DETECCIÓN DE GRÁNULOS DE POLIHIDROXIALCANOATOS EN LA CEPA USBA 355 Tistlia consotensis. KARINA BLANCO MARIN PONTIFCIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL DICIEMBRE DE 2010 2 DETECCION DE GRÁNULOS DE POLIHIDROXIALCANOATOS EN LA CEPA USBA 355 Tistlia consotensis. KARINA BLANCO MARIN TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar el titulo de MICROBIOLOGA INDUSTRIAL BOGOTA D.C. DICIEMBRE DE 2010 3 DETECCION DE DE GRÁNULOS DE POLIHIDROXIALCANOATOS EN LA CEPA USBA 355 Tistlia consotensis. KARINA BLANCO MARIN APROBADO 4 DETECCION DE DE GRÁNULOS DE POLIHIDROXIALCANOATOS OLIHIDROXIALCANOATOS EN LA CEPA USBA 355 Tistlia consotensis. KARINA BLANCO MARIN APROBADO __________________________________ Ingrid Schuler Garcia, Ph D. Decana Académica Facultad de Ciencias 5 AGRADECIMIENTOS A Dios por permitirme llegar hasta aquí y por brindarme todos los días la seguridad de su compañía en todas las acciones realizadas. A la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA), de la Pontificia Universidad Javeriana, que permitió el desarrollo de este trabajo. A la Doctora Sandra Baena por su colaboración, conocimientos aportados y su por infinita paciencia y dedicación que día a día hacia posible este proceso de investigación. A mis compañeros de USBA: Carolina Rubiano, Javier Gómez, Luisa Fernanda Bernal, Ángela Mantilla, Estefanía Sánchez y Laura Poveda por su apoyo, acompañamiento, colaboración y aporte incondicional en este proyecto. A Tuti por darme su mano y estar ahí para todo lo que necesitaba, por el aporte, por su confianza, por su inmensa amistad y su don de hacerme reír. A Andrés Felipe y su familia por acogerme como un integrante más y brindarme todo su apoyo y confianza. Y finalmente a papá y mamá quien con su infinito amor lograron engrandecer mi espíritu con sus consejos para darme la fuerza y el acompañamiento necesario para lograr este trabajo. 6 RESUMEN Un microorganismo identificado como nuevo género y nueva especie Tistlia consotensis (Díaz Cárdenas et al. 2010) presenta inclusiones citoplasmáticas que podrían sugerir la presencia de gránulos de polihidroxialcanoatos (PHA). Los PHAs son poliésteres sintetizados por bacterias en forma de inclusiones citoplasmáticas, como reserva de materia orgánica y energía, principalmente cuando las células se encuentran en condiciones desequilibradas en los suministros de nutrientes. Sus propiedades son similares a los termoplásticos, como el polipropileno y el polietileno, y el gran número de mezclas de co-polímeros hace posible obtener polímeros con las propiedades deseadas para un amplio rango de posibilidades. El objetivo general del estudio fue detectar los gránulos de PHAs que se almacenan como reserva, en la cepa USBA 355 Tistlia consotensis. Alterando las concentraciones de la fuente de carbono, la fuente de nitrógeno y la concentración de sal, optimas de crecimiento para la cepa T. consotensis, promoviendo las condiciones de stress para la producción del polímero. La consecuente producción de gránulos es detectada mediante coloración con Negro Sudan, Este trabajo de grado pretende demostrar que un microorganismo aislado de condiciones salinas con limitaciones o excesos nutricionales tienen la capacidad de producir de forma natural acumulados de polihidroxialcanoatos, que contribuyen como mecanismo de almacenamiento de energía para la célula en condiciones de stress. Para evaluar la influencia de los factores (condiciones nutricionales manipuladas) que intervienen en la producción de PHAs se desarrolló un diseño factorial de 3x3x2 para analizar todas las posibles combinaciones de los niveles de los factores en cada réplica del experimento. La detección de los gránulos por la técnica de Negro Sudán arrojó resultados positivos en la influencia de la fuente de carbono y la fuente de nitrógeno. 7 TABLA DE CONTENIDO Pág. 1. Introducción………………………………………………………………...... 1 2. Formulación del problema y Justificación del estudio………………….. 2 3. Marco Teórico………………………………………………………………... 3 3.1. Definición Polihidroxialcanoatos…………………………………………… 3 3.2. Características físicas y químicas…………………………………………. 4 3.2.1. 4 Figura 1. Estructura general de los polihidroxialcanoatos…………… 3.3. Clasificación Polihidroxialcanoatos………………………………………... 4 3.4. Síntesis de PHA en procariotas………………………………………….... 5 3.4.1. Figura 2. Vías metabólicas microbianas para la síntesis de PhaA: 3cetotiolasa; PhaB: (R)-reductasa 3-cetoacil-CoA reductasa, PhaC: PHA sintasa o de la polimerasa; PhaG, (R)-3-hidroxiacil ACP: transacilasa CoA; PhaJ, (R hidratasa enoil-CoA) específico. ……….. 7 PHAs sintasas y Especies Representativas…………………………… 7 3.5. Formacion de los gránulos de PHAs………………………………………… 9 3.6. Detección y cuantificación de PHAs….……………………………………… 10 3.6.1. Detección………………………………………………………………... 10 3.6.2. Cuantificación………………………………………………………….... 10 4. Objetivos……………………………………………………………………… 10 4.1. Objetivo General…………………………………………………………...... 10 4.2. Objetivos Específicos…………………………………………………….... 10 5. Metodología………………………………………………………………….. 11 5.1. Microorganismo……………………………………………………………… 11 5.2. Medios de cultivo y condiciones de crecimiento………………………… 11 5.3. Detección de la presencia de gránulos de PHAs…………………………... 11 5.3.1. Tabla 1. Medición de producción de gránulos de PHAs……………… 12 5.4. Factores para síntesis de gránulos de PHA’s en Tistlia consotensis …… 12 5.4.1. Fuente de carbono……………………………………………………... 12 5.4.2. Fuente de nitrógeno…………………………………………………..... 12 5.4.3. Concentración de sal…………………………………………………... 12 3.4.2. 8 5.5. Diseño Factorial…………………………………………………………….. 5.5.1. 12 Tabla 2. Diseño estadístico de 3x3x2 para evaluar diferentes concentraciones de nutrientes para poner a prueba la capacidad de producción de PHAs del microorganismo USBA 355…………………. 13 5.6. Detección de gránulos de polihidroxialcanoatos………………………... 14 5.6.1. Técnica de tinción Negro Sudan……………………………………... 14 6. Resultados y Discusión…………………………………………………...... 14 6.1. Detección de gránulos de PHA por tinción negro sudan……………….. 14 6.1.1. Figura 5. Detección de gránulos de PHA, por coloración con Negro Sudan en control positivo (Ralstonia Picketti)…………………………. 15 6.2. Detección de gránulos de PHAs con respecto al tiempo de crecimiento………………………………………………………………….... 6.2.1. 15 Figura 6. Cinética de crecimiento (Densidad óptica λ= 580nm ) de la cepa Tistlia consotensis y producción de gránulos de PHA con respecto al tiempo de crecimiento, por 24 horas de muestreo, en condiciones físicas y nutricionales optimas de 16 crecimiento……...…………………………………………………….. 6.3. Anova para seleccion de modelo factorial………………………………….. 17 6.3.1. Tabla 3. Análisis de varianza…………………………………..……..... 17 6.3.2. Tabla 4. Resultados estadísticos análisis de varianza……………... 18 6.3.3. Efecto de la fuente de carbono, fuente de nitrógeno y concentración de sal evaluados, sobre la producción de gránulos de polihidroxialcanoatos……………………………………………………… 19 6.3.3.1. Figura 7. Interacción entre el factor A: fuente de carbono (glucosa) y el factor B (cloruro de amonio)………………………………………… 20 6.3.3.2. Figura 8. Interacción entre el factor A: fuente de carbono (glucosa) y el factor C: concentración de sal……………………… 21 6.3.3.3. Figura 9. Interacción entre el factor B: fuente de nitrógeno (cloruro de amonio) y el factor C: concentración de sal……………. 23 7. Conclusiones………………………………………………………………… 24 8. Recomendaciones…………………………………………………………... 24 9. Referencias Bibliográficas………………………………………………… 25 9 1. INTRODUCCIÓN La problemática generada por el uso indiscriminado de plásticos sintéticos y su persistencia en el ambiente ha estimulado la investigación para el desarrollo de nuevos materiales y métodos de producción que permitan generar plásticos o materias primas que presenten las mismas propiedades pero que tengan un periodo de degradación más corto. La palabra plástico se refiere a ciertos tipos de materiales sintéticos obtenidos mediante fenómenos de polimerización o multiplicación artificial de los átomos de carbono en largas cadenas moleculares de compuestos orgánicos. En general, son derivados del petróleo, aunque algunos se pueden obtener a partir de otras sustancias naturales (Segura et.al.2007). Desde que Maurice Lemoigne descubrió en 1926 que la bacteria Bacillus megaterium produce Polihidroxialcanoatos (PHA), denominado polihidroxibutirato (PHB), se han reportado más de 300 bacterias capaces de producir PHA. Los PHA’s no son más que precursores de polímeros naturales producidos por bacterias, que constituyen una familia de poliésteres, acumulados intracelularmente, en forma de gránulos, compuestos de ácidos R-3 hidroxialcanoicos. Se producen partir de sustratos orgánicos, como carbohidratos (glucosa, sacarosa), aceites, alcoholes, ácidos orgánicos, hidrocarburos, y los acumulan en grandes cantidades dentro de la célula bacteriana en forma de gránulos, llegando a constituir hasta 90% de la biomasa. A nivel biológico la acumulación de este polímero se puede considerar como una estrategia desarrollada por las bacterias para su supervivencia en ambientes cambiantes. Además de servirle a la célula como fuente de carbono, también sirve como fuente de energía en el proceso de enquistamiento, como en el caso de Azotobacter sp. y de esporulación (Bacillus), así como barrera del oxigeno para la protección del complejo nitrogenasa, ya que actúa como compuesto oxidable y también es constituyente de la membrana citoplasmática de las bacterias (Castillo Franco, 2008). Por sus propiedades físicas semejantes a las de los plásticos derivados del petróleo (ya que estos polímeros presentan propiedades que van desde plásticos rígidos y quebradizos, hasta los semejantes al hule) y por ser producidos a partir de recursos renovables, los PHA han sido ampliamente estudiados presentándose como una alternativa biotecnológica para la producción de plásticos biodegradables (Segura et.al.2007). La cantidad de polímero producido y acumulado depende de la especie bacteriana y de las condiciones en las que se cultiva. Como ya se ha mencionado, los PHAs se acumulan de manera un tanto similar a la acumulación de grasas de reserva en los animales, bajo ciertas condiciones nutricionales. En general, condiciones de desbalance nutricional en el medio utilizados para el cultivo bacteriano, que favorezcan una alta producción. Para producir PHA 10 son especialmente favorables condiciones de cultivo en las que hay una concentración alta de fuente de carbono (que la bacteria utilizará como materia prima para sintetizar el PHA), por ejemplo sacarosa, pero además existe una limitación para el crecimiento, como niveles de oxígeno bajos o escasez de otros nutrientes (Kim, 2008; Segura et.al.2007). Existen varios factores que deben ser considerados en la selección de microorganismos para la producción industrial de PHA, tales como la capacidad de la célula para utilizar una fuente de carbono de bajo costo, la velocidad de crecimiento, la velocidad de síntesis y la capacidad de acumulación del polímero de una cepa en particular sobre la base del sustrato (Martínez et al. 2004). Motivo por el que rrecientemente, se ha estado explorando estrategias de cultivo con el fin de obtener una producción de PHAs con el mejor rendimiento, estas estrategias no se logran sobre el cálculo en papel, si no con ensayo y error lo que permite evidenciar bajo un estudio organizado y estadísticamente probado, que el efecto de diferentes nutrientes, concentraciones y condiciones de cultivo proveen la información necesaria para determinar el medio de producción adecuado. El objetivo de este trabajo de grado, se trató principalmente en demostrar la presencia de gránulos de polihidroxialcanoatos en la cepa Tistlia consotensis USBA 355, acumulados en forma de inclusiones citoplasmáticas y además determinar las variaciones nutricionales que podrían influir en la detección de gránulos de PHAs. 2. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÔN DEL PROBLEMA En trabajos de investigación previos, realizados en la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA) de la Pontificia Universidad Javeriana, sobre la diversidad microbiana, se encontró un microorganismo la cepa USBA 355 identificado como nuevo género y nueva especie, Tistlia consotensis (Díaz Cárdenas et al. 2010), que por medio de microscopia electrónica sugirió la presencia de inclusiones citoplasmáticas que podrían tratase de gránulos de PHA. Con base en esta evidencia, este estudio comprobó la presencia de dichos gránulos de almacenamiento de carbono y energía mediante la combinación de variables nutricionales para la determinación cualitativa de polihidroxialcanoatos. Teniendo en cuenta que los Polihidroxialcanoatos representa un precursor importante en la producción de plásticos biodebradables. La importancia de este trabajo se basó principalmente en la descripción de una cualidad con aplicación biotecnológica en la cepa USBA 355 Tistlia consotensis aislada de un manantial salino, Salado de Consotá, ubicado en el departamento de Risaralda (Colombia), que representa una alternativa biodegradable. Ya que los plásticos de origen químico constituyen una parte de los desechos sólidos. Debido a su baja densidad no es apreciable el porcentaje en masa con el que contribuyen a los desechos totales, pero el 11 porcentaje en volumen es grande, y conociéndose que el consumo destacado de estos materiales en la sociedad moderna se incrementa día a día. Razon por la cual la problemática de los plásticos en el medio ambiente es de gran relevancia y pretende ser disminuida (Rozsal, et al. 2004). 3. MARCO TEORICO 3.1. DEFINICION DE POLIHIDROXIALCANOATOS Los polihidroxialcanoatos son macromoléculas de origen microbiológico que se acumula en forma de gránulos discretos a altos niveles de rendimiento en peso seco. Gran variedad de procariotas tiene la capacidad de acumular PHAs como inclusiones citoplasmáticas insolubles en agua, que representan compuestos de almacenamiento de carbono y energía los cuales son sintetizados bajo condiciones desbalanceadas de crecimiento, principalmente cuando la fuente de carbono se encuentra en exceso y cualquier otro nutriente se encuentra en condiciones limitadas al mismo tiempo (Pötter & Steinbûchel, 2006). Los PHAs constituyen una familia de polímeros biodegradables son una clase de poliéster microbiano con un gran potencial en la aplicación de plásticos convencionales. Una vez que se extraen los PHAs de la célula bacteriana, estas moléculas muestran propiedades similares a algunos plásticos es conveniente para las bacterias almacenar el exceso de nutrientes dentro de la célula, en especial cuando su forma física en general no se ve afectada. Los PHAs contribuyen al desarrollo sostenible al ser originados por recursos renovables y por su capacidad de biodegradación, son llamados “polímeros doblemente verdes” (Rozsal, et al. 2004), El poli (3 – hidroxialcanoatos) (PHAs) Como comunes, como el polipropileno. Además de ser biodegradables, los PHAs son reciclables como los termoplásticos petroquímicos (Lara & Gjalt. 1999). 3.2. CARACTERISTICAS QUIMICAS Y FISICAS Diversos PHAs que han sido identificados son principalmente poliésteres lineales de principio a fin compuestos de monómeros de ácidos grasos 3-hidroxi. En estos polímeros el grupo carboxilo de un monómero forma un enlace éster con el grupo hidroxilo del monómero vecino. 12 3.2.1. Figura 1. Estructura general de los polihidroxialcanoatos. (Imagen: Ojumo et al 2003) Hasta el momento se han identificado más de 150 ácidos hidroxialcanoicos, saturados e insaturados, halógenos, aromáticos, etc, los cuales son incorporados a la cadena lateral del PHA y a su vez cambian sus propiedades físicas, esta variabilidad depende del tipo del sustrato que se suministra, y de su especificidad (Madison & Huisman, 1999). 3.3. CLASIFICACIÓN DE LOS POLIHIDROXIALCANOATOS La clasificación de los polihidroxialcanoatos depende de una amplia variedad de PHA que han sido estudiados en diversas bacterias, hasta la fecha, alrededor de 150 componentes diferentes de los PHA han sido identificados (Steinbüchel y Valentín, 1995). Los PHAs pueden dividirse en dos grandes grupos, dependiendo del número de átomos de carbono en la cadena polimérica. Estos pueden ser de cadena corta o de cadena media, los polihidroxialcanoatos tienen una longitud de cadena corta de 3-5 átomos de carbono. En cuanto a los polihidroxialcanoatos con una longitud de cadena media, generalmente tienen de 6 -14 átomos de carbono. Otra clasificación conocida, se basa en la composición del polímero dado que ésta varía en función de los sustratos utilizados (Pötter & Steinbuchel, 2007). La masa molecular de los PHAs es del orden de 50 kilo-Dalton hasta 100 kilo-Dalton esto depende de la naturaleza del polímero, intracelularmente se puede llegar a encontrar en estado liquido y amorfos, que después de la extracción con solventes orgánicos, este pasa a un estado cristalino confiriéndole características rígidas pero a su vez quebradizo. En cuanto al punto de fusión es relativamente alto (180ºC) pero cerca al punto de degradación térmica (200ºC) (Castillo Franco, 2008) 13 3.4. SINTESIS DE PHA EN PROCARIOTAS Como se ha descrito anteriormente, los PHAs son acumulados si la fuente de carbono se encuentra en exceso y si al mismo tiempo el crecimiento se ve limitado por otro nutriente como el hierro, el magnesio, el nitrógeno, el azufre, el fosfato o el potasio (Pötter y Steinbüchel 2006) ademas también se describen dos formas de clasificación de los PHAs de cadena corta y de cadena larga, cuya formación metabólica difiere de acuerdo a los sustratos. Las vías metabólicas de síntesis de los polihidroxialcanoatos de cadena corta y de cadena media han sido ampliamente estudiadas (Steinbuchel & Eversloh, 2003). El principal intermediario para la biosíntesis de polihidroxialcanoatos de cadena corta (PHASCL) es el acetil – CoA, proveniente principalmente principalmente de la oxidación de diferentes fuentes de carbono como carbohidratos, ácidos orgánicos y alcoholes; la producción de PHAs a partir de carbohidratos (sacarosa, glucosa y fructosa) está compuesta por tres enzimas clave. (Volova et al. 2004) La primera enzima perteneciente a la vía biosintética de los polihidroxialcanoatos es la β cetotiolasa, la cual cataliza la condensación de dos moléculas de acetil – CoA para formar acetoacetil – CoA, esta enzima es codificada por el gen phaA. El siguiente paso es la reducción del acetoacetil-CoA a (R) – 3 – Hidroxibutiril – CoA, catalizada por la acetoacetil - CoA reductasa dependiente de NADPH. La expresión de esta enzima es codificada por el gen phaB (Volova et al. 2004, Suriyamogkot et al. 2004). La principal enzima señalada en la síntesis de PHA es denominada PHA sintasa, responsable por la polimerización de unidades de (R)–3–hidroxiacil-CoA, formando el polihidroxialcanoato. Esta enzima es absolutamente estereoespecifica para los esteroisomeros (R), y su especificidad por el sustrato definirá la naturaleza del polímero final. Esta enzima puede ser encontrada en los gránulos de PHA durante la acumulación, en donde la moléculas de hidroxiacil-CoA servirán de sustrato para esta enzima, codificada por el gen phaC (Rehm, 2003) La incorporación de diferentes monómeros depende principalmente del microorganismo y de la fuente de carbono utilizada. Diferentes vías metabólicas, presentes en los microorganismos son los responsables por la formación de diferentes moléculas de hidroxiacil – CoA. Por lo que existen dos grupo de sustratos utilizados en la biosíntesis de estos polímeros: los sustratos relacionados y los sustratos no relacionados (Steinbuchel, 1996). La síntesis a partir de sustratos relacionados se denomina de esta forma ya que la composición del polímero 14 producido refleja el sustrato proporcionado; este tipo de síntesis es la que permite la incorporación de mas diversidad de monómeros al polímero. (Cortes, 2008) En la síntesis a partir de sustrato no relacionados, cuando son cultivados en presencia de glucosa, fructosa, glicolato, acetato, glicerol, etc., producen un polímero conteniendo 3 – hidroxidecanoato (3HD) como principal constituyente, además del 3 – hidroxioctanato (3HO), 3 – hidroxihexanoato (3HHx), 3 – hidroxidodecanoato, entre otros como constituyentes secundarios. La síntesis de PHAs de cadena media (PHAMCL), a partir de sustratos relacionados y sustratos no relacionados, pueden ser diferenciadas por las vías metabolicas que proporcionan los intermediarios. Mientras que en la síntesis a partir de sustratos relacionados, la β oxidación de ácidos grasos es la principal via para suministrar intermediarios. En la síntesis a partir de sustratos no relacionados la biosíntesis de ácidos grasos suple los intermediarios (Cortes, 2008). El metabolismo de ácidos grasos representa una de las vías metabolicas mas comunes para suplir monómeros de hidroxialcanoato (HA) a la síntesis de PHAs. Los intermediarios generados mediante la degradación de ácidos grasos via β oxidación pueden proveer hidroxialcanoil – CoA (HA-CoA) como sustrato para PHAsMCL (Cortes, 2008). Una segunda ruta para la síntesis de PHAMCL en bacterias es a través del uso de intermediarios de la biosíntesis de ácidos grasos de novo, la cual provee monómeros de 3 – hidroxiacil – CoA que generalmente es metabolizada a acetil – CoA, como carbohidratos, acetatol o etanol. El gen phaG codifica la enzima que enlaza la biosíntesis de ácidos grasos de novo y la síntesis de PHA (Hoffmann et al. 2000). El producto de este gen cataliza la conversión de (R) – 3 hidroxiacil – ACP intermediario de la via de biosíntesis de ácidos grasos a su correspondiente derivado CoA (Cortes, 2008). 15 (Imagen: http://openwetware.org/wiki/Work_Area) 3.4.1. Figura 2. Vías metabólicas microbianas para la síntesis de PhaA: 3-cetotiolasa; PhaB: (R)-reductasa 3-cetoacil-CoA reductasa, PhaC: PHA sintasa o de la polimerasa; PhaG, (R)-3-hidroxiacil ACP: transacilasa CoA; PhaJ, (R hidratasa enoil-CoA) específico. Por otra parte la síntesis de PHA’s de cadena media se ve directamente influenciado por la enzima PHA sintasa de grupo II, esta enzima tiene mayor afinidad por sustratos a partir de metabolismo de carbohidratos, donde se produce moléculas de acetil coA, las cuales vía malonil coA, son incorporadas a la síntesis de Novo de ácidos grasos, donde es generado el 3hidroxiacil, el cual es transportado de la ACP (Acil Carrier Protein) para la coenzima A (CoA) donde es polimerizado por la acción de la PHA sintasa. (REHM et al. 1999; Castillo, 2008 y Volova et al. 2004) 3.4.2. PHAs SINTASAS Y ESPECIES REPRESENTATIVAS Algunas PHAs sintasas han sido clonadas y caracterizadas a nivel bioquímico o molecular. Cuatro diferentes clases de PHA sintasas son diferenciadas. PHA sintasas Clase I, que son representadas por la enzima de Ralstonia eutropha; estas enzimas tienen preferencia al aceptar tioesteres de tipo CoA de ácidos hidroxialanoicos de cadena corta, como sustratos y consiste de solo un tipo de subunidad (PhaCSCL). Este tipo de PHA sintasa actúa principalmente en bacterias acumuladoras de PHA de cadena corta. (PHASCL) (Pöter & Steinbuchel, 2006). 16 3.4.2.1. FIGURA 3. Clases de PHA sintasa (Imagen: actualizado Pötter & Steinbüchel de 2006) Los PHAs de Clase II son representados por la enzima de Pseudomona oleovorans estas aceptan tioesteres CoA de ácidos hidroxialcanoicos de cadena media, como sustrato y contiene un solo tipo de subunidad (PhaCMCL) (Pöter & Steinbuchel, 2006). Los PHA sintasa Clase III, son representadas por la enzima de Allochromatium vinosum, esta sintasa contiene dos diferentes tipos de subunidades (Pha C y PhaE) y acepta tioesteres CoA de ácidos hidroxialcanoicos de cadena corta como sustrato y en algunos casos ácidos hidroxialcanoicos de cadena larga. Por último los PHA sintasas Clase IV, que están representados por la enzima extraida de Bacillus megaterium y Bacillus sp., estos también constan de dos diferentes tipos de subunidades (PhaC y PhaR) y presentan afinidad por sustratos del rango aceptado por PHA sintasas de Clase III) (Pöter & Steinbuchel, 2006). 17 3.4.2.2. Figura 4. Ejemplo de la acción de los genes en la producción enzimática y la acción de cada una de estas sobre el sustrato. (Imagen: Kim, 2008) 3.5. FORMACIÓN DE LOS GRÁNULOS DE PHAs. Los PHAs son acumulados intracelularmente (como polímeros amorfos o móviles) en gránulos de diferentes tamaños, ellos están rodeados por una monocapa fosfolipidica, que contiene PHAsinas PhaF y PhaI, polimerasas, despolimerasas y proteínas citosólicas no especificas ligadas al gránulo. La PhaI participa en la formación y estabilización de los gránulos, mientras que la Pha F está involucrada en la estabilización de los gránulos y actúa como regulador (Cortes, 2008). La función de la monocapa fosfolipídica aun no ha sido bien establecida (Pötter & Steinbüchel de 2006), aunque se cree que es necesaria por el contacto de los PHAs con el agua, previniendo la transición del poliéster del estado liquido amorfo a una forma cristalina más estable, y también se cree que desempeña un papel como barrera protectora evitando daño celular causado por la interacción de los PHAs con las estructuras internas celulares o con las proteínas citosólicas. En caso tal en que la monocapa fosfolipidica sea en realidad requerida para proteger las células desde el comienzo de la formación del gránulo, puede ser asumido que esta envoltura puede ser extendida alrededor del polimero, tan larga como se incremente el tamaño del mismo. Por ello deben existir enzimas específicamente involucradas en la síntesis de la monocapa fosfolipidica asociadas con el poliéster (Cortes, 2008). 18 3.6. DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PHA’s Se han empleado diferentes técnicas para la detección gránulos del polímero intracelular. Los colorantes lipofílicos Negro Sudan, Azul de Nilo A y Rojo de Nilo, son ampliamente utilizados (Burdón, 1946). 3.6.1. DETECCIÓN Después de Hartman, quien primero sugirió el uso de negro Sudán B, en lugar de Rojo Sudán, como una tinción de grasa bacteriana (Hartman, 1940), la coloración con Negro Sudan en solución alcohólica se confirmó como la técnica de mayor valor, dado que el procedimiento demuestra el contenido graso intracelular de las bacterias, por medio de la preparación de suspensiones de los organismos, formándose una película bacteriana y generando el contraste de observación con safranina, la cual permite visualizar la presencia o ausencia de polímero de naturaleza lipídica neutra en forma de gránulos intracelulares. (Burdón, 1946; Erazo et al. 2009). 3.6.2. CUANTIFICACIÓN El método cuantitativo de detección de los polihidroxialcanoatos es mediante cromatografía de gases, utilizando como patrón interno, acido benzoico, el cual establece tiempo de retención determinados para cada uno de los tipos de estructuras y cantidad de carbonos presente en ellas, esta cuantificación depende de la extracción previa de los gránulos de PHA del interior de las células y adicionalmente se debe despolimerizar por métodos como metanólisis para formar metil – esteres propanolisis para formar propil – ester (Castillo, 2008). 4. OBJETIVOS 4.1. OBJETIVO GENERAL Detectar la producción de gránulos de Polihidroxialcanoatos en la cepa Tistlia consotensis. 4.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS 1. Identificar la presencia de gránulos de PHA’s de acuerdo a la fase de crecimiento de la cepa Tistlia consotensis (USBA 355) 2. Identificar la presencia de gránulos de PHA’s de acuerdo a cambios de condiciones nutricionales. 19 5. METODOLOGIA 5.1. MICROORGANISMO La cepa USBA 355: Tistlia consotensis se encuentra en la colección de microorganismos del departamento de Biología de la Pontificia Universidad Javeriana. Fue aislada de un manantial salado, situado en los andes colombianos, en el laboratorio de la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental. La secuencia genética del análisis de 16s rRNA la ubica dentro del género Tistlia en la familia Rhodospirillaceae, de la clase Alphaproteobacteria, El nombre de la especia T. consotensis, está relacionado con la ubicación geográfica la cual fue aislada por primera vez en el manantial salino de Consotá, ubicado en el departamento de Risaralda, Colombia. (Díaz – Cárdenas, et al. 2010) Tistlia consotensis es una célula estrictamente aerobia, de coloración Gram negativa, miden de 0,6 – 0,7 x 3,0 – 3,5 µm, se reproduce por fisión binaria, muestra desplazamiento corporal, no posee pilis y no forma esporas, es ligeramente curva y ligeramente halófila. Muestra crecimiento en un rango de 20-40ºC (mesofílica) y un óptimo de 30ºC, crece en un rango de pH entre 5.0 a 8.0 con un pH óptimo en 6,5 – 6,7. De metabolismo quimioheterótrofa, utiliza glucosa o peptona como única fuente de carbono (Díaz – Cárdenas, et al. 2010). 5.2. MEDIOS DE CULTIVO Y CONDICIONES DE CRECIMIENTO Los requerimientos nutricionales básicos, fueron empleado en medio aerobio con: 1g/L NH4Cl; 0.3g/L K2HPO4; 0.3g/L KH2PO4; 8g/L NaCL; 0.1g/L CaCl2; 0.1g/L KCl; 10g/L de Solución de oligoelementos; (Balch et al. 1979) 0.05 g/L de Extracto de levadura y 5g/L NaHCO3. En condiciones de agitación de 300 r.p.m. El pH del medio se mantuvo un óptimo entre 6.5 – 6.7. El medio se llevo a agitación con el fin de lograr una mezcla homogénea para las sales y demás componentes del medio. Posteriormente, alícuotas de 10mL fueron distribuidas en tubos tapa rosca de 16x150mm y se llevaron a esterilización en autoclave por 20 minutos a 15 psi, una vez auto clavado, finalmente a los tubos con el medio básico se le adicionó 0.1mL de Glucosa por cada tubo de 10mL para conseguir una concentración final de glucosa de 20mM (Baena et al. 1998 y Díaz – Cárdenas. 2010). 5.3. DETECCIÓN DE LA PRESENCIA DE GRÁNULOS DE PHA La determinación de la producción de gránulos en la cepa Tistlia consotensis, se llevó a cabo por medio del muestreo de un cultivo liquido de crecimiento, en las condiciones de cultivo óptimas para el crecimiento del microorganismos (6.2), cada dos hora durante 24 horas. En cada muestreo, se montó una lámina de coloración con Negro Sudan, por triplicado y se evaluó 20 la presencia de gránulos. Esto se hizo para encontrar la hora aproximada en que se empieza a producir el polímero y de esta forma, establecer el tiempo de muestreo para la detección de gránulos bajo las condiciones nutricionales manipuladas. Esta detección cualitativa se realizó con base a la cantidad de gránulos observados por campo óptico (Tabla 2), para posteriormente ser interpolados de manera cualitativa. 5.3.1. Tabla 1. Medición de producción de gránulos de PHAs Gránuloss por campo óptico Determinación cuantitativa 0 a 20 0 20 a 60 1 60 a 100 2 Mayor a 100 3 5.4. FACTORES PARA SÍNTESIS DE GRÁNULOS DE PHAs EN Tistlia consotensis Las concentraciones de carbono y nitrógeno fueron alteradas del medio básico utilizado, en el cual, el microorganismo tiene las condiciones óptimas para su crecimiento. Basados en el criterio de Pötter y Steinbügel 2006; Madison & Huiman, 1999; Martínez et al. 2004; Ojumo et al. 2004 y Saito y Doi, 1993, la acumulación de PHAs está dada cuando la fuente de carbono esta elevada y otros nutrientes se encuentran limitados al mismo tiempo. Para este estudio se realizó un diseño factorial similar al aplicado por Quillaguamán y colaboradores en 2007, en el que se aplica una combinación de variables para evaluar la producción del polímero. 5.4.1. Fuente de carbono Se evaluaron tres concentraciones diferentes de glucosa (fuente de carbono) 30mM, 40mM y 50mM (9,008g/L), 5.4.2. Fuente de nitrógeno (NH4Cl), A partir de la concentración óptima para el crecimiento de la cepa (1,05g/L), tres concertaciones diferentes de NH4Cl: ¼ - ½ y ¾ partes de esta concentración, equivalentes a: 0.2625g/L – 0.525 g/L y 0.7875 g/L se evaluaron para determinar su influencia en la producción de gránulos. 5.4.3. Concentración de sal (NaCL), Dos concentraciones diferentes de sal, 5g/L y 23g/L fueron evaluados. 5.5. DISEÑO FACTORIAL Dado a la presencia de tres factores, fuente de carbono; fuente de nitrógeno y concentración de sal, con 3, 3 y 2 niveles respectivamente se diseñaron las posibles combinaciones de esos niveles en todos los factores, (Tabla 1) lo que permitió el estudio del efecto de cada factor sobre la variable respuesta que correspondía a una sola, la producción de gránulos de PHA. 21 Este diseño arroja un total de 18 ensayos diferentes, para los cuales se tuvieron en cuenta 3 repeticiones para validar la prueba, por lo tanto la suma de ensayos fue de 54 y la cuya evaluación se llevo a cabo de manera aleatoria. Adicionalmente se realizaron evaluaciones para el control positivo con Ralstonia pickettii que fue mantenida en condiciones normales en medio básico con las mismas condiciones para el mantenimiento y reproducción de T. consotensis y control negativo Escherichia coli puesto en crecimiento en medio caldo nutritivo, obtenidas del cepario del departamento de Microbiología de la Pontificia Universidad Javeriana. La interpretación de datos obtenidos se realizó con software de análisis estadístico DesignExpert versión 6.0. 5.5.1. TABLA 2. Diseño estadístico de 3x3x2 para evaluar diferentes concentraciones de nutrientes para poner a prueba la capacidad de producción de PHAs del microorganismo USBA 355. VARIABLES EVALUADAS ENSAYO GLUCOSA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 30 mM 40 mM 50 mM 30 mM 40 mM 50 mM 30 mM 40 mM 50 mM 30 mM 40 mM 50 mM 30 mM 40 mM 50 mM 30 mM 40 mM 50 mM NH4CL Partes/ Conc. Inicial Concentración g/L ¼ ¼ ¼ ½ ½ ½ ¾ ¾ ¾ ¼ ¼ ¼ ½ ½ ½ ¾ ¾ ¾ 0.2625 0.2625 0.2625 0.525 0.525 0.525 0.7875 0.7875 0.7875 0.2625 0.2625 0.2625 0.525 0.525 0.525 0.7875 0.7875 0.7875 22 NACL 5 g/L 5 g/L 5 g/L 5 g/L 5 g/L 5 g/L 5 g/L 5 g/L 5 g/L 23 g/L 23 g/L 23 g/L 23 g/L 23 g/L 23 g/L 23 g/L 23 g/L 23 g/L 5.6. DETECCIÓN DE GRÁNULOS DE POLIHIDROXIALCANOATOS 5.6.1. Técnica de tinción Negro Sudan (Burdón, 1946): 1. Se lleva una gota del cultivo ya sea con el control positivo o con el microorganismo prueba (Cepa USBA 355) 2. Se difunde el cultivo en un portaobjetos limpio y libre de grasa que debe tener un área de alrededor 10mm x 30mm. Poner en fuego retirado el portaobjetos permitiendo así que se fije y se seque el frotis. 3. La fijación bacteriana en este caso se llevara a cabo por coagulación del citoplasma. 4. Se ponen unas pocas gotas (3 – 5) de solución negro sudan a una concentración de 0,3% p/v en etanol al 70% v/v. 5. Después de 5-10 minutos el etanol presente en el tinte se debe evaporar o se puede retirar el exceso cuidadosamente, empleando el borde de un pedazo de papel filtro. 6. Inmediatamente después se sumerge el portaobjetos en xileno (di-metilbenceno) por 10 segundos, teniendo la precaución de las reglas de seguridad de este compuesto dada a su alta volatilidad por la presencia de gases tóxicos. Esperar a que el xileno se seque. 7. Posteriormente se debe usar un colorante de contraste como la solución de safranina. 8. Después de 10 segundos enjuagar suavemente el portaobjetos bajo una corriente de agua, y se deja secar de nuevo. 9. Después de completamente seco el portaobjetos se añade una gota de aceite de inmersión y se pone bajo el lente 100X de microscopio. Los gránulos de PHA’s son detectados como incrustaciones muy oscuras dentro de las células de color rosa (Practical Biotechnology). 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 6.1. DETECCIÓN DE GRÁNULOS DE PHA POR TINCIÓN NEGRO SUDAN La técnica de tinción, Negro Sudán, resultó ser la herramienta de estudio base para continuar con el desarrollo de este trabajo de grado, a partir de la cual se determinó en cada tiempo de muestreo de esta forma evaluar la única variable respuesta de interés (producción de polihidroxialcanoatos). A partir de la microscopia electrónica realizada a T. consotensis en estudios previos, se evidenció la presencia de inclusiones citoplasmáticas de carácter lipídico lo cual sugería la formación de gránulos de PHAs. Esto fue confirmado con la coloración realizada bajo condiciones nutricionales óptimas para el crecimiento de la cepa (glucosa 20mM, NH4Cl 1,05g/L y NaCl 5g/L) donde se detectó la presencia de estos gránulos. Esta evidencia fue soportada utilizando Ralstonia picketti como control positivo (figura 5) y Escherichia coli como control negativo. 23 Célula de Contraste color Rosa (Safranina) Gránulo PHA con Negro Sudan 6.1.1. Figura 5. Detección de gránulos de PHA, por coloración con Negro Sudan en control positivo (Ralstonia Picketti) 6.2. DETECCIÓN DE GRÁNULOS DE PHAs CON RESPECTO AL TIEMPO DE CRECIEMIENTO. Los PHAs se sintetizan y acumulan en el interior de las células en la mayoría de las bacterias en una condición de crecimiento desfavorable, tales como la limitación de nitrógeno, fósforo, oxígeno o magnesio y cuando la fuente de carbono de origen se encuentra en exceso. (Ojumu et al. 2004) Sin embargo, la producción de los gránulos en T. consotensis se identificó sin utilizar alguna estrategia nutricional que estimulara la producción del polímero o que llevara a la cepa a condiciones de estrés que promoviera la acumulación de la fuente de carbono como material de reserva y/o energía. Aunque las estrategias nutricionales mencionadas anteriormente, son utilizadas para simular las condiciones que conducen a la producción eficiente de PHA, se ha reportado que algunas bacterias como A. eutrophus, A. latus y la cepa mutante de Azotobacter vinelandii tienen la capacidad de acumularlos durante su crecimiento, como podría llegar a ser el caso de la cepa T. consotensis (Yu, 2001; Du et al. 2001; Du y Yu, 2002). A partir de la cinética de crecimiento realizada para T. consotensis en condiciones óptimas y en agitación, se determinó que su fase exponencial inició en la hora 8 de crecimiento hasta la hora 18, donde comenzó la fase estacionaria. Durante la cinética evaluada se realizó la tinción de Negro Sudan cada dos horas por 24 horas de muestreo. Se observó la detección del polímero a partir de la hora 6, al inicio de la fase exponencial (Figura 6), lo cual posiblemente indica que la cantidad detectada está relacionada de manera directa con el aumento de la biomasa, y que 24 los mecanismos involucrados en la producción de PHAs,, probablemente generaron influencia a partir de la hora 6 aproximadamente. Crecimiento y Produccion de gránulos de PHA's 4 4,500 4,000 3 LN (X/Xo) 3,500 3,000 2,500 2 2,000 1,500 1 1,000 0,500 0,000 Produccion granulos PHA 5,000 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Tiempo (Horas) Crecimiento cepa T. consotensis Produccion granulos PHA y = 0,191x + 0,0381 R² = 0,947 Lineal (Crecimiento cepa T. consotensis) 6.2.1. Figura 6. Cinética de crecimiento (Densidad óptica λ= = 580nm ) de la cepa Tistlia consotensis y producción de gránulos de PHA con respecto al tiempo de crecimiento, por 24 horas de muestreo, en condiciones físicas y nutricionales óptimas de crecimiento. La figura 6,, muestra el aumento de producción de PHAs en cada tiempo de muestreo (13 muestras) junto al aumento de biomasa, durante 24 horas de crecimiento. En la hora 6 se identificó el punto de partida de detección del polímero, con una cantidad de gránulos presentes por campo no mayor a 1. (Tabla 1) 1 que se mantuvo hasta la hora 8, en la cual comenzó a aumentar la biomasa y por consiguiente consiguiente la detección del polímero hasta la hora 14, donde no se evidencio un aumento tanto de biomasa como de gránulos presentes por campo de muestra. Lo que conduce a pensar que los gránulos son movilizados y metabolizados metaboli como fuente de energía y carbono una vez que la l limitación de nutrientes se ve disminuida en el medio (Heok, 2009). A partir del comportamiento observado se determinó la hora 12 como el tiempo máximo requerido para la formación del polímero, y este tiempo de crecimiento se utilizó para evaluar la presencia de gránulos en condiciones de estrés nutricional en T. consotensis. 25 En conclusión es importante tener en cuenta que existen varios factores que deben ser considerados en la producción los PHAs, frente a la evaluación con el comportamiento de crecimiento de la cepa, tales como la capacidad de la célula para utilizar la fuente de carbono, la tasa de crecimiento, la velocidad de síntesis del polímero y la acumulación máxima de éste, sobre la base del sustrato (Ojumu et al. 2004). Lo que refleja que es posible que la cepa, mejore el rendimiento en cuanto a la producción de PHAs siempre y cuando se aumente la velocidad de crecimiento mediante el estudio en la utilización de otra fuente de carbono frente a la producción de PHAs. 6.3. ANOVA. ANALISIS DE VARIANZA PARA EL MODELO FACTORIAL. En este trabajo, el efecto de los diferentes nutrientes y las condiciones de cultivo, se evaluaron con el objetivo de observar la influencia de estos factores nutricionales en la producción de PHAs por T. consotensis y la detección de los gránulos. Esto se realizó mediante un modelo estadístico de diseño factorial (3x3x2), que determinó el grado de influencia de cada uno los factores evaluados (fuente de carbono, fuente de nitrógeno y concentración de sal) y integración de los mismos. Los resultados obtenidos se analizaron para validar los efectos principales sobre la variable respuesta (producción de gránulos de PHAs) y comprobar que la variación observada en los resultados es debida a un efecto real de cada factor y no al error experimental. (Ferré, 2003) Que para efectos del estudio el programa Design-Expert arrojó los siguientes resultados. Tabla 3. Análisis de varianza. 6.3.1. Source Sum of DF Mean square F Value Prob > F Squares Model Significant 17.28 13 1.33 14.95 < 0.0001 A 10.11 3.00 1.50 2.22 0.11 0.33 3.56 1.56 2.00 20.83 2 2 1 4 2 2 40 4 36 53 5.06 1.50 1.50 0.56 0.056 0.17 0.089 0.39 0.056 56.87 16.88 16.88 6.25 0.62 1.87 < 0.0001 < 0.0001 0.0002 0.0005 0.5404 0.1666 7.00 0.0003 B C AB AC BC Residual Lack of fit Pure Error Cor Total 26 The Model F-value of 14.95 implies the model is significant. There is only a 0.01% chance that a "Model F-Value" this large could occur due to noise. Values of "Prob > F" less than 0.0500 indicate model terms are significant. In this case A, B, C, AB are significant model terms. Values greater than 0.1000 indicate the model terms are not significant. If there are many insignificant model terms (not counting those required to support hierarchy), model reduction may improve your model. The "Lack of Fit F-value" of 7.00 implies the Lack of Fit is significant. There is only a 0.03% chance that a "Lack of Fit F-value" this large could occur due to noise. Significant lack of fit is bad -- we want the model to fit. La interpretación del ANOVA determinó que: “F-valor” de 14,95 implica que el modelo es significativo. Determinando que existe una posibilidad de 0.01% de que el "Modelo F-valor" de este tamaño pueda ocurrir debido al error. En síntesis el resultado del análisis demuestra que los datos se ajustan al modelo estadístico, mediante el valor F, que evalúa dentro de un análisis de varianza que los valores esperados de una variable cuantitativa en varios grupos definidos previamente se diferencian entre sí. (González Ed. 2006) Los valores de "Prob> F" menor que 0,0500 indican que los términos del modelo son significativos. Para este caso A (fuente de Carbono), B (fuente de nitrógeno), C (Concentración de sal) y AB (Relación fuente de carbono vs fuente de nitrógeno) son términos significativos del análisis de varianza. Frente a la interpretación de la respuesta esperada, justifica, que los datos obtenidos predicen que el comportamiento de estos factores deben ser altamente considerados para la cuantificación de la variable respuesta, (producción de gránulos de PHA’s) En cuanto a los factoeres que presentan valores superiores a 0.1000, no son significativos y no influyen en la variable respuesta, como la relación AB (fuente de carbono y concentración de sal) y la relación AC (fuente de nitrógeno y concentración de sal). 6.3.2. Tabla 4. Resultados estadísticos Análisis de Varianza Std. Dev. Mean C.V. PRESS R – Squared Adj R – Squared Pred R – Squared Adeq Precision 0,30 1,94 15,33 6,48 0,8293 0,7739 0,6890 15,370 El análisis de varianza estadístico determinó que el comportamiento de los resultados obtenidos (a partir de la coloración con Negro Sudán) señalo una baja dispersión de los datos y la linealidad de los mismos es cercana a 0,9 lo que puede predecir un resultado satisfactorio 27 muy cercano a la realidad, a la hora del análisis de los datos bajo un modelo estadístico de diseño factorial. 6.3.3. EFÉCTO DE LA CONCENTRACION FUENTE DE SAL DE CARBONO, EVALUADOS, FUENTE DE NITROGENO SOBRE LA PRODUCCION Y DE GRÁNULOS DE POLIHIDROXIALCANOATOS La evaluación de la interacción entre los factores evaluados (fuente de carbono, fuente de nitrógeno y concentración de sal) determino el grado de influencia de cada uno de ellos sobre la variable respuesta (producción de gránulos de polihidroxialcanoatos), por lo tanto como ya se ha mencionado numerosos factores afectan la producción del polímero, tales como la concentración de sustratos, relación carbono-nitrógeno e incluyendo factores que no se tienen bajo control en este estudio, como el pH, temperatura, agitación y tasa de aireación, de forma similar a cualquier tipo de fermentación (Grothe et al, 1999; Du et al, 2001; Du y Yu, 2002). La manipulación de la condiciones en la fuente de carbono y nitrógeno (siendo las más reportadas) y la concentración de sal en el medio básico, para el crecimiento óptimo de T. consotensis, se han utilizado en este estudio para promover la detección del polímero. Pues como ya se mencionado en la revisión, las inclusiones intracelulares correspondientes a gránulos de PHAs, son producidos en condiciones nutricionales no balanceadas. La relación de estos factores: A, concentración de glucosa y B, concentración de cloruro de amonio así como los diferentes niveles evaluados (concentración de cloruro de amonio) (B1, B2 y B3) para cada uno fue graficado por el software de análisis utilizado, (Expert – Design) y se puede evaluar a continuación. 28 DESIGN-EXPERT Plot Interaction Graph B: Cloruro de amonio Granulos 3.2725 X = A: Glucosa Y = B: Cloruro de amonio Design Points 2.70438 Granulos B1 0,2625 B2 0,5250 B3 0.7875 Actual Factor C: NaCl = 5 6 2.13625 6 12 3 1.56813 1 3 30 40 50 A: Glucosa 6.3.3.1. Figura 7. Interacción entre el factor A: Fuente de carbono (Glucosa) y el factor B (Cloruro de amonio) Para la interpretación de la variable respuesta, correspondiente a la producción de gránulos de PHA en los factores A (glucosa) y B (Cloruro de amonio) bajo tres niveles diferentes, se evidenció que la mayor producción de gránulos está dada a un concentración de glucosa de 50mM, junto con el nivel B1 que corresponde a la menor concentración de cloruro de amonio (0,2625g/L), la grafica también demuestra que la menor concentración de glucosa (30mM) junto con la mayor concentración de cloruro de amonio (0,7875g/L) también influye de manera negativa en la producción de los gránulos, lo que confirma que la relación carbono – nitrógeno está directamente relacionada en la producción. Esto es sustentado por la teoría explicada por diferentes autores, que cuando los suministros de nutrientes están desequilibrados, es ventajoso para las bacterias ya que estas tienen la capacidad de almacenar el exceso de nutrientes dentro de la célula. (Madison y Huisman, 1999; Berlanga et al. 2006; Ojumu et al.; Du y Yu, 2002). 29 Sólo unos pocos PHAs pueden ser sintetizados a partir de carbonos simples, tales como ácidos grasos o la glucosa. Teniendo en cuenta que los PHA son sintetizados por polimerización de coenzima A (CoA), podría ser posible concluir que en este caso la fuente de carbono (glucosa) es el precursor más importante (figura 6) en la producción de acetil CoA, teniendo en cuenta que el sustrato utilizado (glucosa) hace parte del grupo de los carbohidratos y que la síntesis de PHAs este mediada por la consecuente producción de acetoacetil CoA, para que posteriormente se produzca (R) – 3 – hidroxiacil CoA y finalmente el polihidroxialcanoato. Cuyas reacciones se deben llevar a cabo por las enzimas phaA, PhaB y PhaC (Figura 1). Al parecer podrían ser activadas ante el exceso de glucosa en limitación de cloruro de amonio, lo que genera una condición desbalanceada. DESIGN-EXPERT Plot Interaction Graph C: NaCl Granulos 3.2725 X = A: Glucosa Y = C: NaCl 6 Design Points 2.70438 Granulos C1 5 C2 23 Actual Factor 2.13625 B: Cloruro de amonio = 0,2625 5 8 1.56813 1 30 40 50 A: Glucosa 6.3.3.2. Figura 8. Interacción entre el factor A: Fuente de carbono (Glucosa) y el factor C: Concentración de sal. 30 En cuanto a la relación entre los factores de concentración de sal y glucosa, (C y A). La concentración de sal, no muestra participación en el proceso de producción, ya que es posible observar en la figura 8, que tanto la menor como la mayor detección de gránulos se ve reflejada cuando la concentración de glucosa es igual a 30 y 50mM respectivamente, mientras que la influencia de la concentración de sal está siendo arrastrada, de acuerdo al aumento en la concentración de glucosa. De igual forma la relación entre la concentración de sal y el cloruro de amonio (C y B) no se determinó como un factor fuerte en la influencia de producción del polímero dado que en el análisis conjunto entre la figura 9 y la figura 7, es posible analizar que la mayor detección de gránulos esta marcado, cuando la concentración de cloruro de amonio es baja (0,2625g/L) y esta detección se ve disminuida cuando la concentración de NH4Cl aumenta. Concluyendo que la limitación de nitrógeno en el medio de cultivo es una de las causas que favorecen la biosíntesis de estos polímeros, ya que al producirse el desbalance nutricional y la condición de estrés, la síntesis de proteínas y el metabolismo celular se ven impedidos y se podría pensar que esta condición de ausencia, activa un mecanismo de defensa para lo que genera un factor respuesta al generar reserva de energía (Castillo 2008). Sin embargo es importante mencionar, que aunque la condición salina no representa un factor que influya en la producción del polímero, si representa una ventaja industrial, debido a que la extracción del gránulo por choque osmótico en células halófilas disminuye costos de producción cercanos al 60% (Quillaguamán et al 2010). Este proceso por medio utilización de agua en bajas concentración salina, genera la lisis celular permitiendo la liberación del gránulo. 31 DESIGN-EXPERT Plot Interaction Graph C: NaCl Granulos 3 X = B: Cloruro de amonio Y = C: NaCl Design Points Granulos C1 5 C2 23 Actual Factor A: Glucosa = 30 2.37632 5 3 1.75264 1.12895 3 6 0,5250 0.7875 0.505273 0,2625 B: Cloruro de amonio 6.3.3.3. Figura 9. Interacción entre el factor B: Fuente de Nitrógeno (Cloruro de amonio) y el factor C: Concentración de sal. En el trabajo de Quillaguamán y colaboradores en el 2007, desarrollaron la optimización de Halomonas boliviensis para la producción de polihidroxibutirato por medio de un diseño factorial que involucraba diferentes fuentes de nitrógeno y la utilización de sacarosa como fuente de carbono y determinaron que las altas concetraciones de este causaban una efecto positivo en la producción del polímero debido a la condición de estrés generado y la activación de mecanismos que permitieron la acumulación del exceso. En sintesis la fuente de carbono marcó la pauta principal en la producción de polihidroxialcanoatos en T. consotensis, dado que, como se ha analizó anteriormente, la mayor concentración de este, garantiza el estrés de la célula, lo que promueve la acumulación de gránulos en el interior, mediante la vía de glucolisis y la posible que la producción de Acetil – CoA, entendiendo que este es el principal precursor para la síntesis de polihidroxialcanoatos. Sin embargo se recomienda que otros factores físicos 32 sean evaluados y controlados para determinar la influencia en la producción del polímero y complementar una lista de factores que intervengan en el proceso. 7. CONCLUSIONES. • La detección de los PHAs se encontró entre la hora 6 y la hora 18 de crecimiento en condiciones optimas en la cepa Tistlia consotensis USBA 355. • La condición de estrés con mayor influencia en la detección de gránulos de PHA se observó con la mayor concentración de glucosa evaluada y la menor concentración de cloruro de amonio. 8. RECOMENDACIONES. • Para la complementación de este trabajo, es necesario hacer una cuantificación de los gránulos de PHAs producidos en los factores evaluados que arrojaron respuestas favorables. • Evaluar rangos menores de salinidad a los evaluados. • Detección de genes PHA sintasa. 33 9. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS BARBOSA M., ESPINOSA A., MALAGÓN D., MORENO N. 2005. Producción De Poli-B Hidroxibutirato (Phb) por Ralstonia eutropha ATCC 17697. Universitas Scientiarum, Vol. 10 pp. 45 - 54 BLACH W., FOX G., MAGRUM F., WOLFE R. 1979 Methanogens: Revaluation of a unique biological group. Microbiol Rev. Vol. 43 pp. 260 – 296. CASTILLO F. 2008. Efecto del gen FadH1en la producción de PHA conteniendo monómeros insaturados por Pseudomonas putida. Trabajo de grado para optar al título de Microbiólogo Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de ciencias. CRABTREE K., McCOY E., BOYLE W., & ROHLICH G. 1965. Isolation, Identification, and Metabolic Role of the Sudanophilic Granules of Zoogloea ramigera1. Applied microbiology Vol. 3 (2) pp. 218 – 226. DIAZ CARDENAS C., PATE B.K.C. & BAENA S. 2010. Tistlia consotensis gen. nov., p. nov., an aerobic, chemeoheterotrophic, free living, nitrogen fixing alphaproteobacterium, isolated from a Colombian saline spring. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. Vol 60 pp. 1437 – 1443. DU G. AND YU J. 2002. Green Technology for Conversion of Food Scraps to Biodegradable Thermoplastic Polyhydroxyalkanoates. Environ. Sci. Technol., Vol. 36 (24), pp. 5511–5516. ERAZO E., ROSALES S., ORTÍZ F., y ÁLAVA C. 2009. Informe final Proyecto: “bioprospeccion de microorganismos productores de phas y acidos grasos de interes industrial aislados del lago Guamuez en el departamento de Nariño. Universidad Nacional Abierta y a Distancia, UNAD. Pasto. Colombia. FULL T., JUNG T & MADIGAN M. 2006. Production of poly-b-hydroxyalkanoates from soy molasses oligosaccharides by new, rapidly growing Bacillus species. Journal compilation, The Society for Applied Microbiology, Letters in Applied Microbiology. Vol. 43 pp. 377–384. da GONZÁLEZ M. MIGUEL. Ed. 2006. Bioestadística amigable, 2 Edicion, Ediciones Diaz de Santos, Madrid, España. 919 p. HOFFMANN N., STEINBÜGHEL A., REHM BHA. 2000. The Pseudomonas aeruginosa phaG gene product is envoved in the synthesis of polyhydroxyalkanoic acid consisting of medium – 34 chain – length constituents from non-related carbon sources. FEMS Microbiol. Biotehnol. Vol. 184. pp. 253 – 259. JOSHI, P. & JAYSAWAL, S. 2010. Isolation and characterization of poly βhydroxyalkanoate producing bacteria from sewage sample. Journal of Cell and Tissue Research Vol. 10(1) pp. 2165-2168. KENNETH L. BURDON. 1946. Fatty material in bacteria and fungi revealed by staining dried, fixed slide preparations. Department of Bacteriology and Immunology, Baylor University College of Medicine, Houston, Texas. KIM HEOK. 2008. Biosynthesis and characterization of Polyhydroxyalkanoates by a locally Isolated chromobacterium sp. Usm2. Thesis submitted in fulfillment of the requirements for the degree of Master of Science. Universiti Sains Malaysia. KHANNA S., AND SRIVASTAVA A. 2005. Recent advances in microbial polyhydroxyalkanoates. Process Biochemistry. Vol 40 pp. 607–619 LARA MADISON & GJALT HUISMAN. 1999. Metabolic Engineering of Poly(3 Hydroxyalkanoates): From DNA to Plastic. Microbiology and molecular biology reviews. Vol.: 63 No 1. Pp. 21 – 53. MARTINEZ JORGE; RODRIGUEZ MAYLEN; FERNANDEZ ANA; VILLAVERDE MARIO; LOPEZ ALEJANDO; MARIN DANIESYI; NUÑES ROBERTO; GALEGO NORMA; CARBALLO MARIA. 2004. Produccion de polihidroxialcanoatos en bacterias diazotrofas. Influencia de la aeración en la síntesis de poli β hidroxibutirato en azospirillum brasilense cepa 7. Habana – Cuba. Revista Biología Vol. 18, (1) pp. 87 – 95. MUKHOPADHYAY M., PATRA & A.K. PAUL. 2005. Production of poly(3-hydroxybutyrate) and poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) by Rhodopseudomonas palustris SP5212. World Journal of Microbiology & Biotechnology. Vol 21 pp. 765–769. OJUMU T., YU J. & SOLOMON B. 2004. Production of Polyhydroxyalkanoates, a bacterial biodegradable polymer. African Journal of Biotechnology Vol. 3 (1), pp. 18-24. PANTAZAKI A., TAMBAKA M., LANGLOIS V., GUERIN F. AND KYRIAKIDIS D. 2003. Polyhydroxyalkanoate (PHA) biosynthesis in Thermus thermophilus: Purification and biochemical properties of PHA synthase. Francia, Molecular and Cellular Biochemistry Vol 254 pp. 173–183. 35 PÔTER MARKUS – STEINBÛCHEL ALEXANDER. 2006. Biogenesis and Structure of Polyhydroxyalcanoate Granules. Biochemistry Vol. 40 pp. 607–619. QIANG G. AND WU Q. 2005. The application of polyhydroxyalkanoates as tissue engineering materials. Biomaterials Review. Vol 26 pp. 6565–6578 QUILLIGUAMÁN JORGE; MUÑOZ MARLENE; MATTIASSON BO; HAITTI-KAUL RAJNI. 2007. Optimizing conditions for poly(β-hydroxybutyrate) production by Halomonasboliviensis LC1 in vbatch culture whit sucrose as carbon source. Rev. Apply Biotechnology Vol. 74 pp. 981 – 986. QUILLAGUAMÁN J., GUZMÁN H., VAN-THUOC D & HATTI-KAUL R. 2010. Synthesis and production of polyhydroxyalkanoates by halophiles: current potential and future prospects. Appl Microbiol Biotechnol. Vol 85 pp. 1687–1696. REHM B., 2003. Polyester synthases: natural catalysis for plastics. Biochem. J. Vol. 376 pp. 15 – 33. ROZSAL CHAVATI, DUPEYRON DANAY, GALEGO NORMA, CYRAS VIVIANA y VAZQUEZ ANALÍA. 2004. Miscibilidad de mezclas poliméricas de polihidroxialcanoatos. Revista Iberoamericana de Polímeros. Vol. 5 (2) pp. 56 – 66. SALMIATI Z. UJANG, M.R. SALIM, G. OLSSON 2009. Recovery of Polyhydroxyalkanoates (PHAs) from Mixed Microbial Cultures by Simple Digestion and Saponification. Institute of Environmental and Water Resource Management (IPASA), Universiti Teknologi Malaysia. STEINBÜCHEL A. & EVERSLOH T. 2003. Metabolic engineering and pathway construction for biotechnological production of relevant polyhydroxyalcanoates in microorganisms. Biochen. Eng. Vol 16, pp. 81 – 96. STEINBUCHEL, A. 1996. PHB and other polyhydroxyalkaoic acid. In: REHM H. Dr. & REED G. Dr. Biotechnology: Products of Primary Metabolism, Volume 6, Second Edition. REVELO D., GROSSO M.V., MORENO N., MONTOYA D. 2007. A most effective method for selecting a broad range of short and medium chain-length polyhidroxyalcanoate producing microorganisms. Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458 Vol.10 (3) pp. 348 – 357. 36 SURIYAMONGKOL P., WESELAKE R., NARINE S., MOLONEY M., SHAH S. 2007. Biotechnological approaches for tha production of polyhydroxyalkanoates in microorganisms and plant. Review Biotechnology Advances. Vol: 25 pp.148 – 175. UCHINO K., SAITO T. AND JENDROSSEK D. 2008. Poly(3-Hydroxybutyrate) (PHB) Depolymerase PhaZa1 Is Involved in Mobilization of Accumulated PHB in Ralstonia eutropha H16. Applied and Environmental Microbiology. Vol. 74 (4) pp. 1058–1063. USMAN ARSHAD, NAZIA JAMIL, NIGHAT NAHEED & SHAHIDA HASNAIN. 2007. Analysis of bacterial strains from contaminated and non-contaminated sites for the production of biopolymers. African Journal of Biotechnology Vol. 6 (9) pp. 1115-1121. VISHNUVARDHAN S., THIRUMALA M., KISHORE REDDY T. AND MAHMOOD S. 2008. Isolation of bacteria producing polyhydroxyalkanoates (PHA) from municipal sewage sludge. World J Microbiol Biotechnol. Vol. 24 pp. 2949–2955. VOLOVA; KALACHEVA;GORBUNOVA & ZHILA. 2004, Dynamics of Activity of the Key Enzymes of Polyhydroxyalkanoate Metabolism in Ralstonia eutropha B5786. Rev: Applied Biochemistry and Microbiology, Vol. 40, ( 2) pp. 170–177. XUAN JIANG , JULIANA A. RAMSAY, BRUCE A. RAMSAY. 2006. Acetone extraction of mclPHA from Pseudomonas putida KT2440. Journal of Microbiological Methods Vol: 67 pp. 212– 219. 37