Aplicación de los microarrays de DNA al estudio de la resistencia a isoniazida en Mycobacterium tuberculosis PNAS, 22: 12833-12838 (1999) Tuberculosis • La tuberculosis es una enfermedad crónica infecciosa causada por Mycobacterium tuberculosis. A pesar del desarrollo de vacunas y fármacos, continua siendo una importante causa de mortalidad. • Tuberculosis y SIDA son las principales causas de muerte por enfermedades infecciosas (3 millones/año). • Se estima que hay 7 millones de nuevos casos por año. • La infección por HIV incrementa la mortalidad por tuberculosis al disminuir la resistencia. Mycobacterium tuberculosis • Después de varias décadas de retroceso debido al desarrollo de fármacos efectivos, la incidencia de la tuberculosis comenzó a incrementar a mediados de los 80. • Una causa del aumento de la tuberculosis es la aparición de cepas de M. tuberculosis resistentes a antibióticos. • El creciente problema de la resistencia a fármacos combinado con la incidencia global de esta enfermedad pone en evidencia la urgente necesidad de nuevas terapias antituberculosas. • La pared de M. tuberculosis, cuya integridad resulta esencial para la viabilidad de la bacteria, proporciona toda una batería de potenciales dianas para el desarrollo de nuevos fármacos. Mycobacterium tuberculosis • La primera línea de defensa contra la mayor parte de las infecciones bacterianas incluye a los macrófagos, células del sistema inmune que fagocitan a las bacterias y las atacan con agentes químicos y bioquímicos. • El stress oxidativo es parte de la defensa natural del huésped a la infección bacteriana. • Excepcionalmente, M. tuberculosis está adaptado a sobrevivir dentro del macrófago: parte de esta adaptación se debe a su pared celular que tiene una baja permeabilidad. • La bacteria también realiza cambios sustanciales en los perfiles de expresión génica, para adaptarse al estado fisiológico del macrófago (bajo pH y stress oxidativo). Isoniazida (INH) • Un fármaco primario utilizado en la prevención y tratamiento de la tuberculosis es la isoniazida (hidracida del ácido isonicotínico). • La isoniazida ataca a M. tuberculosis al interferir en la síntesis de la pared celular, sin la que la bacteria no puede sobrevivir. • Evidencias genéticas y bioquímicas indican que las dianas de la isoniazida incluye enzimas que participan en la biosíntesis de ácidos micólicos (principales componentes de la pared celular): • InhA, enoil ACP reductasa • KasA, β-cetoacil ACP sintasa • Las micobacterias presentan una pared celular muy compleja con abundancia de lípidos (algo excepcional en bacterias Gram +). Pared celular de M. tuberculosis Ácidos micólicos • Los ácido micólicos son α-alquil-β-hidroxiácidos grasos de cadena larga (60-90 átomos de carbono) y son los lípidos mayoritarios de la pared celular de micobacterias. • Los ácidos micólicos están compuestos de una cadena α de ácidos grasos lineales saturados de tamaño intermedio (R1=C24C26), y una cadena larga (R2>C50) de ácido meromicólico. • La isoniazida bloquea múltiples componentes del sistema FAS-II (sistema de la ácido graso sintasa tipo II) que se requieren para la completa extensión de la cadena de ácido meromicólico. Sistema FAS-II • En la biosíntesis de las cadenas acil (R1 y R2) de los ácidos micólicos intervienen dos sistemas: • El sistema FAS-I que lleva a cabo la síntesis de novo de ácidos grasos y genera precursores de 14-26 carbonos. • El sistema FAS-II actúa sobre los productos de FAS-I unidos a AcpM (acyl carrier protein), elongándolos para generar ácidos grasos de 24-56 carbonos. • A continuación, los ácidos meromicólicos son modificados: un meromicolato se condensa con un ácido graso para dar un βoxomicolato, que se reduce para formar el ácido micólico. Sistema FAS-II Sistema FAS-II • El sistema FAS-II es dependiente de AcpM (acyl carrier protein). • Aunque el mecanismo preciso de toxicidad de la isoniazida no ha sido descrito, la acción inhibidora de la isoniazida en forma activa (INH*) parece ser el resultado del efecto sobre tres dianas en el sistema FAS-II: InhA, KasA y AcpM. • Por un lado la isoniazida se une al NADH en el sitio activo de InhA (enoil ACP reductasa dependiente de NADH). • Pero además forma un complejo ternario al unirse covalentemente con las enzimas KasA (β-cetoacil ACP sintasa encargada de la elongación de los ácidos grasos) y la AcpM (acyl carrier protein). Sistema FAS-II Resistencia a isoniazida • Después de la absorción por la bacteria, la isoniazida se tiene que convertir a una forma activa (INH*). • La enzima catalasa KatG efectua la activación de la isoniazida y está posiblemente implicada en la resistencia antibiótica. Su función natural es eliminar peróxidos en situaciones de stress oxidativo. • La isoniazida es el fármaco más utilizado entre el arsenal de fármacos antituberculosos y al que más frecuentemente emerge la resistencia. • La resistencia a isoniazida emerge frecuentemente debido a mutaciones que inactivan KatG. Detección mediante microarrays de cambios en los perfiles de expresión génica • La era post-genómica en la investigación y diseño de nuevos fármacos antituberculosos se inició a partir de la secuenciación del genoma de M. tuberculosis H37Rv. • Esto hizo posible el primer abordaje genómico a la biología de este patógeno y al estudio de la resistencia a fármacos. • Objetivo: Examinar cambios en la expresión génica de cepas de M.tuberculosis susceptibles y resistentes durante la exposición a fármacos (isoniazida y etionamida). • Aunque previamente se habían realizado estudios bioquímicos que implicaban a algunas proteínas en la resistencia, se llevó a cabo un estudio general para identificar el mayor número de posibles dianas para fármacos antituberculosis. Detección mediante microarrays de cambios en los perfiles de expresión génica • La etionamida está relacionada estructuralmente con la isoniazida y se utiliza como antibiótico de segunda linea. • A diferencia de la isoniazida, no tiene el requerimiento de la activación mediada por KatG. • Isoniazida y etionamida inhiben la biosíntesis de ácidos micólicos y tienen como dianas las mismas enzimas del sistema FAS-II. • Hipótesis: la etionamida genera un perfil similar de respuesta génica que la isoniazida en M. tuberculosis. Microarray de DNA de M. tuberculosis H37Rv • Amplificación con primers específicos de cada ORF, tamaño de los amplicones: 200-1000 bp. • Impresión robótica en portas recubiertos de polylisina. • Control DNAs: DNA genómico total y DNA ribosómico. • Construcción de 3 series de microarrays: • Version completa: 3.834 ORFs del total de 3.924 ORFs (97%). • Versiones reducidas: 203 ORFs seleccionadas conteniendo genes que codifican enzimas lipogénicas o lipolíticas (29%). Perfiles de expresión génica con un Microarray de DNA Preparar Microarray Clones DNA Purificar productos PCR Impresión robótica Aislar RNA y marcaje Muestra A Aislar RNA Muestra B Aislar RNA Marcaje con Cy5 Marcaje con Cy3 Mezclar, hibridar sondas y analizar datos Hibridación microarray Lavado Analizar datos Proceso para el análisis de microarrays de DNA Cepa M. tuberculosis con fármaco Cepa M. tuberculosis sin fármaco Crecimiento Tratamiento con fármaco: INH o Etionamida en medio 7H9 Aislamiento RNA Marcaje con Cy3-dUTP Marcaje con Cy5-dUTP Combinar los dos cDNAs Hibridación, 63°C, 4-6 h Lavado Escaneado Proceso para el análisis de microarrays de DNA • Cultivos líquidos de M. tuberculosis en fase de crecimiento exponencial. • Toma de muestras bacterianas a intervalos definidos durante las 8 primeras horas de tratamiento con el fármaco. • Marcaje cDNAs: • Inicio de tratamiento: t = 0, marcaje con Cy3 • Resto de intervalos(20 min, 40 min, 1 h, 4 h, 8 h): marcaje con Cy5 • Para cada intervalo de tiempo, los dos cDNAs marcados (Cy3/Cy5) se mezclaron e hibridaron con el microarray de DNA de M. tuberculosis H37Rv. Detección mediante microarrays de cambios en los perfiles de expresión génica • M. tuberculosis 1254: cepa sensible a isoniazida y etionamida. • Microarray de DNA version completa (3.834 ORFs). Detección mediante microarrays de cambios en los perfiles de expresión génica • La exposición a isoniazida aumenta significativamente la transcripción de dos clases de genes que codifican proteínas fisiológicamente relevantes para el modo de acción del fármaco: • A. Genes implicados en la síntesis de la pared celular, incluyendo un cluster de 5 genes (Rv2243-Rv2247) que codifica componentes del sistema FAS-II y fbpC (trehalosa dimicolil transferasa). • B. Genes implicados en procesos de respuesta a los efectos tóxicos del fármaco: efpA, fadE23, fadE24 y ahpC que codifica la alkil-hidroperóxido reductasa. • La etionamida genera un perfil similar de respuesta génica que la isoniazida en M. tuberculosis 1254. Detección mediante microarrays de cambios en los perfiles de expresión génica • Microarray de DNA version reducida (203 ORFs) de M. tuberculosis 1254. • Tratamiento isoniazida a 4 h. • Posiciones B13-16: cluster de genes FAS-II (Rv2244-Rv2247). Posiciones P2-P3: DNA control premarcado con Cy3 y Cy5. Posiciones A1, P1 y P16: DNA genómico. Posiciones A4-A10: DNA ribosómico. • • • Detección mediante microarrays de cambios en los perfiles de expresión génica • M. tuberculosis 4309A: • resistente a isoniazida • sensible a etionamida. • M. tuberculosis 4309A no presenta un perfil de expresión génica dependiente de isoniazida. • El tratamiento de M. tuberculosis 4309A con etionamida produce un perfil de expresión génica similar al de la cepa 1254 tratada con isoniazida: inhibición del sistema FAS-II. Detección mediante microarrays de cambios en los perfiles de expresión génica Tratamiento isoniazida • Tratamiento etionamida Microarray de DNA version reducida (203 ORFs) de M. tuberculosis 4309A. Perfil de expresión génica temporal de M. tuberculosis 1254 en presencia de isoniazida () - inhA () - fas (o) - kasA (∆) - fadE24 (+) - ahpC (⃞) - efpA Confirmación de los perfiles de expresión génica de M. tuberculosis 1254 en presencia de isoniazida • • • El análisis de microarrays muestra que la expresión de inhA y fas no cambia en presencia de isoniazida: InhA, enoil ACP reductasa dependiente de NADH del sistema FAS-II Fas, sistema FAS-I • Para comprobar los resultados obtenidos en los experimentos de microarrays, se realizaron experimentos de RT-PCR: comparación de la abundancia de transcritos kasA, efpA y ahpC en M. tuberculosis sin tratamiento y tratada con isoniazida. • La expresión inducida por isoniazida de estos genes se confirmó mediante RT-PCR. Confirmación de los perfiles de expresión génica de M. tuberculosis 1254 en presencia de isoniazida Perfiles de expresión génica en presencia de isoniazida • La inducción de estos genes se detecta desde los 20 minutos después del tratamiento con isoniazida. • Por tanto, la inhibición del sistema FAS-II se detecta rápidamente y provoca una respuesta a nivel transcripcional. • Las células de M. tuberculosis tratadas con isoniazida reconocen los efectos del fármaco, y se activan mecanismos de respuesta mediante un aumento de la expresión de estos genes para tratar de compensar las actividades reducidas. • Como consecuencia del tratamiento con isoniazida, no se producen ácidos micólicos y ocurre una acumulación de precursores, ácidos grasos saturados (C24-C26), y una reducción de ácidos micólicos. Perfiles de expresión génica en presencia de isoniazida • La acumulación de ácidos grasos saturados (C24-C26) probablemente refleja la etapa de la síntesis de ácido meromicólico que es interrumpida por la acción de la isoniazida. • La acumulación de precursores está asociada con un incremento de la producción de KasA y AcpM. • La inducción de estos genes es la consecuencia de un mecanismo de retroregulación que detecta el desequilibrio de precursores y la reducción de ácidos micólicos. • También es probable que la isoniazida induzca genes que codifican otros componentes relacionados de la ruta biosintética de ácido micólico. Perspectivas • La investigación y desarrollo de fármacos antituberculosis es un reto continuado. • Los resultados de microarrays de DNA confirman las observaciones de estudios bioquímicos e indican nuevos genes directamente implicados en los procesos inhibidos por isoniazida. • Los resultados derivados de este tipo de estudios con microarrays de DNA pueden definir nuevas dianas para fármacos y sugieren nuevos métodos para identificar componentes que inhiben estas dianas.