FORMULACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y PRODUCCIÓN DE

FORMULACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y PRODUCCIÓN DE
Bacillus thuringiensis var. kurstaki
A NIVEL DE LABORATORIO
Fiorela Tapia1 y Patricia Moreno2
I.
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En la actualidad existe un gran problema ocasionado por el uso de plaguicidas químicos y la
resistencia de numerosas especies ante estos. El uso de microrganismos tanto naturales como
modificados podría reducir el efecto de organismos patógenos como lo son las plagas. En
nuestro país destaca la del cogollero del maíz (Spodoptera frugiperda), plaga principalmente
del maíz como del algodón, arroz, caña de azúcar y pasturas. La bacteria entomopatógena que
posee un alto grado de infectividad contra esta plaga es Bacillus thuringiensis var. kurstaki, sin
riesgo de toxicidad de ningún tipo.
Se han descubierto diferentes aspectos relacionados a la genética, metabolismo, toxinas de
este microrganismo; sin embargo, no se tiene tanta información sobre los procesos de
fermentación y producción. Es por ello que es de importancia conocer su producción, su
cinética y su infectividad.
II.
OBJETIVO GENERAL
• Propagar la cepa Bacillus thuringiensis var. kurstaki a nivel de laboratorio en medios de
cultivo a base de melaza como fuente de carbono.
• Determinar la toxicidad del fermentado de Bacillus thuringiensis var. kurstaki contra las
larvas lepidópteras de Spodoptera frugiperda.
III.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
•
Identificación de Bacillus thuringiensis var. kurstaki en laboratorio.
•
Preparación del medio para la fermentación de Bacillus thuringiensis var. kurstaki a
nivel de laboratorio.
• Concentración de endosporas a partir del fermentado.
• Obtener la cinética de Bacillus thuringiensis var. kurstaki durante la fermentación.
1
2
Alumna de la carrera de biología de la Universidad Nacional Agraria La Molina
Profesora del Departamento Académico de Biología de la Facultad de Ciencias de la Universidad
Nacional Agraria La Molina.
IV. ANTECEDENTES
Se conocen actualmente alrededor de 100 bacterias entomopatógenas dándole un uso como
bioinsecticida al género Bacillus (Hofte, 1989): B. popillae, B. sphaericus, B. lentimorbus, B.
moritai y principalmente Bacillus thuringiensis. Esta bacteria es un parásito de insectos y, a su
vez, un saprófito en el suelo. Sus células vegetativas son bacilos Gram positivos, aerobios
facultativos, se divide por fisión binaria y frecuentemente forma cadenas. Presenta esporas y
cristales paraesporales bipiramidales durante la esporulación (Gutiérrez, 1993). Tiene la
capacidad de fermentar la glucosa, fructosa, trehalosa, maltosa y ribosa, y de hidrolizar la
gelatina, almidón, glucógeno y n-acetil-glucosamina (Sauka et al, 2008).
La producción de cristales paraesporales se sintetiza desde que ocurre el englobamiento de la
pre-espora hasta su maduración. El cristal paraesporal se ubica en el interior del esporangio
y, en general, fuera del exposporio de la espora, y son liberados cuando ocurre la lisis celular
(Sauka et al, 2008). En condiciones normales la toxina contenida en el cristal paraesporal es
soluble en pH alcalinos superiores a 12 o bien por la acción conjunta de desnaturalizadores
(Angua, 1956). Cada cristal paraesporal puede estar constituido por proteínas Cry o δendotoxinas de diferentes tipos que se agrupan mediante puentes disulfuro. El anclaje de
estos puentes disulfuro es un paso crítico para la solubilización del cistal (Du et al., 1994).
El mecanismo de acción de las proteínas Cry es el siguiente: los cristales producidos por B.
thuringiensis son ingeridos y luego solubilizados en el intestino medio del insecto, es allí
donde se liberan las proteínas en forma de protoxinas. Bajo esta forma no son tóxicas hasta
que son procesadas por proteasas del intestino que las convierten en toxinas activas. Una vez
degradadas, pueden atravesar la membrana peritrófica uniéndose a la caderina
univalentemente (Carrera, 2009). Se inicia una cascada de señalizaciones dependiente de
magnesio y se incrementa la afinidad por un receptor secundario (la aminopeptidasa o
fosfatasa alcalina). Esta unión facilita la formación de un poro en el epitelio del intestino
medio que provoca un desequilibrio osmótico ocasionando una lisis celular. Por ello, los
insectos dejan de alimentarse, este proceso se puede acelerar si las esporas germinan
proliferando las células vegetativas en el hemocele del insecto.
Metabolismo de Bacillus thuringiensis
Se tiene conocimiento que esta bacteria sigue las rutas de glucólisis (93-100%) o la vía de
pentosas fosfato para azúcares, ciclo de Krebs modificado y el ciclo del glioxilato. Para el
metabolismo de nitrógeno, cataboliza aminoácidos y asimila el amonio. Las principales
enzimas de asimilación de aminoácidos son: alanina deshidrogenasa, glutamato
deshidrogenasa, glutamato sintetasa y glutamina sintetasa. Posteriormente actúan como
donadores de nitrógeno a otros metabolitos por vía transaminación. Bacillus thuringiensis
carece de la enzima α-cetoglutarato deshidrogenasa por lo que no se completa el ciclo de
Krebs, en su lugar se realiza el ciclo del ácido aminobutirico dando como producto el
succinato que retoma al ciclo de Krebs (Aroson, 1976).
Medios de cultivo
El rango de temperatura óptimo para la mayor producción de endotoxina ocurre de 28-30ºC.
El crecimiento resulta óptimo a un pH de 5.6 – 8.5. El pH inical es de aproximadamente 7 que
luego decrece hasta 5.8 por la formación de ácidos como el acetato o el ácido láctico. Bacillus
thuringiensis presenta la habilidad para desarrollarse en productos naturales o bien en
materia prima de bajo costo, se encuentran los siguientes productos: como fuente de
carbono se recomienda el uso de hexosas como melaza (Foda, 1985), almidón de maíz
(Murga, 1983), sacarosa, glicerol y glucosa (Smith, 1982); como fuente de nitrógeno: la harina
de maíz, harina de carne seca, harina de pescado, levaduras y/o peptonas (Dulmage, 1981).
Producción comercial de B.thuringiensis
La primera producción comercial se realizó en Francia en 1983, en la cual utilizaron una
fermentación semisólida. Sin embargo, se limitó la producción en diferentes países por ser de
baja actividad y por no entrar con cepas de alta potencia y estandarización adecuada (Beegle,
1979). El merado actual de los agentes de control biológico representa el 2% del mercado
total de insecticidas que asciende a 4 billones de dólares (Daoust, 1990).
V.
MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 Identificación de Bacillus thuringiensis
5.1.1 Material biológico: Bacillus thuringiensis var. kurstaki (Btk), cepa obtenida de la
Universidad Nacional de Trujillo. Bacillus thuringiensis var. tenebrionis (Btt), obtenida del
cepario de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos.
5.1.2 Degradación de carbohidratos: con el fin de tener conocimiento sobre la capacidad de
Bacillus thuringiensis para degradar ciertos carbohidratos en presencia o ausencia de oxígeno
como de extracto de levadura y peptona de carne, se prepararon 14 tubos para Btk y 14 tubos
para Btt. De estos 14 tubos para cada uno, 7 contuvieron peptona de carne y extracto de
levadura en medio anoxigénico. Los 7 tubos restantes, no presentaron peptona de carne ni
extracto de levadura y se encontraban en un medio oxigénico. Los 4 carbohidratos que se
probaron fueron: sorbitol, sacarosa, glucosa y fructosa; los compuestos azucarados fueron
melaza y gel de sábila, además de un control. El control contenía todos los compuestos menos
el carbohidrato a probar. Se utilizó 5 ml de medio Api 50 CHL (Anexo 1) para cada tubo. Luego
de la preparación se dejó incuba a 35ºC durante 7 días.
5.1.3 Lectura de la degradación de carbohidratos: como el medio Api contiene el indicador
azul de bromotimol el rango de viraje es de pH 6 (amarillo), pH 6.7 (verde) y pH 7.6 (azul). La
lectura se realizó durante 7 días siguiendo el proceso cada 24 horas. La degradación del
carbohidrato en estudio se manifiesta por vire del medio de cultivo de verde a amarillo (Dibico,
s.f).
5.1.4 Pruebas enzimáticas o de hidrólisis: se utilizaron los siguientes medios: agar CMC, agar
leche descremada, agar almidón, TSI y agar Mossel con el fin de identificar si estos Bacillus
tienen la capacidad de producir las enzimas para degradar los sustratos que cada medio
presenta.
5.1.4.1 Prueba hidrólisis de almidón (agar almidón): se preparó una solución arroz-agua en la
proporción 2:20 de los cuales se tomó 10 ml (fuente de almidón), se mezcló con 1.5 g de agar
agar y se llevó a 100 ml agua desionizada. El pH se reguló a 7.0 ±0.2. Luego, se sembró el Btk
como el Btt en agar almidón por el método de difusión en agar (Palvecino, 1997) y se incubó a
35ºC durante 48h. Después, de este tiempo se adicionó 3 gotas de lugol y se extendió sobre la
superficie del agar almidón dando como resultado positivo la formación de un halo claro
alrededor del disco.
5.1.4.2
Prueba de hidrólisis de celulosa (agar
CMC): se
prepararon 0.5g de
carboximetilcelulosa (CMC), 0.75g de agar agar y se llevó a un volumen de 50 ml de agua
desionizada. El pH se reguló a 7 ±0.2. Se sembró el Btk y el Btt en este agar CMC por el método
de difusión en agar (Palvecino, 1997) y se incubó a 35ºC durante 8 días. Transcurrido el tiempo
de incubación se reveló la degradación de CMC lavando las placas con NaCl 0.1M seguidamente
se inundó las placas con solución rojo de congo 0.25% durante 30’. Después se lavó
nuevamente con NaCl 0.1M y se enjuagó con ácido acético 5%. Si se observa un halo de color
claro alrededor del disco indica que nuestra cepa tiene la capacidad de degradar la celulosa.
5.1.4.3 Prueba de hidrólisis de proteínas (agar leche descremada): se preparó inicialmente 1.5
g de agar agar en 100ml de agua. Se reguló el pH a 7±0.2. Una vez autoclavado, se agregó 5ml
de leche esterilizada descremada y se mezcló con la solución de agar. Se sembró el Btk y el Btt
en este agar leche descremada por el método de difusión en agar y se incubó durante 48 horas.
Transcurrido este tiempo se observó directamente la formación de un halo alrededor del papel
filtro lo que indica que nuestra cepa posee la capacidad de producir enzimas proteasas.
5.1.4.4 Medición de la potencia enzimática por difusión en agar leche descremada, almidón y
CMC.
•
Plaquear los medios y secar la superficie de la placa en la cámara de flujo laminar.
•
Embeber cortes de papel filtro estériles de 5 mm de diámetro en una suspensión de
esporas de Bacillus sp.
•
Colocar cada corte de papel filtro embebido en el centro de cada placa.
•
Incubar a 35ºC por 48 horas.
•
Medir el diámetro de la colonia (DC) y del halo de hidrólisis (H).
•
Calcular el índice de potencia (IP) mediante la siguiente fórmula:
IP= DC / H
•
Se considera que tiene actividad proteolítica cuando IP >1.
5.1.4.5 Prueba de manitol (agar Mossel): se preparó 4.77 g de agar Mossel y se llevó a un
volumen de 100 ml de agua desionizada. Se reguló el pH a 7 ±0.2. Después de ser autoclavado
se adicionó 10ml de la solución yema de huevo-agua desionizada (una yema de huevo en
100ml de agua desionizada). Se sembró tanto el Btk como el Btt por el método de extensión
(FAGRO, 2011) y se incubó durante 24 horas. Si se observa colonias con un halo rosa y
precipitado de lecitina es manitol – y lecitinasa + y si se observa colonias con halo amarillo sin
precipitado es manitol +, lecitinasa -.
5.1.4.6 Prueba de hidrólisis de los tres azúcares (agar TSI): se preparon 3 tubos con 8 ml/tubo
de agar TSI. Para ello, se utilizó 2.925g de agar TSI y se llevó a 45ml de agua desionizada. El pH
se ajustó a 7.4 ±0.2. Se sembró el Btk, Btt y se mantuvo un tubo como control. La siembra se
realizó haciendo una punción central hasta el fondo y estría en superficie (Altamiranda et al.,
s.f). La lectura se realizó después de 18 a 24h de incubación a 35ºC. La reacción ocurrida en la
superficie del medio correponde al numerados (parte aerobia) y la reacción ocurrida en la
profundidad del medio corresponde al denominador (parte anaerobia). La acidez del medio se
denomina con la letra A (color amarillo) y la alcalinidad con la letra K (color rojo). Si el Bt
fermenta solo glucosa (K/A), si fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa (A,A), si no fermenta los
carbohidratos (K/K) (Murcia, s.f).
5.2 Producción del Bacillus thuringiensis var. kurstaki
5.2.1 Siembra del inóculo madre: de tubos ceparios que contienen cultivos de Bacillus
thuringiensis var kurstaki se recogió con la ayuda de una asa de Kolle una pequeña cantidad del
inóculo madre y se colocó en un tubo que contenía 9ml de agua peptonada. Se mezcló hasta
que se homogenice bien. De esta solución, se extrajo 0.3ml por placa Petri y se sembró por
superficie sobre el agar MN (Anexo 2). Con un asa de Digralsky se extendió por toda la placa. Se
realizó un total de 17 siembras del inóculo madre para Btk. Finalmente, se dejó incubando
durante 7 días a una temperatura de 35ºC.
5.2.2 Cosecha del inóculo: la cosecha se realizó con 3 ml de solución salina al 0.85 % por placa
Petri ayudándose con una pipeta de caída libre de 5ml, se depositó esta cantidad sobre la
superficie de la placa y se intentó de esparcir las colonias formadas con la solución salina. Se
absorbió con la misma pipeta la solución con microrganismos y se depositó en un tubo estéril.
Se obtuvo una concentración de 7.5 x 10 8 esporas/ml.
5.2.3 Preparación del fermentador: en un biofermentador con capacidad de 4 litros se agregó
2 litros de caldo BMT esterilizado (Anexo 3). Se reguló el pH a 7 (pH óptimo 6.5-7.5). Además se
preparó 2L de sulfato de cobre 3% y 2L de salmuera 20% con el fin de que el aire se esterilice y
no contamine el caldo BMT. Una vez instalados junto al equipo de aireación, se agregó 2.7ml de
la cosecha a nuestro caldo BMT, esta cantidad se obtuvo a partir de la fórmula:
V1 x C1 = V2 x C2
V1: cantidad de medio BMT
C1: concentración buscada
V2: volumen necesario para obtener una concentración de 106
C2: concentración de la cosecha.
Reemplazando datos:
2000 ml x 106 = V2 x 7.5 x 108
A partir de esta ecuación se obtuvo el valor de 2.7ml que se necesitan a partir de la cosecha de
Btk para obtener una concentración de 106 en 2L de caldo BMT.
5.2.4 Muestreo y recuento del caldo fermentador: se obtuvo 35 ml en cada muestra del caldo
BMT a las siguientes horas: 0, 4, 8, 24, 28, 32, 48, 72,96. Con el fin de realizar un recuento a
cada muestra y obtener la curva de crecimiento del Btk.
De los 35 ml de muestra extraída del caldo de producción se realizó la siguiente distribución:
15 ml ----------------Determinación de azúcares
10 ml --------------------- Densidad celular
9 ml -------------------- Medición de pH
1ml ------------ Recuento microbiano
5.2.4.1 Recuento en cámara Neubauer: cada toma de muestra se tomó una dilución que sirva
para el recuento. En este caso se tomó a partir de una dilución de 10-1 para todas las muestras.
Se retiró una gota de esta dilución con la ayuda de una pipeta Pasteur y se colocó en la cámara
de Neubauer en la cual se realizó el recuento con el objetivo de 40X.
5.2.4.2 Recuento en placa: se extrajo un mililitro del fermentado BMT y se realizó diluciones
seriadas en agua peptonada 0.1% previamente se homogenizó la muestra con la ayuda de un
vortex. Luego se siembró 1ml de las últimas diluciones mediante la técnica de incorporación en
agar nutritivo. Se incubó a 35ºC por 18-24 horas. Al finalizar el tiempo de incubación, se realiza
el recuento del número de unidades formadoras de colonia.
5.2.4.3 Medida de la densidad celular: las muestras tomadas en el punto 5.2.4 se almacenaron
en refrigeración y fueron leídas con la ayuda de un espectrofotómetro a una longitud de onda
de 630 nm.
5.2.4.4 Determinación de azúcares reductores y aminoácidos: en cada toma de muestra del
punto 5.2.4 se realizó la prueba de azúcares mediante el método espectrofotométrico de
Dubois (Dubois et al, 1956) para determinar el porcentaje de azúcares que contiene cada
muestra y ver su progreso.
5.2.4.5 Recuento de toxinas en coloración con azul brillante de Coomassie: Esta tinción se
ejecutó de la siguiente manera para teñir a los cuerpos parasporales: se realizó un frotis
delgado sobre un vidrio portaobjeto, se seca a temperatura ambiente y luego se expande
suavemente. Una vez fijado el material con la ayuda de un mechero, se cubre con una solución
de azul de Coomassie al 0.25% en 50% de etanol y 7% de ácido acético durante 3 min (Fadel et
al., 1988). El exceso de colorante se lava con agua destilada y se deja secar el frotis a
temperatura ambiente. Los cuerpos paraesporales se observan al microscopio óptico con
1000X de aumento.
5.3 Bioensayo: se obtuvieron larvas de los dos primeros estadios de la especie Spodoptera
frugiperda del SENASA. Se utilizaron 600 larvas por tratamiento, realizándose 6 en total. Los
tratamientos son:
a) Fermento
b) Fermento concentrado (usando el rotavapor)
c) Fermento diluido (1/200)
d) Dipel 2x
e) Biobit
f) Control
Cada tratamiento tuvo 10 repeticiones y cada repetición 10 larvas. Las larvas se encontraban en
potes tapados cuidadosamente con tul. Cada pote contuvo una hoja de maíz joven que es
asperjada tanto en el haz como en el envés de las sustancias de cada tratamiento. El
seguimiento a la prueba se realizó en 10 días contando el número de larvas muertas que
tengan síntomas de haber sido intoxicadas por la delta-endotoxina.
El modelo estadístico que se realiza es un Diseño Completamente al Azar (DCA) que es un
diseño en el cual los tratamientos son asignados aleatoriamente a las unidades experimentales
sin ningún tipo de restricción. Luego se realiza la prueba de Anderson-Darling para ver si el
diseño cumple el criterio de normalidad. Si es así, se realiza la prueba ANOVA que nos indica si
al menos con un tratamiento se produce un efecto distinto en la mortandad de las larvas
(Eyzaguirre, s.f.).
VI. RESULTADOS
6.1 Lectura de la degradación de carbohidratos
Antes de la incubación los tubos presentaron una coloración marrón claro (melaza), verde
amarillento (fructosa) y verde (sorbitol, sacarosa, sábila, glucosa y fructosa) en ambos medios.
Al cabo de 12 horas se observó tanto el Btt como el Btk en medio anoxigénico presentaban
una coloración amarilla en los tubos que contenían sacarosa, glucosa y fructosa. Después de
96 horas, el Btt no degradó ningún compuesto en medio oxigénico ya que la coloración
presentada en todos los tubos es ligeramente menos verde que en el tiempo cero y el color
marrón de la melaza se mantiene constante. En medio anoxigénico, el Btt degradó la
sacarosa, fructosa, glucosa y el sorbitol. El Btk degradó tanto en medio oxigénico como en
anoxigénico el sorbitol, sacarosa, glucosa, fructosa y melaza.
Medio oxigénico
Medio anoxigénico
To
Btt1
T96
Btk
T96
6.2 Pruebas enzimáticas o de hidrólisis
6.2.1 Prueba hidrólisis de almidón (agar almidón): después de 48h después de la
incubación se agregaron 3 gotas de lugol y se pudo observar la formación de un halo en
la placa Petri del Btk. En caso del Btt, no se observó un halo definido.
Fig. 1 Btk (izquierda), Btt1 (centro) y Btt2 (derecha) sembrados en agar almidón más lugol.
Hallando el IP del Btk= 2.3/0.8= 2.875. El valor es mayor a uno lo que indica
que posee actividad amilolítica.
Hallando el IP del Btt2 = 2.9/ 0.9 = 3.22. El valor es mayor a uno lo que indica
que posee actividad amilolítica.
6.2.2 Prueba de hidrólisis de proteínas (agar leche descremada): después de 48h se
observó la formación de un halo en la placa donde se sembró el Btk más no para el Btt.
Fig. 2 Lectura del Btk (izquierda) y Btt1 (centro) y Btt2 (derecha) en agar leche descremada.
Hallando el IP del Btk= 5.2/3.4= 1.53. Valor mayor a uno indica que posee la actividad proteolítica.
Hallando el IP del Btt2 = 7.8/ 6.6= 1.18. Valor mayor a uno indica que posee la actividad proteolítica.
6.2.3 Prueba de hidrólisis de celulosa (agar CMC): después de 9 días, se realizó la lectura
de este agar. Se observó la formación de un halo en la placa sembrada por Btk. En el Btt
no se observó la formación de un halo.
Fig. 3 Lectura del Btk (izquierda) después de aplicar rojo de congo y Btt1 (centro) y Btt2
(derecha)
después de aplicar ácido acético en agar CMC.
Hallando el IP del Btk= 2.6/0.8= 3.25. El valor es mayor a uno lo que indica
que posee actividad celulolítica.
Hallando el IP del Btt2 = 5.3/1.5= 3.53. El valor es mayor a uno lo que indica
que posee actividad celulolítica.
6.2.4 Prueba de manitol (agar Mossel): al cabo de 24horas se observó el cambio de coloración de anarajando a rosado para el Btk y para el Btt se observó manchas amarillas. Esto indica que Btk y Btt2 no puede degradar el manitol mientras que el Btt1 puede hacerlo.
Fig. 4 Lectura del Btk (izquierda) y Btt1 (centro) y Btt2 (derecha) en agar Mossel.
6.2.5
Prueba de hidrólisis de los tres azúcares (agar TSI): después de 24h se observó que los
tubos que contenían Btk y Btt2 presentaban fondo ácido/pico alcalino lo que indica
que fermentan solo glucosa al ser K/A. El Btt1 presenta pico ácido y fondo ácido por lo
que fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa al ser A/A.
Fig. 5 Tubos con Btk y Btt1 antes de la incubación (izquierda). Control, tubo
con Btk y Btt1 en agar TSI después de la incubación de 24h (derecha).
6.3 Producción del Bacillus thuringiensis var. kurstaki
6.3.1 Recuento en placa: los datos obtenidos fueron los que se presentan en la tabla. El
porcentaje de glucosa fue multiplicado por un factor de 90 con el fin de poder graficarse junto
con los demás datos.
Tiempo
pH
%Glu
% Glu & 90
Recuento
Log(recuento)
0
7,36
0,087
7,83
9,00E+05
5,95
4
7,15
0,085
7,65
1,00E+06
6,00
8
7,04
0,089
8,01
9,75E+05
5,99
24
6,24
0,073
6,57
9,00E+07
7,95
28
5,24
0,071
6,39
2,30E+08
8,36
32
5,74
0,053
4,77
1,50E+08
8,18
48
6,06
0,018
1,62
8,50E+07
7,93
72
6,45
1,00E+07
7,00
96
6,9
1,00E+07
7,00
La velocidad de crecimiento es determinada por la siguiente ecuación:
lnX –lnX0 = µ(t-t0)
Donde µ=velocidad de crecimiento, X= número de bacterias finales, Xo= número de bacterias
iniciales, t= tiempo final, t0= tiempo inicial.
Se evalúa la fase logarítimica ya que es
donde
las
bacterias
crecen
exponencialmente y están en constante
crecimiento. De acuerdo a ello, se elige
el punto inicial y final de esta fase. En
nuestro caso, el punto inicial es el T8 y
el punto final el T28.
Reemplazando en la ecuación
obtenemos:
Ln (2.3x108) –ln(9.75x105) = µ(28-8)
µ= 0.273
El tiempo de generación se representa en la siguiente ecuación:
Tg=Ln2/ µ
Reemplazando los datos obtenemos que el tiempo de generación es de 2 horas 53 minutos.
6.3.2 Densidad celular: los datos obtenidos fueron los que se presentan en la tabla.
Los datos de densidad celular se graficaron:
Nuestro tiempo inicial es T8 y nuestro tiempo final es T28. Reemplazando en la ecuación se
obtiene:
Ln (0.242) –ln(0.005) = µ(28-8)
µ= 0.194
El tiempo de generación es de 3 horas y 50 minutos.
6.3.3 Recuento en cámara Neubauer: los datos obtenidos en el recuento se presentan en la
Tiempo
Log(recuento)
Recuento (cv/ml)
0
6,00
1,00E+06
8
6,40
2,50E+06
24
7,22
1,65E+07
28
7,54
3,50E+07
32
7,86
7,20E+07
48
7,81
6,40E+07
72
7,24
1,75E+07
siguiente tabla y lo puntos fueron graficados con el fin de realizar la curva de crecimiento.
En la curva de crecimiento no se puede distinguir la fase lag con la fase log. Por lo que no se
puede fijar el punto de inicio de la fase logarítmica. Asumiendo que el punto inicial es el T8 al
igual que las dos curvas anteriores y el punto final T32, tenemos:
µ=0.085
6.3.5 Determinación de azúcares: como se observa en la gráfica el porcentaje de
carbohidratos ha ido disminuyendo. En los tres primeros puntos tuvo una tendencia
lineal. A partir del T8 el porcentaje fue disminuyendo. No se calculó los valores para
T72 ni T96 ya que serían valores muy pequeños dando posiblemente resultados
erróneos.
Tiempo
%Glu
0
0.087
4
0.085
8
0.089
24
0.073
28
0.071
32
0.053
48
0.018
6.3.6 Medida del pH: se observa que el pH ha ido disminuyendo hasta el T28 donde
fue su valor mínimo. A partir de este tiempo el pH fue aumentando hasta llegar a 6.9
que fue el pH al cual se culminó el proceso de fermentación.
Tiempo
pH
0
4
8
24
28
32
48
72
96
7.36
7.15
7.04
6.24
5.24
5.74
6.06
6.45
6.9
6.4 Bioensayo
6.4.1 Fermentado: se obtuvo tres fermentaciones. En la primera fermentación se
obtuvo la medición de pH, porcentaje de glucosa, densidad celular y recuento
microbiano. En la segunda y la tercera fermentación se midió el pH y se observó en el
microscopio las endotoxinas presentes. Los resultados de la tercera fermentación
fueron:
Tiempo
pH
Células vegetativas
Esporas
0
7.7
3.9 x 105
-
14
7.19
5 x 107
1.5 x 107
38
7.6
2 x 108
2 x 106
50
7.52
2 x 104
1.85 x 107
87
7.40
2 x 104
3.86 x 107
Esta última fermentación se utilizó para el tratamiento de fermentación líquida por
contener un mayor número de esporas que las anteriores.
6.4.2 Determinación de la mortalidad: el resultado de la mortalidad de las larvas se
obtuvo por día (Anexo 4). El grado de mortalidad con el número de larvas muertas de
las 10 repeticiones sobre el número de larvas totales en las 10 repeticiones por
tratamiento por 100.
6.4.3 Verificación de la infectividad a nivel de microscopio: después de 24 horas se
realizó la lectura del agar Mossel obteniendo el siguiente resultado:
El control es la placa superior donde se observó el cambio de color a amarillo lo que
significa que se metabolizó el manitol. Mientras que en los demás tratamientos se
observa un cambio de viraje a rosado lo que indica que el microorganismo en mayor
proporción no puede metabolizar el manitol.
Se observó a nivel de microscopio los microorganismos que están presentes en el agar
Mossel. Para ello se realizó una tinción Gram y una tinción de Coomassie por cada
tratamiento. Observándose que en el control solo se visualizan cocos positivos
compatibles con Staphylococcus sp.
Mientras que en los demás tratamientos se
observó en mayor cantidad los Bacillus lo que indica que la muerte de las larvas debió
ser producida por una infección bacterial.
Tinción Gram
Fermentación
en agar
Dipel
Formulado
Tinción de Coomassie
Fermentación
líquida
Control
6.4.4 Análisis estadístico
El diseño que se eligió fue el Diseño Completamente al Azar (DCA) ya que el único
factor que podría generar diferencias son los tratamientos (Mendiburu, 2012). Los
datos obtenidos en Excell fueron exportados al programa estadístico IBM SPSS
Statistics 20 bajo la siguiente matriz en forma horizontal:
C.Agar
7
Formulado
2
Control
1
C.Agar
7
Formulado
6
Control
7
C.Agar
4
Formulado
9
Control
6
C.Agar
3
Formulado
5
Control
2
C.Agar
4
Formulado
8
Control
2
C.Agar
2
Formulado
9
Control
4
C.Agar
5
Formulado
9
Control
5
C.Agar
6
Formulado
9
Control
3
C.Agar
3
Formulado
9
Control
0
C.Agar
6
Formulado
7
Control
5
Dipel
8
F.Liquida
2
Dipel
8
F.Liquida
6
Dipel
2
F.Liquida
5
Dipel
6
F.Liquida
5
Dipel
7
F.Liquida
6
Dipel
8
F.Liquida
5
Dipel
8
F.Liquida
9
Dipel
2
F.Liquida
5
Dipel
5
F.Liquida
7
Dipel
9
F.Liquida
5
La primera columna indica el nombre del tratamiento. Cada fila representa la repetición
del 1-10 de cada tratamiento. La columna dos representa el número de larvas muertas
durante los cuatro primeros días (7, 8, 9, 10 de marzo del 2012) ya que la mortalidad es el
total de larvas que se considera suficiente para medir el efecto del tratamiento. Se
consideró este número de días ya que después del cuarto día las larvas contabilizadas
como muertas no presentaban la coloración negra (síntoma de la infección de Bacillus
thuringiensis) y, más bien, parecía que habrían muerto por inanición ya que la hoja se
secaba rápidamente. Además, no se utilizaron los datos de larvas enfermas ni faltantes ya
que el estudio es medir el efecto de los tratamientos en la mortalidad por lo que solo
interesa las larvas muertas mientras que las faltantes se contabilizan como vivas
(Mendiburu, 2012).
El primer análisis estadístico que se realizó en el programa SPSS fue el Análisis de
Variancia (ANOVA) con un nivel de significación del 5% (valor alfa de 0.05), obteniéndose
el siguiente resultado:
Ho= µi = µ para todo i
H1= µi ≠ µ para al menos algún i.
ANOVA de un factor
Muertas
Suma de
cuadrados
Intergrupos
Intragrupos
Total
gl
Media
cuadrática
85,120
4
21,280
211,300
45
4,696
296,420
49
F
Sig.
4,532
,004
Tabla 1. ANOVA de los datos de mortalidad en el bioensayo.
La significancia de los tratamientos es 0.004 menor al valor de alfa de 0.05, por tanto se
rechaza la hipótesis nula (Ho) de igualdad entre tratamientos, o bien se dice que existen
diferencias significativas entre los tratamientos, lo que indica que al menos uno de los
tratamientos tiene un promedio diferente.
Como obtuvimos que existen diferencias significativas entre los tratamientos, el siguiente
paso fue determinar cuales son los tratamientos que difieren entre si, para esto utilizamos
la Técnica de Separación de Medias. En este caso, se utilizó la prueba de Rangos Múltiples
de Duncan; la salida del SPSS se observa en el cuadro siguiente:
Muertas
Tratamient
os
Control
C.Agar
Duncan F.Liquida
a
Dipel
N
Subconjunto para alfa =
0.05
1
2
3
10
10
10
10
3,50
4,70
5,50
4,70
5,50
6,30
5,50
6,30
Formulado
10
7,30
Sig.
,056
,125
,085
Tabla 2. Prueba Duncan para la mortalidad.
a. Usa el tamaño muestral de la media armónica = 10,000.
El cuadro de salida se puede presentar de la siguiente manera:
Tratamientos
Medias
Control
C. Agar
F. líquida
Dipel
Formulado
3.5=a
4.7=b
5.5=c
6.3=d
7.3=e
Significancia estadística
a
bc
cd
e
Tabla 3. Medias y su significación estadística dada por la prueba de Duncan.
Con un nivel de significación del 5% se puede afirmar que no existen diferencias
significativas entre los tratamientos cultivo en agar y fermentación líquida ni entre los
tratamientos fermentación líquida y Dipel por presentar medias homogéneas
estadísticamente.
Este resultado lo podemos comprobar y completar con la prueba de Scheffé:
Comparaciones múltiples
Variable dependiente: Muertas
Scheffé
(I)
(J)
Diferencia
Tratamientos Tratamientos
de medias
(I-J)
C.Agar
Dipel
Formulado
F.Liquida
Control
Error
típico
Sig.
Dipel
Formulado
F.Liquida
-1,600
-2,600
-,800
,969
,969
,969
Intervalo de confianza
al 95%
Límite
Límite
inferior
superior
,608
-4,71
1,51
,146
-5,71
,51
,952
-3,91
2,31
Control
C.Agar
Formulado
F.Liquida
Control
C.Agar
Dipel
F.Liquida
Control
C.Agar
Dipel
Formulado
Control
C.Agar
Dipel
Formulado
F.Liquida
1,200
1,600
-1,000
,800
2,800
2,600
1,000
1,800
3,800*
,800
-,800
-1,800
2,000
-1,200
-2,800
-3,800*
-2,000
,969
,969
,969
,969
,969
,969
,969
,969
,969
,969
,969
,969
,969
,969
,969
,969
,969
,819
,608
,898
,952
,098
,146
,898
,494
,009
,952
,952
,494
,385
,819
,098
,009
,385
*. La diferencia de medias es significativa al nivel 0.05.
Tabla 4. Prueba de Scheffé para la mortalidad.
-1,91
-1,51
-4,11
-2,31
-,31
-,51
-2,11
-1,31
,69
-2,31
-3,91
-4,91
-1,11
-4,31
-5,91
-6,91
-5,11
4,31
4,71
2,11
3,91
5,91
5,71
4,11
4,91
6,91
3,91
2,31
1,31
5,11
1,91
,31
-,69
1,11
Con un nivel de 0.05 podemos afirmar que existen diferencias significativas entre el
control y el formulado ya que la significancia de 0.009 es menor al valor de significación
de 0.05. Mientras que para las otras combinaciones no existen diferencias significativas.
VII.
DISCUSIONES
Identificación de Bacillus thuringiensis
Degradación de carbohidratos: Algunos microrganismos como el Bacillus thuringiensis son
aerobios facultativos (Porcar y Juárez-Pérez, 2004) por lo que en condiciones aerobias consumen el piruvato a acetil CoA y la oxidación total continúa en el ciclo de Krebs. En condiciones anaerobias, el piruvato sirve como aceptor de electrones para reciclar NAD+. Para
elaborar la misma cantidad de ATP, un anaerobio facultativo debería consumir azúcar a
una tasa mucho mayor cuando está fermentando que cuando está respirando (Campbell y
Reece, 2005). Es por esta razón que en las primeras doce horas ocurre un viraje de verde a
amarillo que indica la degradación de azúcares en medio anoxigénico de la glucosa, fructosa y sacarosa. El viraje de verde a amarillo indica un resultado positivo en la degradación
de los azúcares que puede ser por mecanismo oxidativo o fermentativo (Martos et al.,
1994) ya que durante el metabolismo del piruvato, se acumulan iones de sodio, lo que
aumenta el pH (BD, 2003).
El cambio de color a azul indica que una vez que se metabolizó los azúcares se metaboliza
como segunda fuente de energía, la fuente de nitrógeno. En medio anoxigénico, se tiene
al sulfato de amonio que se desdobla en amoniaco con la consiguiente alcalinidad del
medio por lo que el indicador azul de bromotimol vira al color azul (Murcia, s.f). En medio
oxigénico, se puede utilizar el citrato dando origen a ácidos orgánicos que al ser utilizados
como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos (Koser, 1923). El
medio entonces vira a azul.
Según fuentes bibliográficas Bacillus thuringiensis puede degradar glucosa, fructosa (Sauka
et al., 2008), sorbitol (Gomes et al., 2004), sacarosa (Smith, 1982), melaza (Aronson et al.,
1971). No se encontró bibliografía sobre la degradación de gel de sábila posiblemente sea
porque no puede degradarlo. Los resultados obtenidos para Bacillus thuringiensis var.
kurstaki concuerdan con la bibliografía aunque difieren
los resultados para Bacillus
thuringiensis var. tenebrionis (Btt1) que solo degradó en medio anoxigénico lo que podría
tratarse de una bacteria anaerobia estricta.
Pruebas de hidrólisis
Prueba de hidrólisis de almidón (agar almidón): Tanto Bacillus thuringiensis var. kurstaki
posee alfa- amilasa como Bacillus thuringiensis var. tenebrionis (Btt2) (Zibaee et al., 2010)
por lo que se observa un halo indicando que es amilasa positivo. En Btt1 no se formó ningún halo por lo que sigue indicando que no se trata del Bacillus en mención.
Prueba de hidrólisis de celulosa (agar CMC): en estudios anteriores se ha detectado la
actividad celulasa de Bacillus thuringiensis var. kurstaki y Bacillus thuringiensis var. tenebrionis (Dumas et al., 2009) según métodos colorimétrico por lo que se puede afirmar la
presencia de celulasa en ambas bacterias. Esto concuerda con los resultados obtenidos
para Btk y Btt2 al obtenerse un valor de IP mayor a 1; sin embargo, difiere del Btt1 donde
no ser observó ningún halo lo que hace sospechar de que el microorganismo sea Bacillus
thuringiensis var. tenebrionis.
Prueba de hidrólisis de proteínas (agar leche descremada): tanto Bacillus thuringiensis
var. kurstaki (Reddy et al. 2002) como Bacillus thuringiensis var. tenebrionis (Reddy et al.,
1997) poseen proteasas capaces de degradar las proteínas de la leche. Esta información
bibliográfica concuerda con los resultados obtenidos para el IP del Btk y Btt2 afirmándose
que poseen proteasas. El resultado que difiere es nuevamente el del Btt1 lo que da a pensar que efectivamente no se trata de un Bacillus thuringensis.
Prueba de manitol (agar Mossel): Bacillus thuringiensis pertenece al grupo de Bacillus
cereus que tiene como característica ser manitol negativo (Adley, 2006) y lecitinasa positivo que se manifiesta con un cambio de color a rosado. En el caso del Btk y del Btt2 poseen
se obtiene este cambio a rosado; sin embargo, para Btt1 viró a amarillo lo que indica que
puede fermentar el manitol tratándose seguramente de una especie diferente.
Prueba de hidrólisis de los tres azúcares (agar TSI): Bacillus thuringiensis puede ser capaz
de hidrolizar el almidón y fermentar la glucosa y fructosa, pero no puede producir indol ni
fermentar la galactosa ni lactosa (Keshavarzi, 2008). En los resultados obtenidos para Btk y
Btt2 fueron que solo fermentan glucosa (ácido/pico alcalino) mientras que Btt1 fermenta
glucosa, lactosa y/o sacarosa (pico ácido y fondo ácido). Como Bacillus thuringiensis fermenta la sacarosa pero no la lactosa se puede afirmar que el Btt1 no corresponde a esta
especie. El Btk y Btt2 fermentan solo glucosa aunque pueden fermentar la sacarosa no vira
a amarillo en 24h ya que la primera fuente de carbono que utiliza es la glucosa.
Producción del Bacillus thuringiensis var. kurstaki
Determinación de la cinética de crecimiento:
Medida del pH: el pH es un parámetro físico-químico importante durante el proceso de
producción. Es por ello, que iniciando el proceso se debe ajustar el medio a un pH entre
6,8-7,2 que es el rango de pH óptimo para este microorganismo. Luego, el pH baja después de 8-12 horas (Orietta, 2002). Esto concuerda con nuestros resultados que el pH empezó a bajar progresivamente hasta las 32h. Sin embargo, hay que tener en cuenta que un
pH cercano a 5 puede afectar la esporulación y la formación de los cristales, llegando incluso a inhibir el proceso de desarrollo de esta bacteria (Tirado, s.f.). En nuestra producción, se llegó a un pH de 5.24 a las 28h lo que podría haber afectado en la formación de
cristales. Esta disminución del pH se debe a la utilización de los carbohidratos antes de
que se alcance la fase de esporulación. Durante la esporulación el pH empezó a elevarse
debido a la utilización de los aminoácidos (Tirado, s.f.). Al final del proceso se tiene un
valor aproximado de 8.0. Esta cinética es un buen indicador del proceso (Orietta, 2002).
Tiempo de generación: esta medida depende del medio de cultivo, de la cepa y de las
características en la cual se encuentra el microorganismo. Sin embargo, se pueden hacer
pequeñas comparaciones con otros resultados. Por ejemplo, el tiempo de generación
para Btk fue 0.42, 0.40, 0.43 y 0.38 para las cepas Btk HD73, Btk KD1, BTK dipel y Btk HD1
dipel repectivamente (Kashyap y Amla, 2007). Mientras que nuestros resultados fueron
de 2.53 en recuento en placa, 3.50 en densidad celular. Estos valores son muy altos en
comparación a los encontrados para Btk lo que nos indica que nuestra fermentación no es
la adecuada y se deben realizar algunos cambios en ella. Uno de los factores que pudo
influir en retrasar el tiempo de generación fue la cantidad de vvm (3 inicialmente y 2.1
después de 24h hasta el final del proceso) que presentaba la fermentación ya que la gran
cantidad de oxígeno hacía que la bacteria consuma poco a poco la fuente de glucosa disminuyendo su tasa metabólica y conllevando a una menor tasa de crecimiento.
Curva de crecimiento: si se coloca una bacteria en un ambiente propicio para su desarrollo se puede realizar un gráfico que describe una curva de crecimiento que no es igual
para todas las bacterias, aunque en todas pueden distinguirse distintas fases:
La fase de latencia: no hay variaciones en el número de microrganismos. Sin embargo, las
células no están inactivas. Se están adaptando al medio, para lo cual sintetizan enzimas. Si
bien el número de células no varía, puede ser que éstas aumenten algo de tamaño debido
a que se va a producir la división (Negroni, 2009). En nuestras gráficas de curva de
crecimiento se observa hasta las ocho horas que el crecimiento del Btk se mantiene más o
menos constante por lo que se considera nuestra fase lag o de latencia.
La fase logarítimica: las células se duplican y la actividad metabólica se incrementa
notablemente (Negroni, 2009). In vivo la gráfica pueda no ser igual, porque hay factores
físicos y químicos que influyan en el crecimiento del microrganismo. Esta fase no se
puede evidenciar claramente en las tres gráficas ya que no concuerdan en todos los
puntos. Por ejemplo, para densidad celular se ve un crecimiento hasta las 48h mientras
que en recuento en cámara hasta las 32h y en recuento en cámara Neubauer hasta las
28h.
La fase estacionaria: las células nuevas remplazan a las que ya han muerto. La actividad
metabólica es más lenta. Es el momento de iniciación de la esporogénesis en las especies
como Btk. Esta fase se puede observar que coincide tanto en el recuento en placa como
Neubauer teniendo como termino a las 48 horas lo que indicaría que el punto 48h en
densidad celular debió ser error instrumental.
La fase muerte: el número de células muertas sobrepasa a las vivas. En nuestras gráficas
se observa un declive en las 72h en las tres gráficas lo que se puede decir que el número
de bacterias está disminuyendo en una tasa mayor que las que nacen. A las 96horas se
mantiene constante por lo que no se puede afirmar que este en fase muerte sino quizás
aún siga en fase estacionaria para estar seguros que está en fase muerte se debió tomar
más puntos.
Bioensayo
Análisis estadístico: para observar el efecto de los distintos tratamientos se sometió a un
Análisis de Varianza (tabla 1) donde se determinó que existen diferencias en el comportamiento de los tratamientos. En la prueba de rango múltiple de Duncan se observa que el
cultivo en agar tiene un efecto similar con la fermentación líquida y con el Dipel mientras
que el tratamiento con resultados significativos con respecto al control es el formulado.
Por lo que el formulado tiene un efecto significativamente mayor al control
sobre Spodoptera frugiperda.
Verificación de la infectividad a nivel de microscopio: se realizó esta prueba para
verificar si la muerte de las larvas contabilizadas hasta el cuarto día fue producida por
nuestra microorganismo en estudio, Bacillus thuringiensis var. kurstaki. Los resultados
obtenidos fueron que en el control solo se observaron cocos compatibles a
Staphylococcus sp. por la formación de racimos. Esto indica que estos cocos son los más
abundantes en la flora de Spodoptera frugiperda. En los demás tratamientos se observó
una mayor cantidad de bacilos en comparación a los cocos aunque estos siguen presentes
en cierta proporción. La diferencia a nivel de microscopio es clara ya que la mayor
cantidad de microorganismos en el interior de las larvas muertas fueron bacilos en los
tratamientos mientras que en el control solo se observan cocos. Se puede afirmar,
entonces, que la causa por la que murieron las larvas de Spodoptera frugiperda fue por
una infección ocasionada por el bacilo Bacillus thuringiensis var. kurstaki.
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IX. ANEXOS
Anexo 1: Preparación de los caldos de fermentación de carbohidratos utilizando el medio
API 50 CHL. Este caldo es preparado en la empresa BIOGEN. Cada tubo de 13 x 100 contiene
5ml. Ajustar el pH a 7 ± 0.2.
1. Peptona de carne --------- 0.7g
2. Extracto de levadura -----0.35g
3. Tween 80 ------------------0.07g
4. Fosfato dipotásico -------0.14g
5. Acetato de Na ------------0.25g
6. Sulfato de NH4 -----------0.14g
7. Sulfato de Mg.7H2O-----0.014g
8. Sulfato de Mn ------------0.0024g
9. Azul de bromotimol (16%)----0.0112g + 0.5ml de etanol 96%
10. Agua desionizada --------70ml
11. Carbohidratos a probar--- 0.1ml
a) Sacarosa
b) Glucosa
c) Fructosa
d) Sorbitol
12. Compuestos azucarados a probar --- 0.1 ml
a) Melaza
b) Gel de sábila
Anexo 2: Preparación del agar MN preparado en la empresa BIOGEN.
1.
2.
3.
4.
5.
Agar ------------------ 15g
Melaza --------------- 2g
Aminoácidos ------- 30ml
Solución ET(*) --------- 5ml
Agua potable -------965ml
Ajustar el pH a 7.0 ± 0.2.
Anexo 3: Caldo BMT preparado en la empresa BIOGEN.
1. Melaza ------- ----------------------2g
2. Aminoácidos HAPA-85 --------5 ml
3. Solución ET(*) -------------------5ml
4. Sulfato de amonio -------------0.5g
5. Agua potable ------------------- 990ml
Ajustar el pH del medio BMT a 7.0 ± 0.2.
(*) Solución ET:
1.
2.
3.
4.
5.
Sulfato magnesio ------- 2.46 g
Sulfato manganeso ---- 0.04 g
Sulfato Zinc -------------- 0.28 g
Sulfato fierro------------- 0.4g
Agua desionizada ----- 100 ml
Agitar vigorosamente hasta obtener mezcla homogénea. Adicionar 5ml de la solución por
litro de medio.
Anexo 4: Mortalidad de las larvas del bioensayo por día.
Leyenda:
Nro Rto: Número de repetición
E: Larvas enfermas
M: Larvas muertas
V: Larvas vivas
F: Larvas faltantes
Día 07/03/12.
Nro
Rto
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
E
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
CONTROL
M V F TOTAL
1 8 1
10
0 8 2
10
3 3 4
10
3 2 5
10
1 2 7
10
4 1 5
10
2 6 2
10
0 5 5
10
0 1 9
10
4 3 3
10
18 39 43 100
18.0%
DIPEL
M V F TOTAL
1 9 0
10
1 8 1
10
0 2 8
10
0 7 3
10
0 7 3
10
0 8 2
10
0 8 2
10
0 3 7
10
0 6 4
10
0 9 1
10
2 67 31 100
2%
E
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
E
0
0
0
2
2
1
0
0
0
1
6
FORMULADO
M V F TOTAL
2 7 1
10
2 6 2
10
6 4 0
10
1 4 3
10
5 3 0
10
2 7 0
10
7 2 1
10
6 3 1
10
6 3 1
10
5 2 2
10
42 41 11 100
42%
FERMENTO LIQUIDO 4/3
E
M V F TOTAL
3
2 5 0
10
1
4 2 3
10
1
3 4 2
10
1
2 3 4
10
0
2 7 1
10
1
3 2 4
10
0
9 0 1
10
0
4 2 4
10
0
2 6 2
10
0
1 4 5
10
7
32 35 26 100
32%
E
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
FORMULADO
M V
F TOTAL
0
0
7
7
3
1
2
6
3
0
1
4
4
0
0
4
3
0
0
3
7
0
0
7
2
0
0
2
2
1
0
3
2
1
0
3
1
1
0
2
27 4 10
41
65.85%
FERMENTO LIQUIDO 4/3
E
M
V
F
TOTAL
0
0
2
3
5
0
2
0
0
2
0
2
0
2
4
0
3
0
0
3
0
4
0
3
7
0
2
0
0
2
0
0
0
0
0
0
1
0
1
2
0
5
1
0
6
0
4
0
0
4
0
23
3
9
35
65.7%
CULTIVO EN AGAR
M V
F
TOTAL
6 2
2
10
7 2
1
10
3 3
4
10
3 4
3
10
4 2
4
10
1 2
7
10
5 5
0
10
4 4
2
10
3 2
5
10
5 2
3
10
41 28 31
100
28%
E
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Día 08/03/12.
Nro
Rto
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
E
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
CONTROL
M V
0
5
7
1
3
0
1
1
1
1
0
0
3
2
3
1
0
0
1
0
19 11
F
3
0
0
0
0
1
1
1
1
2
9
TOTAL
8
8
3
2
2
1
6
5
1
3
39
48.72%
E
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
1
M
7
7
2
6
7
8
8
2
5
9
61
DIPEL
V F TOTAL
0 2
9
0 1
8
0 0
2
0 0
7
0 0
7
0 0
8
0 0
8
1 0
3
0 1
6
0 0
9
1 4
67
91 %
E
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
CULTIVO EN AGAR
M
V
F
TOTAL
1
0
1
2
0
0
2
2
1
0
2
3
0
0
4
4
0
0
2
2
1
0
1
2
0
0
5
5
0
1
3
4
0
1
1
2
1
0
1
2
4
2
22
28
14.29%
Día 09/03/12.
Nro
Rto
1
2
4
5
7
8
CONTROL
Nro
DIPEL
Nro
E M V F TOTAL Tto E M V F TOTAL Tto E
0 0 4 1
5
8 0 0 1 0
1
2 0
0 0 0 1
1
0 0 1 0
1
8 0
0 0 2 0
2
0%
9 0
0 0 1 0
1
10 0
0 0 2 0
2
0
0 0 1 0
1
0 0 10 2 12
0%
FORMULADO
Nro FERMETO LIQ. 4/3 Nro CULTIVO AGAR
M V F TOTAL Tto E M V F TOTAL Tto E M V F TOTAL
1 0 0
1
1 0 0 2 0
2
8 0 1 0 0
1
1 0 0
1
9 0 0 1 0
1
9 0 0 0 1
1
0 1 0
1
0 0 3 0
3
0 1 0 1
2
0 1 0
1
0%
50%
2 2 0
4
50%
Día 10/03/12.
Nro
Rto
1
4
5
7
8
E
0
0
0
0
0
0
CONTROL
M V
0 4
0 1
0 1
0 1
0 0
0 7
F
0
1
0
1
1
3
Nro
DIPEL
Nro
TOTAL Tto E M V F TOTAL Tto E
4
8 0 0 1 0
1
9 0
2
0 0 1 0
1
10 0
1
0%
0
2
1
10
0%
FORMULADO
M V F TOTAL
1 0 0
1
1 0 0
1
2 0 0
2
100%
Nro
FERMETO 4/3
Tto E M V F TOTAL
1 0 0 1 1
2
9 0 0 1 0
1
0 0 2 0
3
0%
Nro
CULTIVO AGAR
Tto E M V F TOTAL
8 0 1 0 0
1
9 0 0 0 1
1
0 1 0 1
2
50%
Día 11/03/12.
Nro
Rto
1
4
5
7
8
E
0
0
0
0
0
0
CONTROL
M
V
1
2
1
0
1
0
0
1
0
0
3
3
F
1
0
0
0
0
1
Nro
TOTAL Tto E
4
8 0
1
0
1
1
0
7
DIPEL
M V
1
0
1
0
Nro
F TOTAL Tto E
0
1
9 0
0
1
10 0
100%
0
FORMULADO
Nro
M V F TOTAL Tto E
0
0 0
0
1 0
0
0 0
0
9 0
0
0 0
0
0
0%
M
0
0
0
FERMETO 4/3
V
F
TOTAL
1
0
1
0
1
1
1
0
2
0%