TEMA 5enzimologia

TEMA 5: ENZIMOLOGÍA CLÍNICA
1. Valor diagnóstico de las enzimas en el plasma.
2. Principios del análisis de enzimas
3. Análisis de isoenzimas.
4. Determinación enzimática de sustratos.
1.
Valor diagnóstico de las enzimas en el plasma
La enzimología clínica es la aplicación del conocimiento de las enzimas
(proteínas especializadas en la catálisis de reacciones orgánicas) al
diagnóstico, tratamiento y pronóstico de la enfermedad.
Aunque son raras las enzimas exclusivas de un tejido, la alteración de la
concentración sérica de un enzima determinada orienta sobre los tejidos
más probablemente afectados. Además, muchas enzimas muestras distintas
formas moleculares (isoenzimas) características de distintos tejidos. El
análisis isoenzimático de la enzima cuya concentración sérica se encuentra
alterada a menudo aporta información adicional sobre las causas de dicha
alteración.
Muy frecuentemente la información deseada se obtiene examinando dos o
más enzimas séricas ej. una elevación en ?-glutamil-transferasa indicará,
con gran probabilidad, colestasis si aparece aumentada la fosfatasa alcalina
sérica.
El tipo de alteración observada también proporciona gran información:
•
Lo más frecuente es encontrar elevaciones debidas a aumentos de
permeabilidad celular daño tisular.
•
Es posible detectar disminuciones debidas a enfermedades
crónicas que originan disfunción celular.
•
El grado de alteración de la concentración catalítica puede ser
orientativo de determinadas alteraciones ej. las aminotransferasas séricas
muestran aumentos más importantes en hepatitis agudas que en hepatitis
crónicas.
Dependiendo del grado de permeabilidad y de la distancia entre células y
capilares existirá un mayor o menor desfase entre el momento de detección
del aumento de actividad enzimática y el momento de daño tisular.
2. Principios del análisis de enzimas
La concentración de enzimas en suero es muy baja, sin embargo, dada su
eleva capacidad catalítica, es posible determinar su actividad y presuponer
que ésta es proporcional a su concentración. Por tanto, el estudio de las
enzimas en el laboratorio se basa en la demostración “in vitro” de la
actividad catalítica.
Se puede determinar la actividad enzimática analizando:
• La aparición de algún producto
• La desaparición del sustrato
1
•
La variación de un cofactor o de algún componente de la reacción
En definitiva, la actividad de una enzima se mide mediante la determinación
de la cantidad de sustrato formado por unidad de tiempo, en condiciones
exactamente definidas (pH, Tª…) y estrictamente controladas.
La actividad enzimática se expresa Unidades Internacionales (UI) por
unidad de volumen (UI/ml, UI/L…) siendo una UI la cantidad de enzima que
transforma un micromol de sustrato por minuto en condiciones estándar
previamente establecidas.
En una reacción enzimática podemos diferenciar 3 fases: fase de retardo,
fase lineal y fase de agotamiento de sustrato.
La fase de retardo tiene lugar inmediatamente después de mezclar los
reactivos con la muestra biológica. Es una fase de encuentro y acoplamiento
de sustrato y enzima. Su duración es muy variable (segundos a minutos). Al
finalizar esta fase comienza la fase lineal en la que la formación de
producto permanece constante, siendo la concentración de enzima de la
muestra es el único factor limitante. Por último, a medida que va
transcurriendo la reacción, llega un momento en que el sustrato u otro
reactivo se van agotando (fase de agotamiento de sustrato) y la
velocidad de reacción disminuye hasta anularse.
Para que una determinación enzimática sea válida es necesario realizarla
en la fase lineal donde el único factor limitante es la concentración
de la propia enzima y las condiciones de reacción son las óptimas
(exceso de sustrato y otros reactivos…). Para ello se suele trabajar con una
concentración de sustrato superior a la Km. Así, en un ensayo enzimático, el
límite de linealidad es la actividad enzimática más alta que se puede medir
2
con exactitud. Por encima de ese valor habrá que diluir el suero con
solución salina y multiplicar el resultado obtenido por el factor de dilución.
2.2
¿Cómo se obtiene en el laboratorio clínico el valor numérico
de actividad enzimática?
Generalmente la actividad enzimática se evalúa mediante ensayos
espectrofotométricos, por tanto necesitamos seguir la evolución de alguno
de los elementos que participan en la reacción y que, por supuesto, deben
absorber luz a una determinada longitud de onda así:
•
Si el producto absorbe luz a una longitud de onda determinada
podemos evaluar la aparición del producto analizando el incremento de
absorbancia a dicha longitud de onda.
•
Si el sustrato absorbe luz a una longitud de onda determinada
podemos evaluar la desaparición del sustrato analizando la disminución de
absorbancia a dicha longitud de onda.
•
De igual modo podemos analizar la variación de un cofactor o de
algún componente de la reacción. Ej. es muy frecuente utilizar la aparición o
desaparición de NADH o NADPH, así
NAD+
NADP +
NADH
NADPH
Aumenta la absorbancia a 340nm
NADH
NADPH
NAD+
NADP +
Disminuye la absorbancia a 340nm
De cualquiera de estas maneras podremos:
•
•
analizar como evoluciona la absorbancia, es decir la reacción, a lo
largo del tiempo y
obtener un valor de ?A/min
En ocasiones ninguno de los elementos que participan directamente en la
reacción absorben luz, en cuyo caso es necesario acoplar una segunda
reacción en la que alguno de los reactivos o productos presenten un
máximo de absorción. Analizando esta segunda reacción podremos evaluar
la actividad enzimática de la primera.
Los métodos analíticos para determinar la actividad enzimática y por tanto
el ?A/min pueden ser:
•
•
Métodos a punto final
Métodos cinéticos
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En definitiva, ya sabemos la fase en la que hemos de trabajar, que
parámetro obtenemos experimentalmente y como lo obtenemos pero ¿cómo
convertimos ?A/min en UI/L?
Para obtener el valor definitivo de actividad enzimática aplicamos la
siguiente fórmula:
Donde:
• e es el coeficiente de extinción molar de aquel compuesto cuya
absorbancia estamos siguiendo en el espectrofotómetro.
• d es el espesor de la cubeta
• VF es el volumen total de reacción
• VI es el volumen de muestra en el ensayo
Para un determinado ensayo todos los parámetros que aparecen en rojo
son constantes por tanto podemos la fórmula anterior queda como:
UI/L=?A/min · cte
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2.3. Aspectos prácticos
•
•
•
•
•
No utilizar muestras que hayan sido congeladas y descongeladas
varias veces.
Separar lo antes posible el coágulo del suero y evitar trabajar con
muestras bemolizadas
Evitar la estasis venosa prolongada durante la extracción
Evitar el envejecimiento de las muestras
El transporte de las muestras debe realizarse en frío sin congelar,
salvo que se vaya a prolongar mucho tiempo.
3. Análisis de isoenzimas.
Las isoenzimas son formas múltiples de un enzima que catalizan la misma
reacción.
Las isoenzimas de una familia pueden diferir en sus propiedades
fisicoquímicas, tamaño, carga, termoestabilidad, Km, especificidad por
distintos sustratos, capacidad de ser reconocidas por agentes específicos o
inmunorreactividad. Estas diferencias son utilizadas como base de los
ensayos que permiten diferenciar isoenzimas concretas. Así:
•
Las diferencias de carga hacen que las distintas isoenzimas se
puedan separar por ejemplo mediante electroforesis o mediante
cromatrografía de intercambio iónico. Ej. separación electroforética
de las isoenzimas de la LDH y posterior visualización por reacción con
lactato, NADH y NBT. Ej. separación electroforética o por
cromatografía de las isoenzimas de CK (lo veremos cuando
estudiemos el infarto de miocardio).
•
La distinta termoestabilidad permite inactivar selectivamente algunas
isoenzimas ej. Tras un infarto de miocardio aumenta la concentración
de LDH-1, esta isoenzima es bastante termoestable. Esta
característica explica que si extraemos suero de un paciente sano y lo
calentamos a 60ºC durante 30 min sólo se preserve el 20-40% de la
actividad. Sin embargo, si realizamos el mismo tratamiento a un
suero que un paciente que ha sufrido un infarto de miocardio, se
preserva más del 45%.
•
La diferente capacidad de cada isoenzima para fijar ihnibidores
permite utilizar técnicas de inhibición catalítica (inhibición selectiva de
isoenzimas).
•
En ocasiones cada isoenzima puede posee un sustrato específico lo
que permite utilizar técnicas de especificidad de sustrato ej. LDH-1
puede utilizar ß-hidroxibutirato como sustrato específico.
•
Por ultimo, otras técnicas aprovechan las diferencias inmunológicas y
utilizan anticuerpos que reaccionan exclusivamente con determinadas
isoenzimas ej. RIA, inmunoinhibición.
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4. Determinación enzimática de sustratos.
En el laboratorio no sólo se puede determinar la actividad de enzimas de
interés clínico, también es muy frecuente utilizar enzimas en la
determinación de sustratos ej. métodos enzimáticos (GOD/POD o de la
hexoquinasa) para determinar la concentración de glucosa de una muestra.
Bibliografía
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D'Ocon Navaza MC, García-Saavedra MJ, Vicente García JC. (1999).
Análisis de Muestras Biológicas. Madrid. Ed. Paraninfo.
Salve ML, Amich S, Prieto S, Casas A. (1994). Laboratorio Clínico.
Madrid. Ed. Interameericana•McGraw -Hill
Anderson SC, Cockayne S. (1995). Química Clínica. Méjico. Ed.
Interameericana•McGraw -Hill.?
KAPLAN. Clinical Chemistry. Interpretation and Techniques. Buenos
Aires. Ed. Panamericana.
Preguntas de revisión
1.
¿Cómo se define una UI de actividad enzimática? ¿Cómo se expresa
la actividad enzimática en clínica?
2.
La actividad enzimática se debe medir en:
a.
la fase lineal
b.
la fase de agotamiento de sustrato
c.
la fase de retardo
d.
cualquiera de las respuestas anteriores es válida
3.
Razone la respuesta que ha dado a la pregunta anterior.
4.
¿Qué parámetro debe determinar experimentalmente para calcular la
actividad enzimática? ¿Cómo se lleva a cabo dicha determinación en el
laboratorio ?
5.
Si evaluáramos la aparición de NADPH ¿a qué longitud de onda
deberíamos trabajar? ¿Tendríamos que utilizar cubetas de cuarzo?
6.
En el caso anterior la absorbancia ¿aumentaría o disminuiría?
7.
La determinación de la actividad se lleva a cabo generalmente por
métodos cinéticos ¿por qué?
8.
Suponga que partiera de una muestra de suero (ej. de un paciente
con infarto) y quisera llevar a cabo un análisis isoenzimático de una
determinada actividad enzimática (ej. LDH) ¿cómo podría hacerlo?
9.
En prácticas se analizó la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina
en una muestra de suero. Considerando los resultados de absorbancia
obtenidos ¿podría identificar el compuesto cuya absorbancia estaba
analizando?
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