RESOLUCIÓN OIV/OENO 382D/2010 ACTUALIZACIÓN DEL COMPENDIO DE MÉTODOS INTERNACIONALES DE ANÁLISIS DE LAS BEBIDAS ESPIRITUOSAS DE ORIGEN VITIVINÍCOLA – Determinación de los compuestos α- dicarbonílicos de bebidas espirituosas de origen vitivinícola por cromatografía en fase gaseosa tras derivatización con 1,2-diaminobenceno. LA ASAMBLEA GENERAL VISTO el artículo 2 apartado 2b iv del acuerdo del 3 de abril de 2001 relativo a la creación de la Organización Internacional de la Viña y el Vino. VISTAS las acciones del plan estratégico de la OIV 2009-2012, en particular aquélla dirigida a reorganizar las publicaciones relativas a los métodos de análisis vitivinícolas. CONSIDERANDO los trabajos de la Subcomisión de Métodos de Análisis. VISTO el «Compendio de métodos internacionales de análisis de las bebidas espirituosas de origen vitivinícola» adoptado en 2009 DECIDE introducir dentro del«Compendio de métodos internacionales de análisis de las bebidas espirituosas de origen vitivinícola» el método siguiente. Certificado conforme Tiblisi, 25 de junio de 2010 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2010 DETERMINACIÓN DE LOS COMPUESTOS α-DICARBONÍLICOS DE BEBIDAS ESPIRITUOSAS DE ORIGEN VITIVINÍCOLA POR CROMATOGRAFÍA EN FASE GASEOSA TRAS DERIVATIZACIÓN CON 1,2-DIAMINOBENCENO Método de tipo IV 1. Introducción Los principales compuestos α-dicarbonílicos de los aguardientes de vino (Figura 1) son: glioxal, metilglioxal, diacetilo y pentano-2,3-diona. Glioxal: OCH−CHO (etanodial) Metilglioxal: CH3−CO−CHO (2-oxopropanal) Diacetilo: CH3−CO−CO−CH3 (butano-2,3-diona) Pentano-2,3-diona: CH3−CH2−CO−CO−CH3 Hexano-2,3-diona: CH3−CH2−CH2−CO−CO−CH3 Figura 1. Los principales compuestos α-dicarbonílicos de los aguardientes de vino, (la hexano-2,3-diona no está naturalmente presente pero se utiliza como patrón interno). Los compuestos dicarbonílicos son importantes debido a su impacto sensorial. 2. Ámbito de aplicación Este método se aplica a las bebidas espirituosas de origen vitivinícola para contenidos de compuestos carbonilados comprendidos entre 0,05 mg/l y 20 mg/l. 3. Principio El método se basa en la formación de derivados de tipo quinoxalina a partir de compuestos αdicarbonílicos con el 1,2-diaminobenceno (figura 2). R NH2 O C N R N R + NH2 O C R 1,2-Diaminobenceno Dicarbonilo Quinoxalina Figura 2. Formación de los derivados. Certificado conforme Tiblisi, 25 de junio de 2010 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2010 2/8 La reacción se produce en la bebida espirituosa diluida 1:4, a pH 8 y tras una duración de reacción de 3 h a 60 °C. El análisis de los derivados se efectúa tras su extracción con diclorometano por cromatografía en fase gaseosa, con una detección por espectrometría de masas (GC-MS) o mediante un detector específico de los compuestos nitrogenados. 4. Reactivos y productos 4.1 Compuestos dicarbonílicos 4.1.1 Glioxal (n° CAS 107-22-3) en solución al 40 % 4.1.2 Metilglioxal (n° CAS 78-98-8) en solución al 40 % 4.1.3 Diacetilo (n° CAS 431-03-8) de pureza > 99 % 4.1.4 Pentano-2,3-diona (n° CAS 600-14-6) de pureza > 97 % 4.1.5 Hexano-2,3-diona (n° CAS 3848-24-6) de pureza > 90 % 4.2 1,2-Diaminobenceno (n° CAS 95-54-5) en polvo, de pureza > 97 % 4.3 Agua para HPLC (según la norma EN ISO 3696) 4.4 Etanol (n° CAS 64-17-5) puro para HPLC 4.5 Hidróxido de sodio (n° CAS 1310-73-2) en solución 0,1 M. 4.6 Ácido sulfúrico (n° CAS 7664-93-9) en solución 0,2 M 4.7 Diclorometano (n° CAS 75-09-2). 4.8 Sulfato de sodio anhidro (n° CAS 7757-82-6). 4.9 Solución hidroalcohólica al 50 % vol. Mezclar 50 ml de etanol puro para HPLC (4.4) con 50 ml de agua (4.3) 4.10 Solución de patrón interno hexano-2,3-diona a 2,0 g/1 Colocar 40 mg de hexano-2,3-diona (4.2) en un vial de 30 ml, diluir en 20 ml de solución hidroalcohólica al 50 % vol (4.9) y agitar hasta que se disuelva completamente. 5. Instrumental 5.1 Cromatografía en fase gaseosa con detección por espectrometría de masas (GC-MS) o por medio de un detector específico de los compuestos nitrogenados. 5.1.1 Columna analítica capilar de polietilen-glicol medianamente polar (C 20M, BP21… ) con las características siguientes (a título de ejemplo) 50 m x 0,32 mm x 0,25 µm. 5.1.2. Sistema de adquisición de datos 5.2 Equipo de medición del pH Certificado conforme Tiblisi, 25 de junio de 2010 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2010 3/8 5.3 Agitador magnético 5.4 Balanza de precisión de 0,1 mg. 5.5 Horno capaz de ser ajustado a 60 °C 5.6 Material de vidrio de laboratorio, como por ejemplo: pipetas, viales con tapón de rosca de 30 ml y microjeringas. 6. Preparación de la muestra Diluya la bebida espirituosa a 1:4 en agua (4.3) 7. Modo operatorio Colocar 10 ml de bebida espirituosa diluída a 1:4 (6) en un vial de 30 ml (5.6) Ajustar a pH 8 mediante agitación, con hidróxido de sodio 0,1 M (4.5) Añadir 5 mg de 1,2-diaminobenceno (4.2) Añadir 10 µl de hexano-2,3-diona (patrón interno) a 2,0 g/1 (4.10). Cerrar el vial mediante un tapón de rosca provisto de una junta de teflón Agitar hasta disolución completa del reactivo (5.3) Colocar en el horno a 60 °C durante 3 h. (5.5) Enfríar. 7.1 Análisis 7.1.1 Extracción de las quinoxalinas - El medio de reacción, preparado en 7, se lleva a pH 2 mediante H2SO4 2M (4.6); - Extraer dos veces utilizando 5 ml de diclorometano (4.7) mediante agitación magnética durante 5 minutos; - Decantarla fase inferior cada vez; - Mezclar las dos fases de disolvente; - Secar sobre 1 g aproximadamente de sulfato de sodio anhidro (4.8); - Decantar. 7.1.2 Análisis cromatográfico (dado a título de ejemplo) - Detección. Para el análisis por GC-MS se ha acoplado un cromatógrafo en fase gaseosa Hewlett Packard HP 5890 a una chemstation y un espectrómetro de masas HP 5970 (impacto electrónico 70eV, 2,7 kV), Nota: puede utilizarse un detector específico de los compuestos nitrogenados - Columna. La columna es una BP21 (SGE, 50 m x 0,32 mm x 0,25 µm). Certificado conforme Tiblisi, 25 de junio de 2010 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2010 4/8 - Temperaturas. Las temperatura del inyector y del detector son, respectivamente, de 250 °C y 280 C; la del horno se mantiene a 60 °C durante 1min, y seguidamente se programa a razón de 2 C/min hasta alcanzar los 220 C, y la isoterma final dura 20 min. - Inyección. El volumen inyectado es de 2 µl y el tiempo de cierre de las válvulas del inyector (splitless) es de 30 s. 7.1.3 Análisis de las quinoxalinas formadas - Separación. El cromatograma de los derivatizados con 1,2-diaminobenceno de una bebida espirituosa según el método de selección de iones (SIM) aparece en la Figura 3. - Identificación de los picos. La utilización de la GC-MS ha permitido identificar los compuestos dicarbonílicos derivatizados de un aguardiente de vino utilizando el método de la corriente iónica total (scan), que permite obtener los espectros de masas de los derivados quinoxalínicos y compararlos con los memorizados en la biblioteca de espectros; además, se han comparado los tiempos de retención con los de los compuestos puros tratados del mismo modo. La tabla 1 muestra los iones principales de los espectros de masas de los compuestos dicarbonílicos derivatizados obtenidos. - Dosificación. La determinación cuantitativa de los compuestos dicarbonílicos se efectúa con el modo SIM, seleccionando iones M / Z = 76, 77, 103, 117, 130, 144, 158 y 171. Los iones M/Z = 76 y 77 se utilizan para la cuantificación y los otros como caracterizadores, esto es, glioxal: iones M/Z =103 y 130, metilglioxal: iones M/Z =117 y 144, diacetilo: iones M/Z = 117 y 158, pentano-2,3-diona: iones M/Z = 171 y hexano-2,3-diona: iones M/Z = 158 y 171. 7.1.4 Características del método Ciertos elementos de validación interna han sido determinados pero no se trata de una validación formal según el protocolo para la planificación , la realización y la interpretación de los estudios de rendimiento de los métodos de análisis (OIV 6/2000) - Repetibilidad . La repetibilidad del método mediante GC-MS-SIM muestra coeficientes de variación comprendidos entre 2% y 5% para los cuatro compuestos dicarbonílicos. - Tasa de recuperación. Las cantidades adicionadas a un aguardiente de vino se han recuperado con una tasa de recuperación superior al 94 %. - Linealidad. Se han obtenido correlaciones lineales en rangos de concentración comprendidos entre 0,05 y 20 mg/l. - Límite de detección. El límite de detección de la mayoría de los productos dicarbonílicos derivatizados es de 0,05 mg/l. Certificado conforme Tiblisi, 25 de junio de 2010 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2010 5/8 Tabla 1. Espectros de masas (ión m/z (intensidad del ión molecular respecto a la del pico de base) de los derivados de compuestos dicarbonílicos por 1,2-diaminobenceno Compuesto dicarbonilado Derivado Espectro de masas (principales iones y abundancia) Glioxal Quinoxalina 130 (100), 103 (56.2), 76 (46.8), 50 (20.2), 75 (10.4), 131 (9.4) Metilglioxal 2-Metilquinoxalina 144 (100), 117 (77.8), 76 (40.5), 77 (23.3),50 (21.9), 75 (11.3), 145 (10.3) Diacetilo 2,3-Dimetilquinoxalina 117 (100), 158 (75.6), 76 (32.3), 77 (23.1), 50 (18.3), 75 (10.4) Pentano-2,3-diona 2-Etil-3-metilquinoxalina 171 (100), 172 (98), 130 (34.1), 75 (33.3), 77 (21), 50 (19.4), 144 (19), 143 (14.1), 103 (14) Hexano-2,3-diona 2,3-Dietilquinoxalina 158 (100), 171 (20.1), 76 (13.7), 77 (12.8), 159 (11.4), 157 (10.8), 50 (8.1) 106 Certificado conforme Tiblisi, 25 de junio de 2010 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2010 6/8 Abundance 5 Colonne polaire 3200 3000 1 2800 2600 2400 2200 2 2000 1800 1600 3 1400 1200 1000 800 600 4 400 52.00 54.00 56.00 58.00 60.00 62.00 64.00 66.00 68.00 Time--> Figura 3. Cromatograma en fase gaseosa del extracto de los compuestos dicarbonílicos derivados por 1,2-diaminobenceno de un aguardiente de vino, detectados por espectrometría de masas seleccionando los iones m/z =76, 77, 103, 117, 130, 131, 144, 158, 160 y 171. Columna BP21, 50m -X 0,32mm 0,25 µm. Temperatura de horno 60 °C durante 1 min, y seguidamente programación a 2 °C/min hasta 220 °C. Temperatura del inyector: 250 °C. 1. glioxal; 2. metilglioxal; 3. diacetilo; 4. pentano-2,3-diona; 5. hexano-2,3-diona (patrón interno); 6. fenilglioxal (no estudiado en este método). Certificado conforme Tiblisi, 25 de junio de 2010 El Director General de la OIV Secretario de la Asamblea general Federico CASTELLUCCI © OIV 2010 7/8 Bibliografía Bartowski E.J.y Henschke P.A. The buttery attribute of wine – diacetyl – desirability spoilage and beyond. Int. j.food microbial. 96 : 235-252 (2004). Bednarski W, Jedrychowski L, Hammond E y Nikolov L, A method for determination of dicarbonyl compounds. 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