FUNCIÓN DE LOS GENES DL/DLX EN EL DESARROLLO CRANEOFACIAL Lina Quintero. Erika Simanca. Orlando Martínez. Liliana Otero. Existen 6 arcos branquiales simétricos bilaterales, cada uno de los cuales da origen a estructuras únicas de la cabeza y el cuello. El primer arco branquial se hace visible aproximadamente al día embrionario 9 (E9.0). El segundo arco se encuentra bien formado para el día E9.5, mientras que el 3er 4º y 6º arcos branquiales se hacen aparentes para el día E10.0. El 5º arco involuciona. Las células de la cresta neural dan origen al mesénquima de los arcos, los cuales se diferencian en órganos y estructuras de la cabeza y el cuello. La porción de cresta neural craneal que se extiende desde la placoda del oído medio hasta la tercera somita, es conocida como cresta neural cardiaca. Dentro del primer arco branquial se desarrollo el arco mandibular. En este arco los genes homebox, que se expresan en diferentes dominios espaciales próximo dístales correspondientes a las células presuntivas ectomesenquimales de los molares y los incisivos, son inducidos por señales que provienen del epitelio oral. En ratones antes de E10, todas las células ectomesenquimatosas del arco mandibular producen las mismas respuestas a las señales epiteliales (Fgf8), indicando que no existe una pre-especificación de estas células dentro de las diferentes poblaciones, sugiriendo que los patrones de los tejidos duros de la mandíbula son producidos por el epitelio. En el estadío E10.5, la expresión de los genes de las células ectomesenquimales dependen de las señales epiteliales, pero su expresión ectópica ya no puede ser inducida. En la etapa E11, la expresión se vuelve independiente de las señales epiteliales de tal manera que la remoción del epitelio no afecta la expresión espacial ectomesenquimatosa. Esta transformación es mediada por la pérdida de la BMP en la expresión de los genes ectomesenquimales dístales como el Msx1 y la expresión ectópica de los genes proximales Barx1, que es representado por la Bmp4. La respuesta de las células ectomesenquimales a las señales reguladoras epiteliales es diferente en el desarrollo de muchos organismos vertebrados, y es controlada por interacciones entre células epiteliales mesenquimatosas. El desarrollo de los dientes en los mamíferos provee un sistema fácil de manipulación para estudiar esta interacción. En adición el desarrollo de los diferentes tipos de dientes, molares, incisivos, etc., permite estudiar los papeles de estas interacciones en los patrones de formación. Los dientes se desarrollan de las interacciones entre el epitelio oral y las células mesenquimales de las células de la cresta neural de la mandíbula y del maxilar derivado del primer arco branquial. Experimentos clásicos de tejidos recombinantes han sido usados para determinar que células llevan la información instructiva para determinar el tipo de dientes. La mayoría de los resultados obtenidos de estos experimentos indican que el tipo de diente es determinado por el epitelio (Miller, 1969) de todas maneras ciertas piezas de evidencias sugieren que son las células mesenquimales derivadas de la cresta neural, las que determinan el tipo de diente. El experimento clásico de Noden (1983) muestra que las células de la cresta neural que hacen parte del primer arco branquial pueden contener un patrón previo, el cual determina el tipo de estructura esquelética que forma. Además, una serie de recombinaciones en embriones de ratones también sugieren que estas células mesenquimales determinan el tipo de dientes (Collar, 1999). Los hallazgos relacionados con los genes homebox muestran una alta expresión restringida en el ectomesenquima, a través del eje próximo distal de los procesos maxilares y mandibulares. Un modelo de los patrones de los dientes fue propuesto (el código homebox odonto-genético) donde la expresión de estos genes en las células ectomesenquimatosas determinan el tipo de diente (Charpe, 1995). Las mutaciones genéticas de los genes Dlx, Dlx1y Dlx2 los cuales son específicamente expresados en las células proximales mesenquimales (molares presuntivos) de la mandíbula y del maxilar (Thomas, 1997) soportan este modelo. Los embriones de ratones que no tienen los genes Dlx1y Dlx2 presentan un patrón fenotípico de los dientes, donde el desarrollo de los molares maxilares es inhibido pero el desarrollo de todos los demás dientes es normal. En contraste, mutaciones especificas en activin βA, la cual es expresada en las células mesenquimales de los gérmenes dentarios, resulta en un patrón anormal donde solo los dientes molares maxilares se desarrollan (Ferguson, 1998). Estos resultados soportan la idea que la información instructiva de los patrones dentales reside en las células mesenquimatosas. Esto significa que existe una pre determinación de las células de la cresta neural para poblar las regiones proximales y dístales de los procesos mandibulares y maxilares. El papel de Dlx5 en la diferenciación del esqueleto: El gen Dlx5 se expresa en la condensación, diferenciación y desarrollo de cartílagos, huesos y dientes. Algunos autores, indican que tiene un papel general en la regulación del desarrollo de tejidos. Tres líneas de evidencias sugieren que la familia de genes Dlx juegan un papel importante en la osteogénesis y condrogénesis. 1.- Cada uno de los mutantes Dlx1, Dlx2 y Dlx1/2 y Dlx5, tienen una forma anormal en el hueso y cartílago del cráneo. 2.- El gen Dlx5 es expresado en un estadío específico en la diferenciación de osteoblastos in Vitro, y esto puede jugar un papel en la regulación de la expresión de osteocalcina, a través de la inhibición de la proteína Msx2. 3.- La proteína ósea morfogenética (BMP-2) puede incrementar la expresión de los genes Dlx5 y Dlx2 en los osteoblastos y condroblastos. Dlx5 regula el desarrollo de estructuras derivadas de las placodas sensoriales óticas y olfatorias: Las placodas se engrosan en el ectodermo primitivo que ascienden a un número de estructuras incluyendo los tejidos sensoriales craneales. Algunas placodas se invaginan, por ejemplo las placodas olfatorias involucionan y ascienden al neuroepitelio olfativo, al órgano vómero nasal y al epitelio respiratorio de la cavidad nasal. El requerimiento de Dlx5 en el desarrollo de las estructuras olfatorias y óticas, sugieren que la inducción y la histogénesis en estos tejidos puede partir de mecanismos regulativos similares. Sin embargo, Dlx5 es expresado en estadíos tempranos de la formación de placodas olfativas y óticas, y no parece ser requerido para su especificación inicial. De los defectos observados en los mutantes Dlx5, solo esos asociados con la cápsula nasal mostraron variaciones severas y asimétricas. El 85% de los mutantes Dlx5 tuvieron asimetría del desarrollo nasal, de los cuales cerca del 90% tuvieron grandes hipoplasias en lado derecho. Esto puede verse tan temprano como en el estadío 10.5 y e por el 12.5. Esto aparece como si la prominencia lateral frontonasal no hubiese sido formada. Los genes Dlx regulan la morfogénesis regional de los arcos branquiales: Los genes Dlx se encuentran en todos los fila cordados. Hay seis genes Dlx conocidos en ratones y en humanos. Los genesl Dlx de ratón y de humano se encuentran en tres partes convergentemente transcritos. Cada par está unido a un grupo Hox. Por ejemplo, en los ratones y los humanos, el Dlx1 y el Dlx2 están unidos a Hoxd; Dlx3 y Dlx4 (este último conocido también como Dlx7 y Dlx8) están unidos a Hoxb; y Dlx5 y Dlx6 están unidos a Hoxa. Las regiones intergénicas de cada par contienen algo de los elementos mejorados. El cordado primitivo del tipo pez espada tiene un gen único Dlx mientras que los tunicados un poco más avanzados posee al mes tres genes Dlx. Se ha propuesto que la duplicación adyacente de un gen ancestral Dlx, seguido por dos ciclos de duplicación genómica y una pérdida subsecuente del par Dlx unido a Hoxc puede contar para el complemento presente de los genes Dlx de los mamíferos. Este escenario es apoyado por los análisis de la proteína Dlx y las secuencias nucleótidas que indican que hay dos tipos generales de regiones con Dlx- encriptado: Dlx2, Dlx3 y Dlx5; y Dlx1, Dlx4 y Dlx6. No se sabe si hay diferencias funcionales entre los dos grupos. Sin embargo, el Dlx1 y Dlx2 de ratón, el Dlx5 y Dlx6 de ratón y el dlx3 y el dlx4 del pez cebra son parcialmente redundantes, sugiriendo que algunas funciones clave son compartidas entre los dos tipos de regiones Dlx-encriptado, incluso aunque la secuencia de proteínas encriptadas externa a los homeodominios es ampliamente divergente. La drosófila y el Dll amphioxus (tipo pez espada) están más íntimamente relacionados al Dlx 1. El Dlx 1 puede ser entonces el miembro fundador de la familia Dlx de los vertebrados. En el pez cebra, el cual tiene siete grupos Hox, se cree que ha habido al menos una duplicación parcial del genoma más allá de la cual ocurrió en el linaje de los mamíferos. Consistente con esto, hay ocho conocidos como genes Dlx. Seis de estos se encuentran en tres pares transcritos convergentemente. Los otros dos aparentemente no están unidos a otros dos genes Dlx. Los tres pares transcritos convergentemente y uno de los genes Dlx sueltos están unidos a grupos Hox y es probable que den surgimiento a la duplicación de los segmentos genómicos que incluyeron a los grupos Hox. Cada gen Dlx de vertebrado tiene una organización exón-intrón común: tres exones y dos intrones. Cada exón contiene alguna secuencia encriptada: el homeobox está dividido entre los exones 2 y 3. El gen Dll de la drosófila tiene un intrón en ubicación idéntica dentro del homeobox. Varios de los genes Dlx producen múltiples transcriptos debido a la iniciación de trascripción alternativa o debido al empalme alternativo. En el caso del Dlx5, este encripta proteínas con y sin el homeodominio y la señal de ubicación nuclear. La proteína Dlx5 puede ser detectada en el citoplasma de varias células en la parte frontal del cerebro. Cuatro de los genes, Dlx1, Dlx2, Dlx5, Dlx6, son expresados en el sistema nervioso central. Dentro del tubo neural, su expresión parece estar altamente restringida a la parte frontal del cerebro, donde ellos se expresan en dos dominios: uno diencefálico y otro tele-encefálico. Estos dos dominios también están presentes en los pollos, sapos, tortugas, peces espada y lampreas. Donde se han estudiado, su expresión sigue una secuencia temporal: Dlx2, Dlx1 y Dlx5, luego Dlx6. La tendencia general es para que Dlx2 sea expresado en subgrupos de células neuroepiteliales de la zona ventricular. El Dlx1, Dlx2 y Dlx6 son expresados juntos en la mayoría de células de la zona subventricular, mientras el Dlx5 y Dlx6 son expresados en muchas de las neuronas de diferenciación postmitótica. El Dlx2 y Dlx1 también son expresados en un subgrupo más restringido de neuronas posmitóticas. Esta secuencia temporal sugiere que una casada reguladora puede existir entre los mismos genes Dlx. El análisis de Dlx1/Dlx2 de doble mutación confirma que este es el caso. Todos los genes Dlx, excepto los dlx2b del pez cebra, son expresados en células ectomesenquimales derivadas de la cresta neural craneal. Las células migratorias de la cresta neural pueblan los arcos branquiales, los cuales a su vez dan surgimiento a gran parte del tejido conectivo y el esqueleto facial. Los patrones de expresión superpuestos sugieren que existen funciones redundantes y diferentes de los genes Dlx en la morfogénesis del esqueleto visceral. Esto ha sido confirmado por el análisis de mutantes de Dlx1, Dlx2 Dlx1/Dlx2; Dlx2/Dlx5 y Dlx6.Algunos de los genes Dlx también son expresados en y requeridos para el desarrollo de otras células derivadas de la cresta neural, incluyendo los sistemas nervioso entérico y periférico. De hecho, con base en la expresión del cordado amphioxus (pez espada) primitivo, se ha propuesto que una función antigua de Dll/Dlx era especificar y darle un patrón a la cresta neural. Además de la expresión en el desarrollo del Orebro y en los derivados de la cresta neural, tales como los arcos branquiales, los genes Dlx son expresados en dominios discretos en los componentes neurales y no-neurales de la superficie del ectodermo. En las etapas finales del desarrollo, la expresión genética del Dlx se encuentra en la diferenciación de los tejidos esqueléticos. Los genes dlx son expresados en los compartimentos ectodérmicos y mesenquimales de los dientes en desarrollo. En particular, el Dlx5 y el Dlx6 son ampliamente expresados mesodermalmente como también en los tejidos esqueléticos derivados de la cresta neural. El Dixl4 (previamente Dlx7) también es expresado en otros tejidos derivados mesodérmicamente (células hematopoyéticas) donde su función está involucrada con la proliferación y supervivencia. Los genes Dlx operan en grupo en el control de la histogénesis en el cerebro y cooperan en el control de la formación del esqueleto cráneo facial. La expresión de patrones de Dlx1, Dlx2, Dlx3, Dlx5 y Dlx6, sugieren un modelo que puede explicar porqué los efectos fenotípicos de las mutaciones Dlx1 y Dlx2 se enfocan en los elementos esqueléticos derivados de las partes proximales de los arcos branquiales. Dlx1 y Dlx2 se expresa más a lo largo del eje próximo distal del primer y segundo arco branquial, La expresión de Dlx3, Dlx5 y Dlx6 se restringe a regiones más distales. Si el gen Dlx3, Dlx5 y Dlx6 pueden compensar la pérdida de Dlx1 y/o Dlx2, esto podría explicar porqué los arcos mandibulares y distales del hioides no se afectan en los mutantes de Dlx1, Dlx2 y Dlx1/2. Esto se puede explicar por estos mecanismos independientes: 1.- La cantidad de proteína Dlx puede ser crucial. 2.- Los genes Dlx1 Y Dlx2 no son completamente redundantes. 3.- Hay una regulación cruzada entre Dlx1 y Dlx2. Entonces Cada arco branquial puede requerir el mismo umbral de concentración de proteína Dlx como también una única propiedad de cada proteína. Mutaciones de Dlx3, Dlx5 o Dlx6 podría afectar los arcos mandibular y distal del hioides a pesar de la presencia compensatoria de Dlx1 y Dlx2. Regulación Trans y cis de los genes Dlx. Los esfuerzos para identificar las substancias, los senderos de transducción de señales y los elementos cis que regulan la expresión del Dlx hasta ahora están comenzando. Los experimentos para ganancia de función demuestran que el erizo (Shh) puede inducir la expresión Dlx en la parte frontal del cerebro, mientras que los ratones que carecen de Shh tienen niveles ampliamente reducidos de la expresión Dlx2 en la parte frontal del cerebro. La proteína 2 morfognética ósea (BMP2) puede inducir la expresión de Dlx2 en los condrocitos, la proteína morfogenética ósea 4 (BMP4) puede inducir la expresión Dlx5 en los osteoblastos, la expresión de Dlx1 y el Dlx2 en el mesénquima dental y el Dlx3 en el ectodermo embriónico. Sin embargo, hay evidencia en el ectodermo embriónico de que la inducción de Dlx3 por parte de de BMP, no es una respuesta inmediata-temprana, ya que el bloqueo del señalamiento de BMP usando receptores BPM de dominio negativo reduce, pero no elimina, la expresión Dlx3. Varios elementos cis-actuantes de los genes Dlx han sido caracterizados. La expresión ampliamente coincidente de los miembros de cada par Dlx sugiere la regulación por medio de mejoradores compartidos. En realidad, la región intergenética del Dlx5a del pez cebra y el dlx6a contiene elementos mejoradotes suficientes para dirigir la expresión correcta de la parte frontal del cerebro. Otros factores de transcripción también han sido implicados en la regulación de la expresión Dlx. Por ejemplo, el Mxz1 es requerido para mantener la expresión Dlx2 (pero no Dlx1) en el mesénquima del arco branquial. En el pez cebra, la expresión etcópica de Fez1 puede inducir la expresión de Dlx. Funciones de los Genes Dlx. El papel de los genes Dlx en el desarrollo de los vertebrados ha sido principalmente definido a través del análisis de mutaciones con pérdida de función en ratones y humanos. Mientras que los ratones que son homocigóticos para las mutaciones en genes Dlx individuales mueren durante la embriogénesis, los tejidos que expresan estos genes generalmente carecen de fenotipos obvios cuando otros genes Dlx son normalmente co-expresados en estas regiones. Los fenotipos en estos tejidos a menudo son detectables una vez que el ratón está generando la carencia de al menos dos genes Dlx. Este es el caso cuando los genes mutados pertenecen al mismo par. Así, los miembros de la familia Dlx parecen tener unas funciones redundantes y únicas. El grado de compensación funcional entre los genes Dlx, particularmente en el CNS, probablemente impedirá las aproximaciones genéticas para aislamiento de los mutantes Dlx, haciendo los enfoques genéticos reversos particularmente importantes en la elucidación de las funciones genéticas del Dlx. Funciones del Dlx en la formación de huesos y cartílagos. La expresión del Dlx3 y Dlx6 en el desarrollo óseo fue descrita primero por Simeone y col. La expresión de Dlx5 se encontró en el pericondrio, periostio y en los osteoblastos del desarrollo de los huesos endocondrales. El Dlx5 también es expresado en la diferenciación dérmica ósea (intramembranosa). Los mutantes Dlx5 exhiben un defecto en la estructura del componente endóstico de las diáfisis de huesos largos y tienen una reducción en la lámina perióstico. Además, parece haber una tardanza en la maduración de los huesos dérmicos específicos. Los mecanismos que subyacen a estos defectos histológicos son desconocidos, aunque en cultivo de tejidos los genes Dlx pueden regular el desarrollo esquelético, a través del control de la expresión de dos genes de colágeno y osteocalcina. Regulación de la expresión de los genes Dlx Los genes Dlx1, Dlx2 y Dlx5 pueden activar la transcripción de Dlx5/Dlx6 de ratones intergénicos dlx5a/dlx6a del pez cebra en las células de cultivo tisular. El DLX3 ha sido implicado directamente en la activación de varios genes, incluyendo aquellos que transcriben una subunidad de gonadotropina coriónica humana en la placenta y de profilagrina en los queratinocitos diferenciados. Los sitios de unión a través de los cuales ocurre la regulación DLX3 han sido identificados. Estos sitios comparten un núcleo TAAT con los sitios de reconocimiento para otras proteínas Dlx (y otros hemeodominios). EL DLX4 activa GATA1 y MYC en las células hematopoyéticas. El DLX4 ectópico también puede inhibir la apoptosis por medio de la sobre-regulación de la expresión de la adhesión intercelular de la molécula 1. Sin embargo, no se sabe si la activación de GATA1, MYC o de la molécula 1 de adhesión intercelular sea directa. Tres isomorfos de DLX4 han sido identificados. T Los hallazgos de investigaciones recientes sugieren que las proteínas Dll y Dlx se autorregulan, y han sido conservadas durante la evolución. Por ejemplo, en el primer arco branquial, los mutantes Dlx5/6 tienen expresión anormal de Alx4, Barx1 y Dlx3, esto brinda evidencia para la conservación del circuito genético de la drosófila. Un objetivo de las proteínas Dlx en el cerebro de los vertebrados y de la mosca es el GAD. Determinar si estos objetivos son compartidos entre moscas y vertebrados será un área importante de investigación futura. La evolución de la función Dll/Dlx. La expresión de los genes Dll y Dlx en los sistemas nerviosos de los vertebrados e invertebrados lleva a la propuesta de que la función original de Dll/Dlx estaba en el sistema nervioso y que las funciones tales como aquella del Dll en las extremidades de la Drosófila puede haber surgido después en la evolución animal. Varios aspectos comunes entre la expresión Dll y el Dlx han surgido últimamente y permiten precisar las funciones ancestrales del Dll/Dls con más exactitud. Por ejemplo, los requerimientos para Dll y Dlx en la audición, sistemas olfativo y partes de la boca en invertebrados y vertebrados, sugieren no sólo que al menos las versiones primitivas de estas estructuras/sistemas precedieron a la divergencia de estos linajes, sino también que Dll/Dlx estuvo involucrado en la formación de los sistemas olfativos y auditivos primitivos, y en las partes de la boca anteriores a esta divergencia. Está surgiendo evidencia que sugiere que Dll y Dlx regulan la morfogénesis de apéndices (extremidades y antenas de la mosca, arco branquial de la boca) a través de crecimiento y la especificación de identidad. Además, el posicionamiento del primordio de la extremidad torácica de la drosófila expresando Dll en el borde lateral del ectodermo neutral es análogo a la posición de los precursores de la cresta neural que expresan Dlx en el borde de la placa neutral de los vertebrados. Llama la atención como los sistemas de señalamiento común de los Ápteros/Wnt son usados para inducir la formación de la extremidad primordia de la drosófila y las células de la cresta neural de los vertebrados, y los precursores de la extremidad de la drosófila llevan a cabo migraciones anteriores a la identificación, como lo hacen las células de la cresta neural. Entonces, las poblaciones de células migratorias especializadas derivadas de los bordes laterales de una placa neural/ectodermo neural primitivo y que expresan Dll/Dlx también tienen la probabilidad de haberse anticipado a la divergencia de los linajes de vertebrados e invertebrados. Finalmente, los genes Dll y Dlx son expresados en los cerebros de vertebrados e invertebrados, respectivamente, aunque varias funciones Dlx en el cerebro de los vertebrados han sido descritas, permanece en investigación si todos son compartidos por Dll. Si es así, implicaría al Dll/Dlx en la diferenciación del sistema nervioso central ancestral. Obviamente, se tiene el debido cuidado cuando se intenta hacer paralelos entre el desarrollo de vertebrados e invertebrados, particularmente cuando los genes con fenotipos pleiotrópicos están involucrados. Sin embargo, si los objetivos Dll y Dlx y los co-factores pueden ser identificados como, por ejemplo, objetivos y cofactores sólo durante la diferenciación interneuronal GABAérgica en moscas y vertebrados, daría un gran soporte a un modelo en el cual el Dll juega un rol similar en la diferenciación inteneuronal GABAérgica en último ancestro común protóstomo-deuterostomo. Los trabajos futuros en esta área incluirán la identificación y comparación de los objetivos con tejido específico Dll y Dls y sus cofactores. El ectomesenquima maxilar y mandibular responde diferentemente a las señales epiteliales Los genes de Dlx muestran diferentes modelos de expresión en el ectomesénquima del primordio mandibular y el maxilar. Los Dlx1 y Dlx2 son expresados en el ectomesénquima proximal de ambos primordios, mientras que otros genes Dlx como el Dlx3, Dlx5 y Dlx6 se expresan predominantemente en el primordio mandibular con muy pequeños dominios de expresión en la mayoría del ectomesénquima del primordio proximal del maxilar en la unión con la mandíbula (el Qiu et al., 1997). La falta de expresión de Dlx5 en el ectomesénquima del arco maxilar en este tiempo, es consistente con la ausencia de cualquier anormalidad primaria en la estructura esquelética del maxilar derivado de estas células en el Dlx5 de un ratón mutante. Las dobles mutaciones de los genes Dlx1 y Dlx2 resultan en una falla en la iniciación de los dientes morales maxilares, pero con un desarrollo normal de los molares mandibulares (Thomas, 1997). El mas sorprendente fenotipo de diente fue aquel obtenido de la mutación del gene activin βΑ el cual es expresado por partes de ectomesénquima que marcan los sitios de iniciación de todos los dientes (Ferguson, 1998). Los ratones con falta funcional del gen activin βΑ y la proteína activin A desarrollan unos molares maxilares normales pero el desarrollo de todos los otros dientes se detienen en la etapa de casquete. Estos datos sugieren que la especificación de los dientes molares maxilares y mandibulares envuelve diferentes vías genéticas. Durante E9.5 el ectomesénquima mandibular expresa Dlx2 y Dlx5 mientras que el ectomesénquima maxilar está caracterizado por la expresión Dlx2 pero una falta de expresión Dlx5. La expresión del Dlx5 en la mandíbula esta restringida a la región molar, en este momento. En E10.25, el Fgf8 induce la expresión Dlx2 y Dlx5 en el ectomesénquima del arco mandibular. Las células ectomesenquimales del primordio maxilar y mandibular difieren en su competencia para responder a las señales epiteliales. Las células del tanto los primordios maxilar como el mandibular son capaces de responder al Fgf8 y la expresión del Dlx2, pero las células del maxilar son incapaces de expresar Dlx5. Esto sugiere que las células ectomesenquimales del primordio maxilar y mandibular son intrínsecamente diferentes en sus respuestas a las señales epiteliales y estas diferencias, pueden explicar las diferencias en los patrones del tejido duro tanto en el maxilar superior como el inferior. Referencias Aberg, T., Wozney, J. y Thesleff,I (1997). Expression patterns of bonemorphogenetic proteins (Bmps) in the developing mouse tooth suggest roles in morphogenesis and cell differentiation. Dev. Dyn 210, 383-396. Acampora, D., Nerlo, G. R., Paleari, L., Zerega, B., Postiglione, M. P., Mantero, S., Bober, E., Barbieri, O., Simeone, A. and Levi, G (1999). 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