dicarbonylés les plus abondants dans le vin par la réaction

RESOLUCIÓN OIV/OENO 386A/2010
MÉTODO DE DETERMINACIÓN DE LOS COMPUESTOS α-DICARBONILICOS DEL
VINO POR HPLC TRAS DERIVACIÓN CON 1,2-DIAMINOBENCENO
LA ASAMBLEA GENERAL
Visto el artículo 2, apartado 2 iv, del Acuerdo del 3 de abril de 2001 relativo a la creación de
la Organización Internacional de la Viña y el Vino
A propuesta de la Subcomisión de Métodos de análisis,
DECIDE completar el Anexo A del Compendio Internacional de métodos de análisis con el
método de tipo IV siguiente:
MÉTODO DE DETERMINACIÓN DE LOS COMPUESTOS α-DICARBONILICOS DEL
VINO POR HPLC TRAS DERIVACIÓN CON 1,2-DIAMINOBENCENO
1. Introducción
Los principales compuestos α-dicarbonilicos del vino (Figura 1) son: glioxal, metilglioxal,
diacetilo y pentano-2,3-diona; sólo las α-dicetonas son suficientemente abundantes en el vino.
Los compuestos carbonilicos existen en todos los tipos de vinos y, en especial, después de la
fermentación maloláctica y en los vinos tintos. Además, los vinos blancos dulces producidos a
partir de uvas botritizadas pueden contener niveles elevados de glioxal y metilglioxal.
Glioxal: OCH−CHO (etanodial)
Metilglioxal: CH3−CO−CHO (2-oxopropanal)
Diacetilo: CH3−CO−CO−CH3 (butano-2,3-diona)
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Pentano-2,3-diona: CH3−CH2−CO−CO−CH3
Hexano-2,3-diona: CH3−CH2−CH2−CO−CO−CH3
Figura 1. Los principales compuestos α-dicarbonilicos del vino, (la hexano-2,3-diona no se
encuentra naturalmente presente en el vino pero se utiliza como patrón interno).
Los compuestos dicarbonilicos son importantes en el vino por diferentes razones: impacto
sensorial, reactividad con otros componentes del vino o posibles efectos microbiológicos.
2. Ámbito de aplicación
Este método se aplica a todo tipo de vinos (blancos, tintos, azucarados o fortificados), para
compuestos dicarbonilicos cuyo contenido está comprendido entre .0,05 mg/L y 20 mg/L.
3. Principio
El método se basa en la formación de derivados de tipo quinoxalina a partir de compuestos αdicarbonilicos del vino con el 1,2-diaminobenceno (Figura 2).
R
NH2
O C
N
R
N
R
+
NH2
1,2-Diaminobenceno
O C
R
Dicarbonilo
Quinoxalina
Figura 2 Formación de los derivados.
La reacción tiene lugar directamente en el vino a pH 8 y tras un tiempo de reacción de 3 h a 60
°C. El análisis de los derivados se efectúa a continuación, directamente por cromatografía en fase
líquida de alto rendimiento (HPLC) y detección por absorciometría UV a 313 nm,
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4. Reactivos y productos
4.1 Compuestos dicarboxilicos
4.1.1 Glioxal (n° CAS 107-22-3) en solución al 40 %
4.1.2 Metilglioxal (n° CAS 78-98-8) en solución al 40 %
4.1.3 Diacetilo (n° CAS 431-03-8) de pureza > 99 %
4.1.4 Pentano-2,3-diona (n° CAS 600-14-6) de pureza > 97 %
4.1.5 Hexano-2,3-diona (n° CAS 3848-24-6) de pureza > 90 %
4.2 1,2-Diaminobenceno (n° CAS 95-54-5) en forma de polvo, de pureza > 97 %
4.3 Agua para HPLC (por ejemplo microfiltrada y de una resistividad de 18,2 MΩ)
4.4 Etanol (n° CAS 64-17-5) puro para HPLC
4.5 Hidróxido de sodio (n° CAS 1310-73-2) en solución M.
4.6 Ácido acético (n° CAS 64-19-7) puro cristalizable
4.7 Disolvente A para el análisis mediante HPLC
En 1 l de agua para HPLC (4.3) añada 0,5 ml de ácido acético (4.6), mezcle, desgasifique
(por ejemplo, mediante ultrasonidos)
4.8 Disolvente B para HPLC
Metanol (n° CAS 67-56-1) puro HPLC
4.9 Solución hidroalcohólica al 50 % vol.
Mezcle 50 ml de etanol puro para HPLC (4.4) con 50 ml de agua (4.3)
4.10 Solución de patrón interno hexano-2,3-diona de 2,0 g/L
Colocar 40 mg de hexano-2,3-diona (4.2) en un frasco de 30 ml, diluir en 20 ml de
solución hidroalcohólica al 50 % vol (4.9) y agitar hasta que se disuelva completamente.
5. Instrumental
5.1 Cromatografía en fase líquida de alto rendimiento con detección UV (313 nm).
5.1.1 Columna analítica rellena de sílice ligada con radicales octadecilo de 5 µm cuyas
dimensiones sean, por ejemplo, 250 mm x 4,6 mm.
5.1.2 Sistema de adquisición de datos.
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5.2 Aparato de medición del pH
5.3 Agitador magnético
5.4 Balanza de precisión de 0,1 mg.
5.5 Sistema de desgasificación de los disolventes para HPLC (por ejemplo, aparato de
ultrasonidos)
5.6 Horno capaz de ser ajustado a 60 °C
5.7 Material de vidrio corriente de laboratorio, entre los cuales pipetas, frascos con rosca de 30
ml y microjeringas.
6. Preparación de la muestra
No se requiere ninguna preparación específica
7. Método de trabajo
Colocar 10 ml de vino en un frasco de 30 ml (5.7)
Llevar a pH 8 con a agitación, con hidróxido de sodio M (4.5)
Añadir 5 mg de 1,2-diaminobenceno (4.2)
Añadir 10 µl de hexano-2,3-diona (patrón interno) a 2,0 g/L (4.10)
Cerrar el frasco mediante un tapón de rosca provisto de una junta de teflón
Agitar hasta que desaparezca completamente el reactivo (5.3)
Colocar en el horno a 60 °C durante 3 h (5.6)
Enfríar.
7.1 Optimización y condiciones analíticas
El rendimiento de la reacción de los compuestos dicarbonilicos con el 1,2-diaminobenceno es
óptimo a pH 8. Se han derivado soluciones de compuestos dicarbonílicos a 25, 40 o 60 °C y, a
continuación, se han analizado mediante HPLC según el protocolo descrito en el punto 7.2 en
momentos diferentes (Cuadro 1). Las dicetonas requieren mucho más tiempo de reacción y una
temperatura de reacción más elevada. La reacción es más lenta con las moléculas de cadena más
larga (la pentano-2,3-diona y la hexano-2,3-diona).
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Por otra parte, no se ha notado ninguna interferencia del SO2 con la formación de las
quinoxalinas durante el estudio del método.
Cuadro 1. Efecto del tiempo de reacción y de la temperatura en el rendimiento de la formación
de derivados con el 1,2-diaminobenceno del glioxal, el diacetilo y la hexano-2,3-diona
Tiempo de reacción
1h
2h
3h
Temperatura (°C) Tasa de recuperación (%)
Glioxal
25
40
60
92
95
96
93
97
98
94
98
100
Diacetilo
25
40
60
23
64
85
77
89
100
87
94
100
Hexano-2,3-diona
25
40
60
17
55
69
67
79
93
79
88
100
7.2 Análisis mediante HPLC
- Inyección. Tras enfriamiento, el medio reaccional que contiene las quinoxalinas se inyecta
directamente a razón de 20 µl en el sistema HPLC.
- Programa de elución. Para la separación, se presenta el programa de elución en el Cuadro 2
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Cuadro 2. Programa de elución del análisis por HPLC
Tiempo en minutos
Solvente A
Solvente B
0
80
20
8
50
50
26
25
75
30
0
100
32
0
100
40
100
0
45
80
20
50
80
20
Siendo el caudal de 0,6 ml/min
- Separación. El cromatograma obtenido por HPLC se indica en la Figura 3.
- Detección. El máximo de absorción ha sido estudiado para todos los compuestos dicarbonílicos
derivados y se ha fijado el óptimo en 313 nm.
- Identificación de los derivados. La identificación de los derivados ha sido realizada por
comparación de los tiempos de retención con soluciones de referencia patrones. Las condiciones
cromatográficas permiten una buena separación de los picos en todos los vinos.
7.2.1 Características del método por HPLC
Ciertos elementos de validación interna han sido determinados pero no se trata de una
validación formal según el protocolo para la planificación, realización y la interpretación de
estudios de rendimiento de los métodos de análisis (OIV 6/2000).
- Repetibilidad. La repetibilidad del método ha sido calculada a partir de 10 análisis del mismo
vino (Cuadro 3).
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Cuadro 3. Estudio de repetibilidad y rendimiento del método
Media*
diferencia tipo CV (%)
Vino blanco
Glioxal
4,379
0,101
2,31
Metilglioxal
2,619
0,089
3,43
Diacetilo
5,014
0,181
3,62
Pentano-2,3-diona
2,307
0,097
4,21
Vino tinto
Glioxal
Metilglioxal
Diacetilo
Pentano-2,3-diona
2,211
1,034
1,854
0,698
0,227
0,102
0,046
0,091
10,30
9,91
2,49
13,09
*Resultados en mg/l a partir de 10 análisis del mismo vino.
- Linealidad. La linealidad del método ha sido probada utilizando soluciones estándar (solución
hidroalcohólica al 12 % vol. como matriz) (Cuadro 4). El análisis cuantitativo de las adiciones de
compuestos dicarbonílicos ha mostrado que el método es lineal para los cuatro compuestos, con
una precisión satisfactoria.
Cuadro 4. Estudio de la linealidad y ensayos de recuperación con soluciones estándar (aguaetanol 12% v/v) valor del coeficiente de correlación
Glioxal
Metilglioxal
Diacetilo
Pentano-2,3-diona
R = 0,992
R = 0,997
R = 0,999
R = 0,999
- La tasa de recuperación de las adiciones efectuados en vinos tintos y blancos ha demostrado el
buen rendimiento del método. Comprendida entre 92% y 116% para los valores extremos.
- El límite de cuantificación de los compuestos dicarbonílicos es muy bajo, obteniéndose los
mejores resultados con el diacetilo cuyo límite de detección es 10 veces menor que el de los otros
compuestos (Cuadro 5).
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Cuadro 5. Rendimiento del método por HPLC para la cuantificación de los compuestos
dicarbonílicos
Límites
Glioxal
Metilglioxal
Diacetilo
Pentano-2,3-diona
deteccióna
0,015
0,015
0,002
0,003
determinacióna
0,020
0,020
0,002
0,004
cuantificacióna
0,028
0,027
0,003
0,006
a: resultados en mg/l, en solución hidroalcohólica (10 % vol).
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Figura 3. Cromatograma, de los compuestos dicarbonílicos derivados con 1,2-diaminobenceno
de un vino blanco, mediante cromatografía, en fase líquida de alto rendimiento y detección UV
a 313 nm Columna Sperisorb ODS 250 mm x 4,6 mm x 5 µm.
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Bibliografía
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