hipótesis de este trabajo es que los metales de transición Co y Ni tienen
efectos tóxicos en el cerebro de rata por mecanismos diferentes que los metales que
catalizan la reacción de Fenton, como Fe y Cu. El objetivo de este trabajo es estudiar el
efecto de la sobrecarga aguda y crónica de los metales Co y Ni en cerebro de rata
desde el punto de vista del daño oxidativo y el perfil antioxidante, así como también la
liberación de citoquinas inflamatorias, como respuesta a los efectos tóxicos de dichos
metales. Los resultados en esta línea de trabajo demuestran que, si bien el Co y el Ni
no son capaces de oxidar los fosfolípidos in vitro, la sobrecarga in vivo involucra
oxidación de biomoléculas en cerebro de rata, cambios en el perfil antioxidante y
aumentos de los niveles de IL-6 en plasma.
DAÑO OXIDATIVO Y RESPUESTA DE LOS ANTIOXIDANTES ENDÓGENOS EN LA
TOXICIDAD AGUDA DE COBRE Y HIERRO EN CEREBRO DE RATA
Semprine J, Ferrarotti NF, MusaccoSebio R, Saporito Magriñá C, Torti H, Fuda J, Boveris
A, Repetto MG
Cátedra de Química General e Inorgánica - Instituto de Bioquímica y Medicina
Molecular (IBIMOL), UBA-CONICET, Junín 956 1113AAD, CABA.
jimenasemprine@hotmail.com
Los metales de transición son esenciales en varias reacciones biológicas, pero la
exposición a altas concentraciones de los mismos genera toxicidad y daño oxidativo a
biomoléculas. La toxicidad en sistemas biológicos puede ocurrir a través de diferentes
mecanismos: unión a grupos tioles proteicos, y por generación de especies reactivas
del oxigeno mediante reacciones de auto-oxidación, en las que se produce
primordialmente O2- y por dismutación del anterior, H2O2. El cerebro es muy
vulnerable al daño y estrés oxidativo inducido por metales redox activos, como el
cobre (Cu) y el hierro (Fe) por su alta tasa metabólica y limitada capacidad de
regeneración celular. La hipótesis de este trabajo es que la sobrecarga de metales de
transición con actividad redox (Cu y Fe) produce toxicidad en el cerebro mediante
mecanismos que involucran daño oxidativo y alteración de las defensas antioxidantes
del órgano. El objetivo de este trabajo es estudiar la toxicidad aguda del Fe y Cu en
cerebro de ratas mediante la determinación de la supervivencia de los animales, el
contenido de metal en el tejido, la quimioluminiscencia in situ, la oxidación a
biomoléculas y el perfil antioxidante dado por la relación GSH/GSSG, contenido de
antioxidantes hidrosolubles (TRAP) y la actividad de enzimas antioxidantes
superóxidodismutasa (SOD), catalasa (CAT) y glutatión peroxidasa (GPx). Los resultados
obtenidos en esta línea de trabajo han probado la hipótesis, ya que los metales se
acumulan significativamente en el órgano, produciendo aumento de la
quimioluminiscencia in situ y oxidación a biomoléculas. En cuanto al perfil
antioxidante, se encontró un marcado consumo de antioxidantes hidrosolubles,
principalmente de GSH y alteración de la actividad de las enzimas antioxidantes. Con
estos resultados, se calcularon parámetros como la concentración de metal necesaria
para producir el 50% de efecto máximo (C50) y el tiempo para producir el 50% de
efecto máximo (t1/2).
EFECTO DE LA SOBRECARGA CRÓNICA DE LOS METALES DE TRANSICIÓN HIERRO Y
COBRE EN MITOCONDRIAS DE CEREBRO DE RATA
MusaccoSebio R, Saporito Magriñá C, Semprine J, Araujo J, García Magro N, Boveris A,
Repetto MG
Cátedra de Química General e Inorgánica - Instituto de Bioquímica y Medicina
Molecular (IBIMOL), UBA-CONICET, Junín 956 1113AAD, CABA.
rosario.musaccosebio@gmail.com
Varios metales de transición, entre ellos hierro (Fe) y cobre (Cu) son micronutrientes
esenciales cuyo rol biológico se encuentra ampliamente descripto. Sin embargo la
exposición a altas concentraciones de los mismos genera citotoxicidad y daño
oxidativo a biomoléculas, ya sea por unión a grupos tioles proteicos, y/o por
generación de especies reactivas del oxígeno mediante reacciones redox, en las que se
produce O2- y por dismutación del anterior, H2O2. El cerebro y particularmente sus
mitocondrias, son muy vulnerables al daño y estrés oxidativo inducido por metales
redox activos, como el Cu y el Fe. La hipótesis de este trabajo es que las mitocondrias
son las organelas blanco de la toxicidad de los metales de transición en la célula y que
existe relación entre la generación de las especies reactivas del oxígeno y el nitrógeno
y la función mitocondrial. El objetivo de este trabajo es evaluar la funcionalidad
mitocondrial en modelos de sobrecarga crónica de Cu y Fe en cerebro de rata,
determinar el daño oxidativo mitocondrial y evaluar la generación de especies
reactivas del oxígeno. Los resultados preliminares en esta línea han mostrado que
existe un desbalance de la función mitocondrial en cerebro en la sobrecarga de Cu y
Fe, y estos resultados van de la mano con el daño oxidativo producido por los metales
en dicha organela.
TOXICIDAD CRÓNICA DEL COBRE EN CEREBRO: ACUMULACIÓN Y DAÑO OXIDATIVO
EN LAS DISTINTAS ÁREAS CEREBRALES
Saporito Magriñá C, MusaccoSebio R, Semprine J, Araujo J, García Magro N, Torti H,
Fuda J, Boveris A, Repetto MG
Cátedra de Química General e Inorgánica - Instituto de Bioquímica y Medicina
Molecular (IBIMOL), UBA-CONICET, Junín 956 1113AAD, CABA.
saporito.cm@gmail.com
El cobre (Cu) es un micronutriente esencial que constituye el grupo activo de enzimas,
cataliza la transferencia de electrones en reacciones de óxido reducción generando
especies reactivas del oxigeno, y participa en la peroxidación de fosfolípidos, en citosol
y mitocondrias.Actualmente existe un creciente interés por el estudio de la toxicidad
del Cu en la salud humana, ya que su efecto está relacionado con neurotoxicidad, daño
oxidativo, disfunción mitocondrial y eventos intracelulares responsables de la muerte
celular. Hemos estudiado los efectos de la toxicidad crónica del Cu en cerebro de rata y
sus mitocondrias. Sin embargo no se conocen los mecanismos por los cuales se
produce la disfunción mitocondrial; ni tampoco hay antecedentes sobre la relación
entre la toxicidad por Cu, su acumulación en las diferentes áreas del cerebro y
alteraciones en el comportamiento. La hipótesis de este trabajo es que la sobrecarga
de Cu produce daño oxidativo en las distintas áreas cerebrales, y que el estudio
diferencial de la misma permitirá aclarar el panorama acerca de qué aéreas del
cerebro son más vulnerables a la toxicidad de dicho metal y, de esta manera, un
acercamiento a que células o vías neuronales se encuentran más comprometidas. Este
efecto tóxico, no solo puede evaluarse estudiando el tejido post mortem sino también
mediante pruebas conductuales específicas. El objetivo de este trabajo es estudiar los
efectos de la toxicidad crónica del Cu en áreas cerebrales comprometidas con
funciones como la memoria y la motricidad, y relacionarlo con la conducta de los
animales frente a pruebas que evalúan dichas funciones.
Sesión 5:
Disfunción mitocondrial, homeostasis del calcio y radicales libres en
sistema nervioso central
EVALUACION DE LA HOMEOSTASIS MITOCONDRIAL DEL CALCIO EN DIVERSAS
CONDICIONES CELULARES
Bustamante J, Karadayian AG, Czerniczyniec A, Lores-Arnaiz S
Instituto de Bioquímica y Medicina Molecular (IBIMOL)-Fisicoquímica, UBA-CONICET.
Junín 956, 1113AAD, CABA. juanitab@ffyb.uba.ar
Son pocas las funciones celulares que no se encuentran reguladas por señales de
calcio. Hasta hace aproximadamente 15 años, las señales intracelulares de calcio eran
consideradas procesos totalmente celulares afectando todas las regiones del
citoplasma. El concepto de que estas señales de calcio se encuentran restringidas a
regiones subcelulares específicas regulando procesos de compartimientos celulares
individuales, es relativamente nuevo. Hoy en día sabemos que los diferentes
microdominiossubcelulares, así como las organelas tales como mitocondrias, retículo
endoplásmico y núcleo poseen una homeostasis de calcio característica.
En general las mitocondrias de casi todos los tejidos son muy similares en cuanto a su
capacidad de acumular calcio a través de un proceso que depende del potencial
eléctrico a través de la membrana interna. Mientras que, la liberación de calcio
acumulado en la mitocondria de los diferentes tejidos es muy variable, tanto en
términos de velocidad como de mecanismo. Además, la eficiencia de la captación de
calcio en las células es estrictamente dependiente de la organización topológica de sus
membranas. Asimismo, la relación estructura-función entre las mitocondrias y otras
membranas subcelulares está determinada por la arquitectura particular de cada
célula.
Las mitocondrias no sólo modulan la amplitud y la cinética de los niveles
citoplasmáticos de calcio, sino que también dependen de señales de calcio para su
propia funcionalidad, en especial para generar ATP.
En este trabajo discutiremos algunos resultados de las variaciones de los niveles de
calcio intramitocondrial en condiciones fisiológicas y en modelos experimentales de
resaca alcohólica, tratamiento con ketamina y peróxido de hidrógeno y cirrosis
hepática, mediante citometría de flujo utilizando como sensor de calcio
intramitocondrial la sonda FLUO-4AM.
KETAMINA Y DISFUNCIÓN MITOCONDRIAL EN HIPOCAMPO.
Czerniczyniec A,Karadayian AG, Bustamante J, Lores-Arnaiz S.
Instituto de Bioquímica y Medicina Molecular (UBA-CONICET), Facultad de Farmacia y
Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Argentina. aczerni@ffyb.uba.ar
La ketamina actúa como antagonista de receptores NMDA de glutamato. La
administración de ketamina a ratas de 18-19 días de gestación conduce a la aparición
de apoptosis en neuronas corticales con cambios morfológicos caracterizados por
condensación y fragmentación nuclear. El objetivo de este trabajo consistió en evaluar
la funcionalidad mitocondrial en corteza cerebral e hipocampo de ratas neonatas
tratadas con ketamina. Se utilizaron ratas Sprague-Dawley macho recién destetadas a
las cuales se les administró solución salina o ketaminai.p. (40 mg/kg de peso) durante 3
días consecutivos. Posteriormente se aislaron mitocondrias de corteza cerebral e
hipocampo para los ensayos. Se observó una disminución en la actividad de los
complejos I y IV de la cadena respiratoria del 20 y 35 % respectivamente en
hipocampo. Asimismo, el tratamiento con ketamina disminuyó el consumo de oxígeno
en estado 4 en un 35 % y en estado 3 en un 27% en mitocondrias de hipocampo,
indicando disfunción mitocondrial. Por otra parte, se observó que la producción de
peróxido de hidrógeno en dicho área cerebral disminuyó en un 20%. El tratamiento
con ketamina indujo despolarización de la membrana mitocondrial del hipocampo lo
que se acompañó con una disminución en la capacidad de captación de calcio de la
mitocondria cuando los sustratos utilizados fueron malato y glutamato. En cuanto al
metabolismo de óxido nítrico se observó que el tratamiento con ketamina produjo una
disminución del 24% en la producción de óxido nítrico en hipocampo. Es importante
resaltar que no se observaron cambios significativos en ninguno de estos parámetros
en las mitocondrias de corteza cerebral de animales tratados con ketamina.
Los resultados muestran que la administración sistémica de ketamina durante 3 días a
ratas macho recién destetadas induce disfunción mitocondrial en hipocampo, hecho
que podría relacionarse con las primeras alteraciones descriptas para el proceso
apoptótico.
DISFUNCIÓN MITOCONDRIAL Y PRODUCCIÓN DE RADICALES LIBRES EN CORTEZA
CEREBRAL Y CEREBELO EN UN MODELO DE RESACA ALCOHÓLICA
Karadayian AG, Czerniczyniec A, Bustamante J, Lores-Arnaiz S
Fisicoquímica-Instituto de Bioquímica y Medicina Molecular (IBIMOL) UBA-CONICET,
Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires.
Junín 956, 1113AAD, CABA. akaradayian@ffyb.uba.ar
La resaca alcohólica es un estado transitorio que incluye síntomas y signos
desagradables después de la ingesta aguda de bebidas alcohólicas. La exposición aguda
de etanol induce la producción de especies reactivas del oxígeno asociada a una
disfunción mitocondrial; sin embargo, se desconocen cuáles son los efectos de la
resaca alcohólica sobre la función mitocondrial. El objetivo de este trabajo fue estudiar
la función mitocondrial y la producción de radicales libres al inicio de la resaca
alcohólica en corteza cerebral y cerebelo. Ratones machos de la cepa Swiss fueron
tratados mediante una única inyección i.p. de solución salina (grupo control) o etanol
(3,8 g/kg peso; grupo resaca). El estudio de la bioenergética mitocondrial se llevó a
cabo 6 hs pos-tratamiento, cuando la concentración de alcohol en sangre fue cercana a
cero (inicio de la resaca). Los resultados mostraron una disminución significativa del
control respiratorio tanto en mitocondrias de corteza cerebral y cerebelo en el grupo
tratado con alcohol. Específicamente, el grupo resaca mostró una disminución
significativa en la velocidad de respiración en estado 3 en mitocondrias de corteza
cerebral, mientras que en cerebelo se observó un aumento significativo del estado 4.
Asimismo, la producción de peróxido de hidrógeno fue 90% más alta en las dos áreas al
inicio de la resaca. La actividad enzimática de los complejos de la cadena respiratoria
mitocondrial se redujo significativamente en corteza cerebral durante la resaca. En
cerebelo, la resaca produjo un 38% de disminución en la actividad del Complejo I-III.
Por otra parte, los resultados del potencial de membrana mitocondrial indicaron un
17% de despolarización en corteza cerebral al inicio de la resaca alcohólica. Nuestros
hallazgos sugieren que la resaca produce una disfunción mitocondrial y un aumento de
la producción de radicales libres de oxígeno en corteza cerebral y cerebelo.
EFECTO DE LA HIPOXIA HIPOBÁRICA DE CORTO Y LARGO PLAZO SOBRE LA FUNCIÓN
MITOCONDRIAL EN CORTEZA CEREBRAL E HIPOCAMPO DE RATA.
La Padula, P.(1);Czerniczyniec, A.(2); Lores Arnaiz, S.(2); Bustamante, J.(2); Costa, LE.(1)
Instituto de Investigaciones Cardiológicas, Facultad de Medicina (1); Instituto de
Bioquímica y Medicina Molecular, Facultad de Farmacia y Bioquímica (2), UBACONICET. pablolapa@hotmail.com
El cerebro es un órgano altamente aeróbico y, por consiguiente, particularmente
sensible a la hipoxia. El objetivo del presente trabajo fue evaluar la función
mitocondrial en corteza e hipocampo de ratas durante la exposición a la hipoxia
hipobárica (HH). Ratas Wistar fueron sometidas a una altura simulada de 5000 m (53,8
kPa) en una cámara de hipopresión, mientras que el mismo número de animales
permanecieron como controles a presión atmosférica ambiental (101,3 kPa).
Al cabo de un mes de HH, las mitocondrias aisladas de hipocampo mostraron una
disminución en el consumo de oxígeno tanto en estado 4 (45%) como en estado 3
(41%) y un aumento en la expresión de NOS, mientras que el potencial de membrana
mitocondrial disminuyó (7%). La función mitocondrial en corteza no evidenció cambios
significativos. A los 7 meses de HH el consumo de oxígeno y la producción de NO de las
mitocondrias de hipocampo se normalizaron. Contrariamente, la despolarización de la
membrana mitocondrial se intensificó (16%). En corteza, las membranas
mitocondriales presentaron una despolarización (8%). En ambos tejidos se detectó una
clara tendencia a la disminución en la producción de H2O2. En conclusión, la función
mitocondrial y su regulación por NO formaría parte central en los mecanismos
celulares reguladores ante bajos niveles de oxígeno en el hipocampo. Al aumentar el
tiempo de hipoxia, ambos tejidos presentaron mecanismos de adaptación a la altura
similares: una moderada caída del potencial de membrana mitocondrial disminuiría la
producción de especies reactivas del oxígeno y el consiguiente daño oxidativo.
ENVEJECIMIENTO Y FISIOLOGÍA MITOCONDRIAL EN MITOCONDRIAS SINÁPTICAS
Y NO SINÁPTICAS DE CORTEZA CEREBRAL
Lores-Arnaiz, S.,Cicerchia, D., Lombardi, P. y Bustamante, J.
Instituto de Bioquímica y Medicina Molecular-Fisicoquímica(IBIMOL) UBA-CONICET,
Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires. Junín 956, 2º piso,
C1113AAD, Buenos Aires, Argentina. slarnaiz@ffyb.uba.ar
El envejecimiento neuronal ha sido asociado con una reducción en la capacidad
bioenergética mitocondrial, un aumento en la generación de radicales libres del
oxígeno y alteraciones en la homeostasis del calcio en los terminales nerviosos. El
objetivo de este estudio consistió en evaluar la susceptibilidad de las mitocondrias
sinápticas y no sinápticas de corteza cerebral a la disfunción asociada a la edad.
Se utilizaron ratones Swiss macho de 3, 14 o 17 meses de edad. Se aislaron
sinaptosomas y mitocondrias no sinápticas mediante la utilización de un gradiente de
Ficoll. La función mitocondrial fue evaluada mediante determinaciones de consumo de
oxígeno, velocidad de producción de peróxido de hidrógeno (H2O2), actividad de
monoamino oxidasa (MAO) y de los complejos enzimáticos de la cadena respiratoria.
La velocidad de respiración en estado 3 disminuyó un 40% en sinaptosomas de corteza
cerebral de ratones de 17 meses, pero no se vio significativamente afectada por el
envejecimiento en mitocondrias no sinápticas. La actividad del complejo IV se
encontró disminuída en aproximadamente 25-35% en membranas sinaptosomales de
animales viejos. Los sinaptosomas fueron más susceptibles que las mitocondrias no
sinápticas a sufrir depolarización inducida por calcio en ratones viejos. En ambas
fracciones subelulares de corteza cerebral de ratones de 17 meses, los niveles de anión
superóxido fueron más bajos, en comparación con los ratones jóvenes. Paralelamente,
se observó un aumento en la velocidad de generación de H2O2 en sinaptosomas de
ratones viejos, mientras que dicha producción se encontró disminuída en mitocondrias
no sinápticas. La actividad de la MAO resultó un 62% más alta en sinaptosomas de
corteza cerebral de ratones de 17 meses.
Los resultados de este estudio sugieren que las mitocondrias presentes en los
terminales sinápticos serían más susceptibles de sufrir deterioro funcional y daño
oxidativo con la edad, que las mitocondrias no sinápticas.