CUANTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS TOTALES EN HARINAS RESIDUALES DE LA EXTRACCIÓN DE ACEITE DE COPERNICIA ALBA MORONG. Gorostegui, Horacio A.a,b,*, Mufari, Jesica R.b, Orrabalis, Camilo J.a,b, Guzmán, Carlos A.b y Calandri, Edgardo L.b a Universidad Nacional de Formosa. Av. Gob. Gutnisky 3200. Formosa 3600, Argentina b ICTA-Fac. Cs. Ex. Fís. y Nat.-UNC, Córdoba, 5016 - Argentina *Autor a quien dirigir la correspondencia: gorostegui_41@hotmail.com Resumen La palma blanca o caranday (Copernicia alba Morong) es una especie abundante en la zona este de la provincia de Formosa. La semilla posee cerca de un 20% p/p de aceite que, al separarse mecánicamente, deja una cantidad considerable de residuos de prensado y de pericarpio (cáscara), los cuales poseen 7% p/p y 8% p/p de proteínas, respectivamente. Estos residuos se molieron y a las harinas obtenidas se las sometieron a hidrólisis ácida (HCl 6 M) y alcalina (Ba(OH)2 saturada), de manera sucesiva y en reflujo. Los residuos obtenidos se trataron con etoximetilenmalonato de dietilo en buffer borato (pH=9) por 50 minutos y con calor, a fin de obtener los aminoácidos derivatizados. Finalmente, 20 µL de cada muestra se inyectó en un equipo HPLC (Perkin Elmer 200) con columna de fase reversa (Sorbax C18) y detector UV-visible (280 nm). Tanto el pericarpio como el residuo de prensado presentaron todos los aminoácidos, destacándose histidina (5,94% p/p y 7,26% p/p, respectivamente) y valina (4,28% p/p y 5,25% p/p, respectivamente), con valores que superaron a los recomendados por la OMS para estos aminoácidos esenciales. El puntaje químico indicó que, tanto para el pericarpio como para el residuo de prensado, metionina y cisteína resultaron ser los aminoácidos limitantes. Estos resultados posibilitarían el empleo de cáscaras y residuos de extracción como materia prima para elaborar aislados proteicos o bien, en preparaciones alimenticias. Palabras clave: Copernicia alba; aminoácidos; pericarpio; residuo de prensado. Introducción La palma caranday, Copernicia alba Morong, es una especie que pertenece a la familia de las palmáceas. En la provincia de Formosa habita fundamentalmente en las zonas húmedas y también en áreas de depresiones o bañados de las zonas semiáridas. Se lo conoce en la región de acuerdo a su grado de madurez como palma blanca, colorada o negra, según el color que presenta su leño. (Sánchez et al, 2008). Su fruto es una drupa, negra y ovoide, cuando madura puede alcanzar de 1,5 a 2 cm de longitud, usualmente de una sola semilla, muchas veces fibrosa. Las semillas también son ovoides y germinan fácilmente (Dimitri, 1977). Tradicionalmente su estípite ha sido utilizado en construcciones rurales, aunque en la actualidad se han comenzado a producir con él muebles y pisos, aprovechando su calidad, coloreado y veteado particular (Monzón et al, 2008), mientras que sus hojas se destinan a la fabricación de productos artesanales. Actualmente no existe uso alguno para sus frutos, aunque hay vagas referencias de un empleo comestible de estos (Ministerio del Ambiente y Desarrollo Sustentable). El contenido de aceite de su semilla se encuentra entre el 15 al 20% y en nuestro grupo hemos logrado extraerlo mediante prensado en frío (Gorostegui et al, 2012), generándose residuos en dicho proceso, con potenciales usos industriales. Por lo antes expuesto, en el presente trabajo nos propusimos determinar el perfil aminoacídico de dichos residuos de extracción, del aceite de semillas de Copernicia alba Morong a los fines de establecer el valor de las proteínas que estos poseen y que permitirían sugerir posibles usos para las tortas residuales. Materiales y Métodos Acondicionamiento del material vegetal Se secaron los frutos en un horno de circulación forzada, dispuestos sobre bandejas metálicas, en cantidad de 3 kg por bandeja y a temperaturas entre 80 y 100°C, durante alrededor de 4 horas. Cada 30 minutos se realizó un pesaje por bandeja hasta alcanzar peso constante. Para la separación de las semillas se empleó un molino de discos marca Braun, modelo U.A. 53, Motor 2 HP, Fuerza Centrífuga Relativa 302 G. Esta acción permitió liberar a las semillas del pericarpio, el cual se separó mediante un tamiz de malla 5. De las semillas se extrajo el aceite, en condiciones de temperatura y humedad controladas, mediante una prensa de tornillo (IBG Monforts Oekotec CA59G), a escala piloto. La obtención de las harinas, tanto del residuo pericarpiano como del residuo de prensado, se realizó utilizando un molino de martillo marca Fritsch, motor 1,5 HP, Fuerza Centrífuga relativa 636 G, y un tamiz de 0,25 mm. Determinación del perfil aminoacídico: se empleó el procedimiento descripto por Mufari, 2011. Hidrolisis de harinas Hidrólisis ácida: se peso 1 g de harina desengrasada en un balón y se adicionaron 50 mL de acido clorhídrico 6 M, se calentó a reflujo por 24 hs, en un manto de calentamiento. Método oficial de análisis de AOAC Internacional, 994.12. Hidrolisis alcalina: se peso 1 g de harina desengrasada en un balón y se adicionaron 50 mL de una solución saturada de hidróxido de bario, se coloco a reflujo por 8 hs, en un manto de calentamiento (Comai et al, 2007). Una vez concluidas ambas hidrólisis, se dejo enfriar hasta alcanzar la temperatura ambiente, luego se las trasvasó a tubos cónicos de centrifuga, y se centrifugaron por 15 minutos a 3000 rpm (1006 G). El sobrenadante se conservo en cámara fría a 5 ± 1° C, hasta el momento de realizar el análisis por HPLC. Perfil de aminoácidos Se determinaron y cuantificaron los aminoácidos presentes en la muestras mediante cromatografía liquida de alta resolución. Para tal fin se utilizo un equipo HPLC Perkin Elmer 200, equipado con un detector UV-visible y una columna Zorbax Eclipse Plus C18 (Agilent Technologies). Derivatización: un volumen conocido de los hidrolizados proteicos se coloco en un tubo eppendorf y se llevó a sequedad en una estufa con circulación de aire forzada (Dalvo) a 40-50 °C, aproximadamente por 12 horas. Se resuspendió la muestra con 1 mL de buffer borato 1 M (pH=9) que contiene 0,02% de azida de sodio. Se adicionaron 0,8 μL de etoximetilenmalonato de dietilo, se colocaron los tubos eppendorf cerrados en un baño a 50 °C por 50 minutos, agitando cada 5 minutos los tubos con un vortex. Los derivados obtenidos N-[2,2- bis (etoxicarbonil) vinil] de los aminoácidos, fueron conservados a temperatura ambiente hasta su inyección (Alaiz et al,1992). Cromatografía Fueron inyectados 20 μL de cada muestra, la resolución de los derivados de aminoácidos se logro usando un sistema de gradiente binario, empleando como fase móvil: (A) buffer acetato de sodio 25 mM (pH=6) y (B) acetonitrilo, con un flujo de 0,9 mL/min a temperatura ambiente. Los derivados fueron detectados a 280 nm. Se empleo el siguiente programa de elución: 0,5 min equilibrio con A:B (91:9), 1,5 min gradiente lineal a A:B (86:14), 7,5 min elución con A:B (86:14) (solo en este tiempo se utilizo un flujo de 0,7 mL/min), 8,5 min gradiente lineal a A:B (69:31), 2,5 min elución con A:B (69:31). Para la siguiente inyección la columna se reacondiciono por 4,5 min con un gradiente lineal a A:B (91:9) (Alaiz et al, 1992). Resultados y discusión En la tabla N°1 se muestran los resultados obtenidos. Se pudo establecer la existencia de 17 diecisiete aminoácidos, tanto en el pericarpio como en el residuo de prensado de la Palma Caranday, destacándose histidina, valina, glicina y fenilalanina (resaltados en la tabla). Tabla N° 1: Aminoácidos en harinas de pericarpio y residuo de prensado (gAA/ 100 g π) Aminoácidos Ác. Aspártico + Asparragina Ác. Glutámico + Glutamina Serina Histidina Glicina Treonina Arginina Alanina Prolina Tirosina Valina Metionina Cisteína Isoleucina Leucina Fenilalanina Lisina Pericarpio 6,58 ± 0,55 5,22 ± 0,93 2,94 ± 2,33 5,94 ± 0,77 4,02 ± 0,80 2,39 ± 0,47 3,07 ± 0,73 3,12 ± 0,56 0,54 ± 0,58 1,31 ± 0,30 4,28 ± 0,03 0,48 ± 0,14 0,95 ± 0,17 0,18 ± 0,04 2,16 ± 0,46 3,74 ± 0,78 2,30 ± 0,51 Res. de Prensado 7,99 ± 0,44 13,97 ± 2,12 6,41 ± 1,84 7,26 ± 0,61 4,01 ± 0,35 2,42 ± 0,26 9,28 ± 0,85 3,87 ± 0,36 2,76 ± 0,59 1,51 ± 0,14 5,25 ± 0,29 0,70 ± 0,17 1,18 ± 0,20 0,42 ± 0,04 2,48 ± 0,22 5,12 ± 0,45 3,35 ± 0,30 Valores expresados como (Media ± SD) n=6, en base seca. La hidrólisis ácida provoca la descomposición de asparragina y glutamina en los ácidos aspártico y glutámico, respectivamente, mientras que en medio alcalino esa hidrólisis no tiene lugar, permitiendo la determinación de ambos aminoácidos y sus respectivas amidas, por diferencia. En la tabla 2 se presenta el contenido de los ácidos aspártico y glutámico, asparragina y glutamina. Tabla N° 2: Contenido de ácidos aspártico y glutámico, asparragina y glutamina en harinas de pericarpio y residuo de prensado (gAA/ 100 g) Hidrólisis ácida Hidrólisis alcalina Ác. Ác. Aspártico + Glutámico + Asparragina Glutamina Pericarpio 6,58 ± 0,55 5,22 ± 0,93 Ác. Aspártico Diferencia entre hidrólisis Ác. Asparragina Glutámico 2,52 ± 0,15 2,63 ± 0,06 4,06 ± 0,7 Glutamina 2,59 ± 0,99 Residuo de 7,99 ± 0,44 13,97 ± 2,12 1,85 ± 0,03 3,82 ± 0,19 6,14 ± 0,47 Prensado Valores expresados como (Media ± SD) n=4, en base seca. 10,15 ± 2,31 En la tabla N° 3 se comparan los requerimientos de aminoácidos esenciales de las muestras con la proteína patrón indicado por la FAO/OMS, para niños de entre 2 y 5 años, grupo etario más exigente, se observa que tanto Histidina como Valina superan al patrón, además podemos decir que Isoleucina y Treonina presentan valores próximos al recomendado por estas organizaciones. Asimismo, los aminoácidos limitantes corresponden a los denominados azufrados (Metionina y Cisteína), aunque debemos decir que estos superan el 55% del valor recomendado. Tabla N° 3: Comparación entre los requerimientos de aminoácidos esenciales y los presentes en las muestras. mg de AA en π mg de AA en patrón* pericarpio Histidina Treonina Triptofano Valina Metionina + Cisteína Isoleucina Leucina Fenilalanina + Tirosina Lisina mg de AA en residuo 19 65 71 34 25 25 11 n/d n/d 35 46 50 25 14 16 28 22 25 66 43 49 63 41 47 58 36 40 *Patrón FAO/OMS para niños de 2-5 años Puntaje químico en pericarpio 342,11 73,53 131,43 56,00 78,57 65,15 65,08 62,07 en residuo 373,68 73,53 142,86 64,00 89,29 74,24 74,60 68,97 Conclusión Teniendo en cuenta que actualmente las semillas de la palma Caranday, no son aprovechados y que existe la posibilidad de extraer aceites de las mismas, es importante poder utilizar los residuos que se generan, y de acuerdo a estos resultados podríamos afirmar que los mismos posibilitarían el empleo de cáscaras y residuos de extracción como materia prima para elaborar aislados proteicos o bien, en preparaciones alimenticias. Referencias Alaiz, M.; Navarro, J. L.; Girón J. y Vioque, E. (1992) Amino acid análisis by highperformance chromatography alter derivatization with dietil ethoxymethylenemalonate. J. of Chromatogr., 591, 181-186. AOAC International. (1999) Official Methods of Analysis of the Association of Official Analysis Chemist. 16th Edition, 5th Revision, Gaithersburg, USA. Comai, S., Bertazzo, A., Bailoni, L., Zancato, M., Costa, C. V. L., Allegri, G. (2007) The content of proteic and nonproteic (free and protein-bound) tryptophan in quinoa and cereal flours, Food Chem.,100, 1350-1355. Dimitri, M. J. (1977). Enciclopedia argentina de agricultura y jardinería. Tomo I. Volumen I. Editorial ACME S.A.C.I. 3ra Edición. Bs As Argentina. 185 – 194. Gorostegui, H. A.; Orrabalis, C. J.; Guzmán, C. A. y Calandri, E. L. (2012) .Parámetros fisicoquímicos de frutos, pericarpios y semillas de Copernicia alba Morong, recolectados en la provincia de Formosa, Argentina. Natura Neotropicalis (Revista de la Asociación de Ciencias Naturales del Litoral y de la Facultad de Humanidades y Ciencias, Universidad Nacional del Litoral). Aceptado año 2012. Monzón, L.; Camera, R.; Gómez, M. (2008). Dinoderus minutus, taladrillo en Copernicia alba (palma blanca) apeada en la Provincia de Formosa. Resúmenes XI jornadas de ciencia y tecnología. Año 11. Nº 11. ISSN 1851 – 8923. Mufari , Jesica Romina. 2011. Determinación y cuantificación de proteínas solubles y de aminoácidos totales en harinas de Quinoa. FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS U.N.C. Ministerio del Ambiente y Desarrollo Sustentable http://www.ambiente.gov.ar/archivos/web/PBVyAP/File/A3/PIARFON%20PCHsa/PFNM%20.pdf. Fecha de última consulta: 03/05/2012. Sánchez, V.; Bogado, D.; Acosta, R.; Iribarren, R.; Oviedo, R.; Ferreiro, J.; Gon, V. (2008). Evaluación cuali-cuantitativa de palma caranday (Copernicia alba Morong) en la Provincia de Formosa. Resúmenes XI jornadas de ciencia y tecnología. Año 11. Nº 11. ISSN 1851 – 8923.