Resistencia genética. Evaluación de la resistencia y susceptibilidad de genotipos de soja a la mancha ojo de rana Bibiana Ferrari Asociados DON MARIO S.A bferrari@donmario.com TE EN BI AM PA TÓ G EN O PATOSISTEMA HUÉSPED RESISTENCIA GENÉTICA TIPO DE RESISTENCIA 1. Resistencia vertical, oligogénica, completa, cualitativa o de interacción diferencial entre el genotipo del patógeno y del huésped. Genes mayores. La resistencia vertical inhibe el desarrollo de epifitias. 1. 3 GENES DE HERENCIA SIMPLE Y DOMINANTE 1. Rcs1 (Probst,et.al 1958) en la variedad Lincoln 2. Rcs2 (Probst et.al 1965) en la variedad Kent. 3. Rcs3 (Yorinori 1980; Phillips & Boerma, 1982) en la variedad Davis 2. Genes no alélicos a Rcs3 (estudios de relaciones R/S en F2 de poblaciones x DAVIS dan relación 15:1) Stonewall, Ransom, Lee (Pace,et.al 1993) ,en Peking (Baker,et.al 1999). Santa Rosa, 2 genes de resistencia.(Cordeiro, 1986) 3. Gen Rcsc7 en Hardison, Dong Nong 84-898 y Ozzie resistencia a Raza 7 de China. (Zou et.al 1999) no está homologada por el Comité Internacional de genética de soja. 4. Tantos genes de resistencia como razas del patógeno- probablemente 50. Com.personal. Dan Phillips.2010 TIPO DE RESISTENCIA Dentro de resistencia vertical podemos observar estructuras de defensa necrótica. Reacción de hipersensibilidad en función de la agresividad del patógeno (velocidad de infección). A 7 días de la inoculación Yang,W & D.Weaver, 2001 Davis 1.8% area afectada sobre testigo susceptible con 18.1% area afectada. TIPO DE RESISTENCIA Gravina, Sediyama, et.al (2004) efectos genéticos dominantes, aditivos y pleiotrópicos Por la presencia de genes en distintos loci. Cristalina sel. UFV_1 [(S100x CNS) X (sel. Nanking)], Davis & Uberaba [Sta.Rosa x UFV-1] Resistencia aparente Tolerancia- susceptibles al patógeno (reacción compatible) pero muestran pocos daños. MR S S Respuesta Gen a Gen en Resistencia Vertical Cualquier gen mayor de resistencia (R) puede actuar solamente si el patógeno es portador del correspondiente gen de avirulencia (Avr) Reacción de compatibilidad entre patógeno y huésped: SUSCEPTIBILIDAD (+). Reacción de incompatibilidad entre el patógeno y huésped: RESISTENCIA (-). Formulas de virulencia: nos dan las RAZAS DEL PATÓGENO, variación intraespecífica a través de la especialización patogénica sobre distintos genotipos del huésped DIFERENCIALES: DIFERENCIALES CON GEN CONOCIDO: DAVIS. KENT, LINCOLN DIFERENCIALES CON GEN DESCONOCIDO (complica los estudios de determinaciones genéticas) PEKING, CNS, PALMETTO, TRACY, S100, RICHLAND, HOOD, LEE RAZAS DE MOR PROPUESTAS EN USA Y BRASIL DIFERENCIAL Peking Lincoln Kent Lee Davis Hood HILL Roanoke Bragg Santa Rosa Clark Bienville Tanner R1 CsR2 R2 R3 CsR1 CsR3 R4 CsR4R5CsR5 CsR6 CsR7 CsR8 CsR9 CsR10 CsR11 CsR12 CsR13 CsR14 CsR15 CsR16 CsR17 CsR18 CsR19 CsR20 + - -/+ -+ ++ + + - ++ + + + + + + + + + + + - - -++ + + + + + + + + + + + + --+ + + + + + + + + --- + - - ++ + + + + + + + -+ -- + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -+ -/++ + + + + + I + + + + + + + + + + + + Phillips, Boerma, 1982 Razas en Brasil _Yorinori, 1992 • 14 RAZAS EN CHINA (MA & LI, 1997) • 23 RAZAS EN BRASIL (YORINORI 1992) • 12 RAZAS EN USA (GRAU et.al, 2004). no hay un set de diferenciales que homologue las razas entre estos países NUEVO SET DE DIFERENCIALES SOBRE 93 AISLAMIENTOS Y 38 GENOTIPOS Mian, Missaoui, Walker, Phillips y Boerma,2008- Estudiaron la reacción de 3534 combinaciones de aislamientos y genotipos 93 aislamientos: 71 USA, 15 BRASIL y 7 DE CHINA. Davis Hood Lee CNS Peking Tracy Kent Palmetto Lincoln S 100 Richland Blackhawk R5 (5) + + - R6 (6) + - - - + + + R7 (8) + + + + + Designated race (isolate) R8 R9 R10 (7) (4) (8) + + + + + + + + + + + + + + + R11 (4) + + + + + R12 (3) + + + + + + R13 (12) + + + + + + + R14 (1) + + + + + + + R15 (2) + + + + + + + + Prevalencia del Rcs3 en el genotipo de soja Mian, et al 2009 Haplotipo Davis_ Rcs3 •DE 1350 GENOTIPOS INOCULADOS CON RAZA 11, ENTRE VARIEDADES DE GRUPOS III A V SÓLO EL 5% FUE R A MOR •El 16% de los R a MOR poseen el gen Rcs3 (0.8%) grupo madurez III IV V total R a MOR 13 45 15 73 % 0.96 3.33 1.11 5.41 En la Recso el 10% de las variadades GM III, IV & V son R a MOR, La mayoría con haplotipo Davis CARACTERIZACIÓN DEL HUESPED CA M PO •INFECTARIOS ASISTIDOS ES R ES O D AR C A UL AR EC M OL M •ECR-LOTES INVERNÁCULO PROTOCOLOS-DIFERENCIALES PRINCIPIOS BÁSICOS PARA UNA EVALUACIÓN CORRECTA 1. CONOCIMIENTO O PONDERACIÓN DEL GENOTIPO A SER EVALUADO (IMPORTANCIA DE EQUIPOS DE TRABAJO MULTIDICIPLINARIO) 2. SIEMBRA DE PATRONES, TESTIGOS Y/O DIFERENCIALES DE COMPORTAMIENTO CONOCIDO 3. CON LA ALEATORIZACIÓN CORRESPONDIENTE AL ENSAYO O DISEÑO EN EL PROTOCOLO DE INVERNÁCULO. 4. DE LOS GRUPOS DE MADUREZ PRESENTES EN EL ENSAYO CARACTERIZACIÓN Y SELECCIÓN DIFERENCIALES: LÍNEAS HOMOCIGOTAS PARA EL GEN DE RESISTENCIA. LINEAS DONORAS DE LA RESISTENCIA. VARIEDAD: conjunto vegetal distinto, homogéneo y estable. PARA LOS CARACTERES SELECCIONADOS. SI PARTIMOS DE UNA LINEA R X LINEA S 1. BAJO PRESIÓN DE LA ENFERMEDAD (FENOTIPO) O POR MM seleccionamos R HOMOCIGOTA. 2. SIN PRESIÓN DE MOR EN LA SELECCIÓN: 1. HOMOCIGOTAS DOMINANTES R DISTINTAS COMBINACIONES R_S. 2. HOMOCIGOTAS RECESIVOS S 3. HETEROCIGOTAS. 50 R_ 50 S DE ACUERDO A LA RELACIÓN R/S Y EL UMBRAL DE DAÑO DEBE DEFINIRSE LA NOMENCLATURA A UTILIZAR EN SU CARACTERIZACIÓN. ATRIBUTOS QUE DESCRIBEN LA INFECCIÓN PARA LA CARACTERIZACIÓN LA ENFERMEDAD SERÁ POSIBLE SI EXISTE REACCION DE COMPATIBILIDAD PATOGENO: VIRULENCIA O PATOGENICIDAD HUESPED: SUSCEPTIBILIDAD GENÉTICA 1. INCIDENCIA: caracteristica cuantitativa, Genotipos presente R+S o ausente INCIDENCIA: N°PL. QUE PRESENTAN ENFERMEDAD/ PLANTAS TOTALES Podríamos confundir una baja incidencia en una variedad susceptible. SEVERIDAD: AREA AFECTADA Y TAMAÑO DE LA LESIÓN- función del tiempo INDICE DE LA ENFERMEDAD: área afectada x (diam.promedio lesión)2 SEV INC El nivel de incidencia dependerá del porcentaje de plantas R y S CALCULO DE INDICE DE ENFERMEDAD TESTIGO area af. tam.lesion 0.10 1 0.20 1 0.25 1 0.10 2 0.15 2 0.20 2 0.10 3 0.21 2 0.25 2 0.30 2 0.35 2 0.21 3 0.25 3 0.30 3 0.35 3 0.36 3 0.40 3 0.45 3 0.50 3 0.36 4 0.40 4 0.45 4 0.50 4 0.36 4.5 0.40 4.5 0.45 4.5 0.50 4.5 IE 0.10 0.20 0.25 0.40 0.60 0.80 0.90 0.84 1.00 1.20 1.40 1.89 2.25 2.70 3.15 3.24 3.60 4.05 4.50 5.76 6.40 7.20 8.00 7.29 8.10 9.11 10.13 REACCION Rating Campo R 10 R 15 R 15 R 15 R 15 R 15 MR MR 20 MR 20 MR 20 MR 20 MR 20 MR 20 MR 20 MR 20 S 25 S 30 S 30 S 40 S 40 S 40 S 45 S 50 S 50 S 50 S 50 S 50 incidencia* H TÉRMINOS UTILIZADOS EN ESCALAS DE EVALUACIÓN 1. NUMERO DE LESIONES POR CM2 2. NUMERO DE LESIONES POR AREA FOLIAR 3. DIAMETRO DE LA LESIÓN 4. DIAMETRO PROMEDIO DE LAS LESIONES Y RANGO 5. % AREA FOLIAR AFECTADA 2 X 4 6. INDICE DE LA ENFERMEDAD: NUM. LESIONES/HOJA X (DIAM. PROM) 2 SEVERIDAD (da prioridad a tamaño de la lesión) Las evaluaciones son válidas y comparativas con alta severidad. Testigos susceptibles >36% área TL 3-5 ESCALA DE EVALUACIÓN Reacción R area afectada (%) tamaño lesión (mm) R 0-20 1-2 MR 21-35 2-3 S > 36 3-5 35% 1-3 MR 20% 2-3 <10% 1-2 35% 2-4 80% 4-5 S S 35% 3-5 55-60% 1-5 50% 3-5 EVALUACIÓN A CAMPO Conocer el tipo de reacción. Ambiente ideal para caracterizar. En parcelas de ensayo de 2 o 4 surcos. Se evalúan los testigos S conocidos. Si se observa alta severidad y el 100% de las plantas con síntomas, se procede a la evaluación de las líneas experimentales 3. Reacción SUSCEPTIBLE, se confirma con pocas repeticiones/ambientes (localidad, año, modalidad). Menos dependiente de la severidad del ataque.(ya que las MS luego serán S o AS) 4. Reacción RESISTENTE, MAYOR NÚMERO DE AMBIENTES (grados de libertad) aumentan confianza del dato. A campo se sobreestiman en infecciones de baja severidad. Alta severidad, puede aparecer reacción HIPERSENSIBLE. 5. Reacción MOD.RESISTENTE, sólo se confirma en ambientes con alta severidad. Baja severidad sobreestima MR que luego serán MS/S Utilidad de cada ambiente de evaluación CARACTERÍSTICA CAMPO/INF. ASISTIDO INVERNÁCULO INÓCULO Real/actual _ desconocido** Raza/s conocidas Datos relevados No extrapolables _citar Aislamiento de “….. REPETIBLES Diferenciación en inscripción Purificación genética. Variedades MR Correcta caracterización subestimadas Nuevos aislamientos Cambio de comportamiento Protocolos en desarrollo de los progenitores. SELECCIÓN DE PROGENIES Ventajas ** siembra de diferenciales EVALUACIÓN EN INVERNÁCULO DESARROLLO DEL PROTOCOLO DE TRABAJO INSTALACIONES DE DON MARIO EVALUACIÓN CONJUNTA CON EL EQUIPO DE FITOPATOLOGOS (M.Scandiani, M.Carmona, A. Luque, N.Formento, Tartabini y Ferri) ESTUDIOS PREVIOS Autores Baker & Weaver Yang, Weaver Gravina, Sediyama Missaoui, Phillips, Boerma Mian. Et.al Cruz & Dorrance año volumen asp. 1999 1 ml/planta 2001 0.25 ml/hoja 2003 10 ml/planta 2007 2.5 ml/hoja 2008 0.3 ml/hoja 2009 0.3 ml/hoja conc. Inóculo 4 4x10 6 4-6x10 4 4x10 4 4-6x10 4 4-6x10 4 4-6x10 cam.húmeda (16+8)*3 72 hs 48 hs 72 hs 48 hs 72 hs temp. 30°C 25-30°C 20-30°C 20-30°C 25-30°C 22-28°C DDI 21 días 14 días 20 días 14 días 14 días 14 días EVALUACIÓN EN INVERNÁCULO DESARROLLO DEL PROTOCOLO DE TRABAJO • AJUSTE DEL AMBIENTE FAVORABLE PARA LA EXPRESIÓN DE LA INFECCIÓN 1. En la etapa de ajuste de ambiente, luego de la inoculación: cámara húmeda 72 hs. luego invernáculo cond. normales (40-45% HR) cámara húmeda 48 hs. luego cond. normales cámara húmeda 48 hs. luego foggers, 180 seg. / 15 min. ELcasos AMBIENTE QUE MÁS en todos los se mantuvieron 12 hs.DISCRIMINÓ de día/noche CH. 72 HS luego cond. normales EVALUACIÓN EN INVERNÁCULO: PROTOCOLO UTILIZADO Patógeno : El aislamiento utilizado fue el denominado CCC 172-09 (=09-320, código ingreso Laboratorio Río Paraná) (=LARP70 código colección Laboratorio Río Paraná) obtenido de hojas con lesiones de MOR, de cultivos de soja del sur de Monte Buey Para la inoculación se utilizó una suspensión de conidios de C. sojina con una concentración de 1,3 x 105 conidios/ml, a la que se adicionó una gota del dispersante Tween 20 (1ml/l) Hospedante: Los genotipos de soja inoculados fueron: Davis, Peking, Lee, Hood, Palmeto, S100, CNS, Kent, Roanoke, Richland, Lincoln y Blackhaw en macetas de 15 cm de diámetro, 10 plantas por maceta en 2 macetas/rep por genotipo. La inoculación se realizó en estado fenológico V2-V3 utilizando mochila manual aplicando un total de 10 ml/ maceta (1 ml/ planta) EVALUACIÓN EN INVERNÁCULO: PROTOCOLO UTILIZADO Ambiente: En la duración del ensayo se registró una temperatura media de 26°C, una mínima 20ºC durante la noche y una máxima de 32°C durante las horas de la tarde, registrados con data logger (Gráfico 1). temp. °C 32 31 30 29 28 27 26 25 24 23 22 20 EVALUACIÓN EN INVERNÁCULO: PROTOCOLO UTILIZADO Evaluación: La lectura de la reacción varietal de genotipos de soja a C. sojina se efectuó a los 21 DDI, considerando las 10 hojas trifoliadas más afectadas, las que se extrajeron en bandejas plásticas rotuladas. Genotipo Reacción Davis Peking Tracy Palmetto Hood Kent CNS Lee Lincoln S 100 Richland Blackhawk RAZA 11 – – – – – – _ + + + + + R R R R R R R S S S S S CONSIDERACIONES FINALES •HAY MUCHAS FUENTES DE RESISTENCIA GENÉTICA •LAS EVALUACIONES TANTO A CAMPO COMO EN INVERNÁCULO DEBEN SER REALIZADAS TENIENDO EN CUENTA EL COMPORTAMIENTO DE TESTIGOS CONOCIDOS Y LA EXPRESIÓN Y REPETIVIDAD QUE EN ELLOS OBSERVEMOS . •TODO COMPORTAMIENTO DISTINTO AL ESPERADO NOS DEBE LLEVAR A DESARROLLAR HIPÓTESIS DE TRABAJO EN BUSCA DE NUEVAS RESPUESTAS. •LA CARACTERIZACIÓN DEL MATERIAL GENÉTICO CON EL QUE TRABAJAMOS NOS PERMITIRÁ, LA CREACIÓN DE POBLACIONES ESPECÍFICAS PARA EL DESARROLLO DE NUEVOS MARCADORES, TENDIENTES A COMBINAR AL MAXIMO TODAS LAS FUENTES POSIBLES. •DEBEMOS APROVECHAR LAS LÍNEAS MR PARA CRUZAR CON LAS R DE DISTINTO ORIGEN. CONSIDERACIONES FINALES •A 50 AÑOS DEL DESCUBRIMIENTO DEL Rcs3 DEBEMOS APROVECHAR LA POSIBILIDAD DE SABER, A TRAVÉS DEL MM DE SU PRESENCIA EN UNA LÍNEA R PARA COMBINARLA CON OTRAS FUENTES. •TAL VEZ NO PODAMOS REPETIR LECTURAS A CAMPO COMO EN LAS DOS ÚLTIMAS CAMPAÑAS QUE NOS PERMITIERON UN PROFUNDO CONOCIMIENTO DE LAS DISTINTAS FUENTES DE RESISTENCIA PRESENTES EN LOS PROGRAMAS DE INVESTIGACIÓN, DE ALLÍ LA IMPORTANCIA DEL AJUSTE DE LAS LECTURAS EN INVERNÁCULO, ASÍ COMO LA IMPLEMENTACIÓN DE INOCULACIONES ARTIFICIALES A CAMPO. •ES FUNDAMENTAL TENER LA ENFERMEDAD, CARACTERIZADA EN CUANTO A SU RAZA PARA PODER TRABAJAR CORRECTAMENTE EN LA SELECCIÓN. TRABAJOS FUTUROS PROGRAMADOS RELEVAMIENTO DE LAS RAZAS PREDOMINANTES EN ARGENTINA HOMOLOGAR RAZAS ARGENTINAS CON LOS DIFERENCIALES USADOS EN BRASIL. DEFINIR NOMENCLATURA A UTILIZAR PARA LA VARIEDADES QUE NO HABIENDO SIDO SELECCIONADAS EN AMBIENTE CON MOR POSEEN DISTINTA RELACIÓN p+q