DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ALFA Y BETA AMILASAS COMERCIALES EN LA PRODUCCIÓN DE ETANOL A PARTIR ALMIDÓN DE CEBADA EMPLEANDO Saccharomyces cerevisiae LADY CAROLINA ESPITIA ROCHA PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Bogotá, D.C. Enero 11 del 2009 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ALFA Y BETA AMILASAS COMERCIALES EN LA PRODUCCIÓN DE ETANOL A PARTIR ALMIDÓN DE CEBADA EMPLEANDO Saccharomyces cerevisiae LADY CAROLINA ESPITIA ROCHA TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar al título de MICROBIOLOGA INDUSTRIAL PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Bogotá, D.C. Enero 11 del 2009 NOTA DE ADVERTENCIA: Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946 “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ALFA Y BETA AMILASAS COMERCIALES EN LA PRODUCCIÓN DE ETANOL A PARTIR ALMIDÓN DE CEBADA EMPLEANDO Saccharomyces cerevisiae LADY CAROLINA ESPITIA ROCHA APROBADO _________________________ _________________________ HELBERTH ESPITIA RIVERA IVONNE GUTIERREZ ROJAS Ingeniero Químico Bacterióloga M. Sc Director _______________________ ADRIANA MATIZ Bacterióloga M. Sc Jurado Asesor _______________________ ANDREA AGUIRRE Bacterióloga M. Sc Jurado DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ALFA Y BETA AMILASAS COMERCIALES EN LA PRODUCCIÓN DE ETANOL A PARTIR ALMIDÓN DE CEBADA EMPLEANDO Saccharomyces cerevisiae LADY CAROLINA ESPITIA ROCHA APROBADO _______________________ INGRID SCHULER _______________________ JANETH ARIAS Bióloga, Ph.D. Bacterióloga, M. Sc–M. Ed DECANA ACADEMICA DIRECTORA DE CARRERA Este trabajo lo dedico a Dios por darme la sabiduría y fortaleza en cada paso de este proceso formativo. A mis padres por su amor, esfuerzo y apoyo. También quiero agradecer a mis amigos que me acompañaron durante la carrera por toda su colaboración y amistad que fueron muy importantes para lograr esta meta. Carolina. AGRADECIMIENTOS El presente trabajo es el resultado del interés de la empresa Destilería Premier LTDA., en especial del Ingeniero Helberth Espitia, director técnico de la misma, por su continua búsqueda de alternativas de mejoramiento del proceso a nivel de de rendimientos, calidad y rentabilidad, así como también por proponer, financiar y dirigir este trabajo. Agradezco especialmente la colaboración y asesoría permanente e incondicional de la Doctora Ivonne Gutiérrez de la Pontificia Universidad Javeriana. También al Ingeniero Axel, director del laboratorio de Bromatología de la Secretaría de Salud del Tolima de la ciudad de Ibagué, por su asesoría y colaboración en la realización de los análisis de este proyecto. Por último agradezco a mi madre por su interés compartido por este trabajo, acompañándome siempre con una voz de ánimo y disposición de ayuda para poder lograr esta meta. vii TABLA DE CONTENIDO Pág. 1. INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 18 2. MARCO TEORICO .................................................................................................... 19 2.1 LA CEBADA .............................................................................................................. 19 2.1.1 Taxonomía ................................................................................................................ 19 2.1.2 Características generales ........................................................................................ 19 2.2 CEBADA MALTEADA ............................................................................................... 20 2.3 ALMIDON DE CEBADA ............................................................................................ 21 2.3.1 Amilosa...................................................................................................................... 21 2.3.1.1 Amilopectina ............................................................................................................. 23 2.4 MÉTODOS HIDROLÍTICOS DEL ALMIDÓN ............................................................ 23 2.4.1 Método químico ........................................................................................................ 23 2.4.2 Método enzimático ................................................................................................... 24 2.4.2.1 α-Amilasa .................................................................................................................. 27 2.4.2.2 -amilasa ..................................................................................................................... 28 2.4.2.3 Glucoamilasas .......................................................................................................... 29 2.4.2.4 Pululanasa ................................................................................................................ 29 2.5 PROCESO DE PRODUCCIÓN DE ALCOHOL ......................................................... 30 2.5.1 Sustrato: mosto ........................................................................................................ 30 2.5.2 Microorganismo: Saccharomyces cerevisiae ....................................................... 31 2.5.2.1 Morfología ................................................................................................................. 31 2.5.2.2 Reproducción ........................................................................................................... 32 2.5.2.3 Requerimientos nutricionales ................................................................................. 32 2.5.2.3.1 Fuente de Carbono ................................................................................................ 32 2.5.2.3.2 Fuente de nitrógeno .............................................................................................. 32 2.5.2.3.3 Macro y Micronutrientes ....................................................................................... 33 2.5.2.3.4 Vitaminas ................................................................................................................ 33 2.5.2.4 Requerimientos ambientales ................................................................................. 34 2.5.2.4.1 Temperatura ........................................................................................................... 34 2.5.2.4.2 Oxigeno................................................................................................................... 34 2.5.2.4.3 pH ............................................................................................................................ 34 2.5.2.5 Metabolismo ............................................................................................................. 34 2.5.2.5.1 Azúcares ................................................................................................................. 34 2.5.2.5.2 Nitrógeno ................................................................................................................ 35 viii 2.5.2.5.3 Fósforo.................................................................................................................... 35 2.5.3 FERMENTACIÓN ...................................................................................................... 36 2.6 PRODUCCIÓN DE ALCOHOL EN DESTILERÍA PREMIER LTDA. ........................ 37 3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION .......................................... 39 4. OBJETIVOS ............................................................................................................... 40 4.1 OBJETIVO GENERAL............................................................................................... 40 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...................................................................................... 40 5. MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................... 41 5.1 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN ............................................................................ 41 5.1.1 Población de estudio ............................................................................................... 41 5.1.2 Materiales .................................................................................................................. 41 5.1.3 Enzimas y levadura .................................................................................................. 41 Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L son enzimas comerciales de Genencor Internacional, Inc., las cuales son utilizadas en Destilería Premier LTDA. para el desarrollo de investigaciones de mejoramiento del proceso hidrolítico del almidón de cebada. Multifect® AA 21L es una α-amilasa estable a altas condiciones de calor y a un pH bajo, esta enzima no requiere calcio adicional para operar bajo condiciones de licuefacción industrial. Las condiciones recomendadas de licuefacción primaria son 105-110ºC por 5-7 minutos y secundaria 95ºC por 90-120 minutos (molido húmedo) ó 85-93ºC por 90-120 minutos (molido seco) a un pH entre 5.5-5.8......................................................... 41 5.2 MÉTODOS ................................................................................................................. 42 5.2.1 Proceso hidrolítico del almidón .............................................................................. 42 5.2.1.1 Control de comparación .......................................................................................... 43 5.2.1.2 Control negativo ....................................................................................................... 44 5.2.2 Rendimiento del proceso de hidrólisis .................................................................. 44 5.2.3 Condiciones de fermentación ................................................................................. 44 5.2.3.1 Pruebas preliminares ............................................................................................... 44 5.2.3.2 Preparación de inóculo............................................................................................ 45 5.2.3.3 Fermentación ............................................................................................................ 45 5.3 DETERMINACIÓN DE BIOMASA ............................................................................. 46 5.4 DETERMINACIÒN DE LA CONCENTRACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES Y ALMIDÓN. .................................................................................................................. 46 5.4.1 Determinación del título de la solución de Fehling. ............................................. 46 5.4.2 Valoración de la muestra ......................................................................................... 47 5.4.2.1 Cálculo de azúcares reductores ............................................................................. 48 ix 5.5 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ETANOL .................................. 48 5.5.1 Destilación ................................................................................................................ 48 5.5.1.1 Cálculo de la gravedad específica.......................................................................... 50 5.6 VARIABLES DE ESTUDIO........................................................................................ 50 5.7 RECOLECCIÓN DE LA INFORMACIÓN .................................................................. 51 5.8 ANÁLISIS DE INFORMACIÓN .................................................................................. 51 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................. 52 6.1 CARACTERIZACION DE LAS CEBADAS ............................................................... 52 6.2 PROCESO HIDROLÍTICO DEL ALMIDÓN DE CEBADA SIN MALTEAR .............. 53 6.3 ENSAYO PREVIO DE FERMENTACIÓN ................................................................. 58 6.4 FERMENTACIÓN DE Saccharomyces cerevisiae EN HIDROLIZADO DE CEBADA SIN MALTEAR .......................................................................................... 61 6.4.1 Consumo de sustrato .............................................................................................. 66 6.4.2 Producción de etanol ............................................................................................... 69 6.5 COSTOS DE PRODUCCIÓN .................................................................................... 73 7. CONCLUSIONES ...................................................................................................... 75 8. RECOMENDACIONES .............................................................................................. 77 9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 78 10. ANEXOS .................................................................................................................... 88 x INDICE DE TABLAS Pág Tabla 1. Composición del grano de cebada………………………………..…20 Tabla 2. Acción que ejerce sobre el almidón la fosforilasa, α-glucosidasa, α-amilasa, β-amilasa y enzimas desramificadoras…………………………………….………………....25 Tabla 3. Composición típica del mosto……………………………………….30 Tabla 4. Resumen del diseño experimental…………………………............42 Tabla 5. Resultados de la concentración de almidón realizados a la cebada mateada y sin matear…………………………………………...…………….………..…52 Tabla 6. Datos del rendimiento de hidrolisis obtenidos en el proceso hidrolítico…………………………………………………………..…….56 Tabla 7. Datos de la biomasa máxima alcanzada y el consumo de sustrato bajos las diferentes concentración de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo……………..………………………………………………........68 xi INDICE DE GRÁFICAS Pág Gráfica 1. Concentración de azúcares reductores en función de la dosis de de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo después de la hidrólisis por 8h…………………………………………………………………….……54 Gráfica 2. Relación azúcares reductores producidos y rendimiento de hidrólisis en función de la concentración de enzimas, (C+) control comparación de y (C-)control negativo……………………………………………………………….…57 Gráfica 3. Curva de Crecimiento de Saccharomyces cerevisiae durante el ensayo previo de experimentación…………………………………..59 Gráfica 4. Población de Saccharomyces cerevisiae presente en el medio de fermentación con las diferentes concentraciones de enzimas…………………………………………………………..……….62 Gráfica 5. Relación entre concentración de células/mL máxima y el tiempo de obtención de la biomasa máxima de S. cerevisiae en función de la concentración de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo………………………………………………………...............65 Gráfica 6. Relación entre la concentración de azúcares reductores inicial y final de la fermentación con S. cerevisiae en función de la concentración de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo…………………………………………………………………...67 xii Gráfica 7. Consumo total de sustrato bajos las diferentes concentración de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo…………………………………………………………………..69 Gráfica 8. Producción total de etanol bajos las diferentes concentración de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo…………..……………………………………………………….70 Gráfica 9. Consumo total de sustrato y producción total de etanol bajos las diferentes concentración comparación y de enzimas, (C-) (C+) control de control negativo…………………………………………………….…...............71 Gráfica 10. Relación entre la concentración de etanol producido y productividad producto-sustrato en función en función de la concentración de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo……………………………………………………….…………72 xiii INDICE DE FIGURAS Pág Figura 1. Representación de las dos formas de almidón que se dan en la cebada…………………………………………………………………...22 Figura 2. Degradación del almidón…………………………………..…………..26 Figura 3. Coloración de Gram Saccharomyces cerevisiae..…………..…….31 Figura 4. Reproducción del inóculo…………………………………..…………45 Figura 5. Reacción de Fehling……………………………………..……………..47 Figura 6. Destilación de las muestras………………………………..………….49 Figura 7. Determinación del peso del destilado……………………….…..….50 xiv INDICE DE ANEXOS ANEXO 1. Soluciones de trabajo…………………………………………..…………..88 ANEXO 2. Determinación del porcentaje de almidón…………………..………….89 ANEXO 3. Método para recuento celular en cámara de Newbauer……..……….90 ANEXO 4. Tablas complementarias del proceso hidrolítico………………..…….92 ANEXO 5. Figuras complementarias del proceso hidrolítico………………….....93 ANEXO 6. Tablas complementarias de fermentación……………………………...95 ANEXO 7. Gráficas complementarias de fermentación…………………………101 ANEXO 8. Figuras complementarias del proceso fermentativo………………105 ANEXO 9. Análisis estadístico………………………………………………………106 ANEXO 10. Costos de producción………………………………………………......109 ANEXO 11. Ficha técnica Multifect® AA 21L………………………………….........110 ANEXO 12. Ficha técnica Multifect® AA 23L………………………………………112 ANEXO 13. Ficha técnica Saccharomyces cerevisiae…………………..……….114 xv RESUMEN Destilería Premier LTDA dentro de sus procesos productivos emplea cebada sin maltear como sustrato para la producción de etanol en conjunto con la cebada malteada, con el fin de equilibrar los costos de producción, por lo que en este trabajo se probó la concentración de α y β amilasas que se deben adicionar al grano de cebada sin maltear como alternativa para disminuir el uso de la cebada maltada en el proceso de obtención de etanol. Para lo anterior se realizo ensayos a nivel de laboratorio variando las concentraciones de α y β amilasas, Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L, respectivamente, que se agregaron al medio para la etapa de hidrólisis del almidón de cebada. La concentración de enzimas óptima fue 20 ml/L, lo cual permitió mejorar el rendimiento de hidrolisis con 89,44 % en comparación con las concentraciones que obtienen con la cebada malteada empleada en la planta (41.85%) además de producir mayor cantidad de alcohol. ABSTRAC Premier LTDA distillery within their manufacturing processes used unmalted barley as a substrate for the production of ethanol in conjunction with malted barley, in order to balance the costs of production, so that this work was tested in the concentration of α and β amylases to be added to the grain of unmalted barley as an alternative to reduce the use of barley malt in the process of obtaining ethanol. For the foregoing tests was performed at the laboratory by varying concentrations of α and β amylases, Multifect ® 21L and Multifect® AA 23L AA, respectively, which were added to the medium stage for the hydrolysis of starch from barley. The optimal concentration of enzymes was 20 ml / L, which helped improve the performance of hydrolysis with 89.44% compared with the concentrations obtained with malted barley used in the plant (41.85%) in addition to producing larger quantities of alcohol. 1. INTRODUCCIÓN Destilería Premier LTDA, es una empresa dedicada a la producción, maduración, fabricación, destilación, decantación y comercialización de vinos, champañas, aperitivos y licores en general. Tradicionalmente en el proceso de elaboración de whisky o de cerveza se requiere a la cebada cómo materia prima esencial, utilizada para la obtención de malta mediante el proceso de malteado, que es la sustancia que da origen al extracto fermentable. Hacia el final del proceso de malteado, las diversas enzimas líticas o degradativas se hacen solubles y además son transferidas al endospermo del grano en donde causan la modificación del almidón a un sustrato más sencillo, debido a la acción de alfa y beta amilasas. Los mayores inconvenientes a los que se enfrenta la industria licorera Colombiana es la falta de malterias que comercialicen malta o cebada malteada, lo que hace necesario la importación de la cebada ya transformada, generando de esta forma trámites y costos para las empresas que requieren la cebada en estas condiciones. Destilería Premier importa cebada malteada de Chile y adquiere cebada de producción nacional sin maltear de la región cundiboyacense, con el fin de realizar una mezcla de las cebadas para la generación de productos de calidad a un menor precio. Como consecuencia de esto, surge la necesidad de buscar alternativas eficaces para reducir el uso de la cebada malteada. Por tal motivo, la empresa pretende utilizar cebada nacional como única materia prima esencial del proceso, empleando enzimas amilolíticas comerciales Multifect® AA 21L (α -amilasa) y Multifect® AA 23L (β -amilasa), para sustituir el paso de sacarificación y licuefacción enzimática del almidón llevado a cabo por las enzimas de la cebada malteada, por el empleo de enzimas comerciales de microorganismos amilolíticos para la degradación total o parcial del almidón contenido en los granos de esta cebada, con el propósito de disminuir tiempos de producción y mejorar la rentabilidad del proceso. Para lograr este objetivo se propone determinar la concentración óptima de las enzimas con el fin de obtener la mayor producción de etanol, estableciendo de esta forma una alternativa eficaz de producción para la empresa. 18 2. MARCO TEORICO La fermentación alcohólica a partir de cereales ha sido investigada por varios años, considerando a la cebada, en términos de producción, el cereal más importante en el mundo, constituido por un 63-65% de almidón (Varman, 1997). Las empresas de alimentos y bebidas muestran un interés cada día por este almidón, que es utilizado en la fermentación de las azúcares, utilizando levaduras que contienen enzimas catalizadoras que transforman los azúcares en alcohol y dióxido de carbono (Routh et al, 1984). Sin embargo, las levaduras no tienen la capacidad de acceder a esta fuente de carbono directamente, por lo que durante el malteado de la cebada, el almidón de la cebada se degrada fundamentalmente a una mezcla de poliglucosa, obteniendo el mosto de fermentación (Varman, 1997). Actualmente en el mercado se encuentra una variedad de enzimas comerciales producidas por microorganismos y que son usadas en la industria de alimentos y bebidas. En la industria de bebidas las enzimas de mayor importancia son las amilasas ya que se ven implicadas desde el proceso de elaboración del mosto. El uso de α-amilasas, βamilasas y glucoamilasas producidas por diferentes microorganismos ha beneficiado la industrial por proveer una alternativa y un método más eficiente para la producción de dextrinas, maltosa y glucosa (Beltran y Maldonado, 2002). 2.1 LA CEBADA 2.1.1 Taxonomía Botánicamente, la cebada pertenece a la familia de las Gramíneas, plantas herbáceas con flores, que en los antiguos sistemas naturales de clasificación se situaron en la sub-clase Glumaceae ó Glumiflorae. Las cebadas se incluyen en el género Hordeum, del que existen varias especies, siendo H. vurgare y H. distichon las especies más importantes en la industria cervecera (Hornsey, 2003). 2.1.2 Características generales El uso predominante de la cebada para la elaboración de malta se basa en una serie de factores tales como ser tradicionalmente el cereal de elección; crece en una variedad de ambientes, con una germinación rápida y uniforme; el 60% del peso 19 seco total del grano es almidón; contiene proteínas, generalmente en cantidades necesarias para proporcionar los aminoácidos necesarios para el crecimiento de la levadura; y posee una dotación enzimática satisfactoria (Hough, 1990). En el proceso de elaboración de cerveza o de whisky se emplea como materia prima esencial cebada que se caracteriza por tener carbohidratos fermentables, proteínas, minerales y una alta actividad enzimática (Ver Tabla 1), sin embargo estas características también favorecen el desarrollo de microorganismos capaces de producir diferentes metabolitos y enzimas que pueden modificar las propiedades finales del mosto y por consiguiente del desarrollo de elaboración de alcoholes de cebada (Beltrán, y Maldonado, 2002). Tabla 1. Composición del grano de cebada por 100 g de sustancia. Componentes Porcentajes (%) Proteínas 10 Materia grasa 1.8 Hidratos de carbono 66.5 Celulosa 5.2 Materias minerales 2.6 Agua 14 Fuente: http://fenalce.net/pagina.php?p_a=50 Aunque son varios los granos de cereal que pueden ser satisfactoriamente malteados, los de cebada son los que generalmente presentan menos problemas técnicos. Sus cáscaras ayudan a proteger el grano del malteado, además son útiles como coadyuvantes de filtración en etapas posteriores (Hoseney, 1991). 2.2 CEBADA MALTEADA Se entiende exclusivamente por cebada malteada o malta al grano de cebada sometido a germinación parcial y posterior deshidratación y/o tostado en condiciones tecnológicas adecuadas. El malteado es la germinación controlada de 20 la semilla, seguida por su desecación también controlada, durante éste se considera a la semilla de cebada como un sistema complejo fisiológico donde los principales procesos son la síntesis de enzimas amilolíticas y proteolíticas y la degradación de las estructuras del endospermo. El objetivo del mateado es producir alta actividad enzimática y el sabor característico, con una mínima pérdida de peso seco. El grano seleccionado para maltear debe estar sano, tener alto poder germinativo y estar libre de pajas, granos rotos y hongos (Hoseney, 1991). El cereal que se maltea con más frecuencia es la cebada, aunque también se emplean cantidades apreciables de trigo y centeno, y en algunas partes de África se maltea sorgo. En teoría al menos, se podría utilizar cualquier cereal. No obstante, el tipo y cantidad de las enzimas producidas, varían de uno a otro cereal (Hoseney, 1991). 2.3 ALMIDON DE CEBADA El almidón es un polímero semicristalino de glucosa de gran abundancia en la naturaleza, por lo que se considera una buena fuente de obtención de este azúcar para una fermentación económica y rentable (Navarro y Sossa, 2003). La cantidad de almidón contenido en el grano de cereal varía, pero generalmente oscila entre el 60 y 75% del peso del grano. El almidón presente en los granos es el más importante de los carbohidratos para fines industriales resultando preciso degradarlo enzimáticamente con una gelatinización previa por acción de calor o sometetiendolo a un intenso trabajo mecánico. El almidón de cebada gelatiniza a 58-90ºC, pero durante la germinación la temperatura alcanzada es de sólo 15ºC, por lo tanto las enzimas que degradan el almidón, las amilasas, operan en el malteado sin gelatinización previa (Hoseney, 1991). El almidón consta de dos fracciones: amilosa (20 %(p/p)) que es soluble en agua y amilopectina (80%(p/p)) que es insoluble en agua con un alto peso molecular (Ver Figura 1) (Navarro y Sossa, 2003). 2.3.1 Amilosa Es un polímero de glucosa que contiene de 1.000 a 4.000 unidades de éste monómero, tiene por tanto un peso molecular de 200.000-800.000 daltons, valor que varía no sólo según la especie de planta, sino también dentro de la misma especie y 21 d depende de el estado de maduración n (Hoseney, 1991). Cad da unidad de e glucosa esstá u unida a la próxima por un enlace e glucosídico α-1,4 (Ve er Figura 1)). Este enla ace d determina que el grupo reductor de e la glucosa,, situado en la posición uno, pierda la f funcionalida ad, una mo olécula de amilosa a no tiene máss poder red ductor que el c correspondie ente a una a sola molé écula de glu ucosa, porq que sólo tie ene un grupo r reductor funcional, situa ado en un exxtremo (Houg gh, 1990). ntación de las dos forrmas de alm midón que se dan en la Figura 1. Represen milosa y (b) amilopectina a a ramificada a. Cada círcu ulo cebada (a) cadena lineal de am nta una unidad de gluco osa y posible es puntos de e ataque para las amilassas represen α y β; NR RE indica un n extremo no o reductor. Fuente: Hough, 199 90 G Generalmen nte, es un po olímero linea al aunque se cree que solamente s p para una parte d la amilos de sa, siendo liigeramente ramificado el e resto. Cuando se lixivia el almidón p para separa ar la amilosa a calentando ligeramen nte por encima de la te emperatura de g gelificación del almidó ón, la amilosa solubilizada es esencialmen e nte lineal. La n naturaleza lineal l y de gran longitud, confiere e a la amilo osa algunass propiedades ú únicas, por ejemplo: su u capacidad d para forma ar complejoss con yodoss, alcoholess o á ácidos orgá ánicos. Estoss complejoss se llaman clatratos o compuestoss de inclusión h helicoidal (H Hoseney, 19 991). A tem mperatura am mbiente, la cadena de moléculas de 22 glucosa adopta una conformación en espiral cuyas hélices permiten albergar en su interior una molécula de yodo. Cuando se trata de la amilosa con yodo, disuelto en una disolución de yoduro potásico, el yodo se ubica en las hélices, formando un complejo amilosa-yodo que tiene un color azul negruzco. Si el complejo se calienta se desintegra transitoriamente la espiral de amilosa y el yodo deja de teñirla (Hoseney, 1991). 2.3.1.1 Amilopectina Es un polisacárido cuyas cadenas principales son restos de glucosa unidos en enlace α-1,4, como en la amilosa, y que presentan esporádicamente ramificaciones α-1,6, localizadas cada 15-25 unidades lineales de glucosa (Ver Figura 1). Su peso molecular es muy alto ya que algunas fracciones llegan a alcanzar hasta 200 millones de daltons. La amilopectina constituye alrededor del 75% de los almidones más comunes (Bailey y Bailey, 1998). La consecuencia de los enlaces α-1,6 es la formación de una molécula ramificada que al igual que la amilosa, tiene un sólo grupo funcional. (Hough, 1990). 2.4 MÉTODOS HIDROLÍTICOS DEL ALMIDÓN El principal inconveniente para la producción de etanol a partir de almidón, radica en que la levadura no produce enzimas amilasas y no es capaz de fermentar el almidón, por consiguiente es necesario realizar una sacarificación previa. La sacarificación se puede realizar por dos métodos: uno químico y uno de conversión enzimática (Chica, 1996). 2.4.1 Método químico El almidón puede ser hidrolizado por ácidos como el ácido clorhídrico, (hidrólisis ácida), llegando a una conversión parcial del almidón a D-glucosa. Este método es utilizado para preparar jarabes de glucosa a partir de suspensiones que contienen 20%(p/p) de almidón a pH 2 y a una temperatura de 140ºC (Glazer y Nikaido, 1998). Tras el tratamiento, se neutraliza y se recupera el almidón no hidrolizado por filtración (Hoseney, 1991). 23 Durante la reacción, el ácido penetra libremente por las partes amorfas del grano de almidón, e hidroliza los enlaces glucosídicos. El ácido no puede penetrar por las áreas cristalinas, quizás a causa de la doble hélice, permaneciendo por ello intactas. El efecto principal del ácido es reducir el peso molecular de las moléculas de almidón, dejando intacta la estructura cristalina del grano (Hoseney, 1991). Esta sacarificación química presenta serios inconvenientes tales como: un bajo rendimiento en la producción de etanol, los residuos líquidos que quedan de la hidrólisis no son utilizados como alimento para el ganado y por último requiere un mantenimiento costoso a causa del mayor deterioro de las instalaciones por corrosión. Por lo anterior, los métodos enzimáticos se han convertido en una buena alternativa (Chica, 1996). 2.4.2 Método enzimático La hidrolisis enzimática ha desplazado a la hidrólisis ácida en los últimos 30 años, debido a que se dispone de nuevas enzimas. Hoy en día la mayor parte de la hidrólisis de almidón se realiza usando enzimas, ya que esta técnica presenta ventajas como: control de la formación de productos no deseables y mayor flexibilidad del producto (Chica, 1996). Durante el malteado, el almidón de la cebada se degrada fundamentalmente a una mezcla de moléculas de poliglucosa, algo menos complejas que las originales. Para los procesos respiratorios y biosintéticos embrionarios, sólo se libera una cantidad limitada de azúcares simples. La amilopectina es más fácilmente degradada que la amilosa. Las enzimas capaces de degradar el almidón no gelatinizado de la cebada son las siguientes: fosforilasa, α-glucosidasa, α-amilasa, β-amilasa y enzimas desramificadoras (Ver Tabla 2). Durante la deshidratación de la malta, las actividades de estas enzimas se reducen de un modo drástico a excepción de la αamilasa y β-amilasa (Hough, 1990). Hay tres tipos de descomposición enzimática de los glucanos: fosforólisis, hidrólisis y transglicosilación. La fosforólisis por la α-1,4-glucanfosforilasa sólo ocurre intracelularmente. La transglicosilación es la formación de ciclodextrinas con 6-8 unidades de glucosa a partir del almidón, por acción de Bacillus macerans y otros. 24 El ataque extracelular del almidón es debido a la acción hidrolítica de las amilasas (Ver Figura 2) (Schlegel, 1993). Tabla 2. Acción que ejerce sobre el almidón de la fosforilasa, α-glucosidasa, αamilasa, β-amilasa y enzimas desramificadoras. Enzima Microorganismos productores Acción α-glucosidasa Necesita agua para la hidrólisis, ataca enlaces α-1,4 ó α-1,6 con menos frecuencia. Exoenzima que acorta las cadenas de almidón en una unidad, partir del extremo no reductor y libera glucosa. Aspergillus niger, Rhizopus niveus, Aspergillus oryzae Necesita agua para la hidrólisis, ataca enlaces α-1,4. Bacillus megaterium, Bacillus cereus, Acorta las cadenas de almidón en dos Streptomyces sp. unidades, partir del extremo no reductor, β-amilasa las que libera como maltosa Necesita agua para la hidrólisis, ataca enlaces α-1,4. α-amilasa Endoenzima que rompe las cadenas al azar generando una mezcla de maltosa y oligosacáridos Bacillus subtillis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus polymixa, Bacillus licheniformis Clostridium Necesita agua para la hidrólisis, ataca thermodyrosulfurico, Enzimas enlaces α-1,4. Desramificación de la Leuconostoc, desramificadoras amilopeptina produciendo una mezcla Enterobacter (Pululanasa) de dextrinas y unos pocos azúcares. aerogenes, Bacillus polymixa Fuente: González, 2002. Normalmente la hidrólisis enzimática de los granos de almidón presenta bajos rendimientos de conversión a azúcares fermentables, a pesar que las macromoléculas del almidón pueden ser hidrolizadas en estado granular, sin embargo, los ensayos de hidrólisis de los gránulos naturales a menudo dan como resultado un lento y deficiente producto de hidrólisis (Oates, 1997). Normalmente 25 estos ensayos de hidrólisis analizan los azúcares reductores liberados tras un proceso hidrolítico empleando el método de Fehling. Este método se basa en las propiedades reductoras de los azúcares presentes en la muestra sobre una solución alcalina de cobre. Los azúcares totales son la suma de los azúcares reductores y no reductores. Los azúcares reductores son los monosacáridos como glucosa, fructosa, galactosa, etc. y disacáridos como lactosa y maltosa, los cuales reaccionan con oxidantes suaves, como los reactivos de Fehling, Tollens y Benedict (NTC 5146, 2008). El reactivo de Fehling tiene una coloración azul y al reaccionar con los azúcares reductores, forma un precipitado rojizo de óxido cuproso (Cu2O) y el ácido carboxílico del respectivo aldehído (NTC 5146, 2008). En general, la acción de α y β-amilasas en gránulos de almidón natural no es muy eficaz, porque son muy resistentes a la digestión amilolítica y se necesita un largo período de hidrólisis para poder degradar el almidón (Sarikaya et al., 2000). Con los nuevos avances tecnológicos en los últimos años, se han descubierto una nueva generación de enzimas como la α-amilasa de Aspergillus kawachi y la glucoamilasa de Aspergillus niger. Estas enzimas trabajan sinérgicamente para hidrolizar almidón granular que directamente puede hidrolizar el almidón en un solo paso, a una moderada temperatura muy por debajo de la temperatura de gelatinización (Shariffa et al., 2008). Figura 2. Degradación del almidón. Fuente: Schlegel, 1993. 26 Estas enzimas tienen la ventaja de exo-actividad como la glucoamilasa, que es capaz de perforar fuerte y profundamente orificios, así como la endo-activitividad de la α-amilasa, que permite la ampliación de los orificios (Shariffa et al., 2008). Esta combinación mejora la liberación continua de glucosa fermentable a partir de los granos de almidones. Franco et al., (1988) reportaron, que se puede obtener una mayor degradación hidrolizando el almidón con α-amilasa junto con la glucoamilasa. La modificación se puede realizar con el fin de aumentar la eficiencia de hidrólisis del almidón natural. Oates (1997) sugirió que se puede lograr una mejor hidrólisis de almidón nativo mediante el aumento de la temperatura de incubación aproximadamente a 60º C. Si el grado de conversión de almidón nativo se puede incrementar aún más, sería muy útil en el proceso industrial de fermentación de azúcares y de bioetanol. 2.4.2.1 α-Amilasa Cataliza la hidrólisis al azar los enlaces α-1,4 glucosídicos de la región central de la cadena de amilosa y amilopeptina, exceptuando las moléculas cercanas a la ramificación, obteniendo como resultando maltosa y oligosacáridos de varios tamaños (Cruger y Cruger, 1993). Esta enzima tiene un peso molecular de 50.000 Daltons, es estable a pH de 5.5-8.0 con una actividad óptima de 5.9. Las α-amilasas son enzimas dependientes de calcio, aunque el catión no esté integrado en el centro activo de la enzima, se encuentra fuertemente unido a la enzima y sólo pueden ser removidos a pH bajos por el uso de agentes quelantes. La completa remoción del calcio conlleva a una pérdida total de actividad (Pedroza, 1999). Se cree que el Ca+2 estabiliza la conformación global de la enzima, encontrándose hasta 10 iones por molécula de enzimas (GodFey y Reinchelt, 1993). La importancia radica en que mantiene la molécula de la enzima en la configuración óptima para generar una máxima actividad y estabilidad. A menudo se nombra la α amilasa como enzima licuante, debida a su rápida acción para disminuir la viscosidad de las soluciones de almidón (Pedroza, 1999). 27 La actividad de la enzima se determina cualitativamente mediante la disminución de la capacidad de la solución de almidón para formar el color azul característicos con el yodo o midiendo la disminución de la viscosidad de la suspensión de almidón (GodFey y Reinchelt, 1993). Las principales aplicaciones de las enzimas extracelulares que degradan el almidón consisten en la conversión del almidón de jarabes que contienen glucosa, maltosa y oligosacáridos, en la producción de azúcares fermentables en cervecería y en la obtención de bebidas alcohólicas y en la modificación de la harina de panadería. Entre las enzimas comercialmente utilizadas se destacan las alfa amilasa de Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens y Aspergillus oryzae (Owen, 1989). Entre los microorganismos que producen α amilasa, se encuentran tanto bacterias como hongos tales como Bacillus subtilis, B. cereus, B. amyloliquefaciens, Pseudomonas, Proteus, y Serratia; algunos géneros de hongos como Aspergillus, Penicillium, Cephalosporium, y Mucor (Crueger y Crueger, 1993) Se han obtenido enzimas termoestables a partir de Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis, permitiendo llevar a cabo la sacarificación a altas temperaturas, acelerando el proceso y minimizando la contaminación microbiana (Chica, 1996). 2.4.2.2 β-amilasa La β -amilasa ó α-1,4 glucan-maltohidrolasas es una exoenzima que ataca los enlaces α 1,4 glucosídicos en la parte externa de la cadena de almidón, la β amilasa separa unidades de maltosa a partir de los extremos no reductores de esta por hidrólisis alterna de enlaces glucosídicos (Pedroza, 1999). Las β amilasas atacan la amilosa solo desde un extremo a la vez, y, a causa de ello, son mucho menos efectivas que las α amilasas (Baker, 1994). Debido a que está enzima esta imposibilitada para hidrolizar los puntos ramificados α-1,6 en la molécula de almidón, los productos finales de la acción sobre el sustrato son maltosas y dextrinas, formándose pocas cantidades de maltotriosa y glucosa (Mariño, 1989). 28 Las β-amilasas contienen un grupo sulfidrílo esencial para la actividad enzimática, que se lleva acabo de forma óptima en un rango de pH entre 4 y 5. La actividad de la enzima se analiza mediante métodos colorimétricos que miden la cantidad de azúcares reductores, liberados a partir del almidón. Estas enzimas están presentes en gran número de bacterias Gram positivas formadoras de esporas (González, 2002). Algunos microorganismos productores son: Bacillus polymyxa, B. cereus, Streptomyces sp. y Rhizopus japonicus. Aunque el rendimiento en las cepas silvestres es generalmente bajo, se han descubierto mutantes que producen 200 veces más enzimas que la cepa silvestre (Crueger y Crueger, 1993). 2.4.2.3 Glucoamilasas Las glucoamilasas o α-1,4-glucan-glucohidrolasas son enzimas carbohidrolasas no especificas, de acción externa, rompen enlaces glucosídicos α-1,3, α-1,4 y α-1,6, generando glucosa a partir de los enlaces terminales no reductores de la cadena de almidón, por tanto son enzimas sacarificantes. Sin embargo, la glucoamilasa es incapaz de hidrolizar el almidón por completo a glucosa, ya que la ruptura requiere la participación de una enzima de acción interna. La glucoamilasa puede ser separada en dos fracciones glucoamilasa I y glucoamilasa II. La glucoamilasa I posee alta actividad desramificante la cual se acelera en presencia de α-amilasas, por otro lado la glucoamilasa II posee una baja actividad desramificante (Chica, 1996). Las glucoamilasas frecuentemente denominadas amiloglucosidasas, son producidas por hongos como Aspergillus niger, además siempre contienen cierta actividad transglucosidasa, la cual cataliza la reacción reversa, que conduce a la polimerización de la glucosa a maltosa (Byong, 2000). 2.4.2.4 Pululanasa La pululanasa es una enzima desramificante que actúa sobre los enlaces α-1,6 de la amilopeptina liberando como único producto la maltosa (Byong, 2000). Son 29 utilizadas para mejorar la sacarificación, elevando el rendimiento de la liberación de glucosa (Maarel et al., 2002). 2.5 PROCESO DE PRODUCCIÓN DE ALCOHOL 2.5.1 Sustrato: mosto Es la solución en agua potable de carbohidratos, proteínas, sales minerales y demás compuestos resultantes de la degradación enzimática de la malta (Ver Tabla 3), con o sin adjuntos, como arroz, sorgo, trigo, etc., realizada mediante procesos tecnológicos adecuados. Tabla 3. Composición típica del mosto. Componente Cantidad (gl-1) Fructosa 2,1 Glucosa 9,1 Sacarosa 2,3 Maltosa 52,4 Maltotriosa 12,8 Carbohidratos fermentecibles no 23,9 Nitrógeno total 0,8 Aminoácidos (nitrógeno) totales 0,30 Aminoácidos totales 1,65 Componentes fenólicos totales 0,25 Isoácidos α 0,035 Iones calcio 0,065 Fuente: Hough, 1990. 30 2.5.2 Microorganismo: Saccharomyces cerevisiae En la industria se utiliza la levadura Saccharomyces cerevisiae, al ser considerada como la mayor productor de etanol a nivel mundial. Este hecho se evidencia en un sin número de atributos que para tal fin presenta esta levadura, como por ejemplo su capacidad de respiración tanto aerobia como anaeróbica, y la utilización de sustratos como glucosa, fructuosa, galactosa, maltosa, entre otros (Tuite y Oliver, 1991). Saccharomyces cerevisiae es uno de los microorganismos más atractivos para trabajar, se ha comprobado a través de la historia que no es patógeno, ya que se ha utilizado en las industrias alimentarias y ha sido clasificado como un organismos GRAS (Generally Recognized As Save) (Ostergaard et al., 2000). Así mismo, posee un gran potencial para la producción de etanol fermentando la glucosa, soportando altas concentraciones de la misma, logrando altos niveles de producción y rendimiento (Chandrakant y Bisaria, 2000). 2.5.2.1 Morfología Es un hongo unicelular levaduriforme que presenta células alargadas, globosas, elipsoidales con gemaciones o blastoconidios multilaterales de 3-10 x 4,5-1 μm que al microscopio se ven refringentes (Ver imagen 3). Presenta ascos con hasta cuatro ascosporas esféricas o elipsoides y de pared lisa en su interior. Las colonias en agar Sabouraud son cremosas, blandas, de color crema o blanco, con apariencia húmeda y brillante y con bordes irregulares (White, 1995). Figura 3. Coloración de Gram Saccharomyces cerevisiae Fuente: www.ual.es/.../myco-ual/galeria04/figura8.htm. 31 2.5.2.2 Reproducción Su reproducción puede ser asexual por gemación. Cuando las condiciones son adversas la mayor parte de las levaduras pueden reproducirse sexualmente generando ascosporas (Mesas y Alegre, 1999). Durante la gemación, la célula hija inicia crecimiento formando una yema en la célula madre, posteriormente ocurre la división nuclear, la síntesis de la pared y finalmente la separación de las dos células (White, 1995). 2.5.2.3 Requerimientos nutricionales 2.5.2.3.1 Fuente de Carbono Esta levadura tiene la habilidad para fermentar la glucosa, fructosa, maltosa, maltotriosa presentes en los medios regulares. La sacarosa es hidrolizada primeramente por la invertasa localizada en el espacio periplásmico extracelular. Los azúcares son transportados a través de la membrana celular por transporte activo o pasivo, mediado por permeasas producidas constitutivamente o indecibles. La maltosa y la maltotriosa son hidrolizadas intracelularmente por la α-glucosidasa (Kretzschmar, 1990). Las dextrinas, que comprenden la maltotriosa y productos de degradación mayores, no son metabolizados. Algunas cantidades mínimas de azúcares pentósicos tampoco son fermentados (Hornsey, 2003). 2.5.2.3.2 Fuente de nitrógeno Las levaduras no pueden asimilar el nitrógeno elemental ni los iones nitrato. Algunas cepas pueden utilizar los iones de amonio, pero la mayor parte de nitrógeno requerido para la síntesis de constituyentes celulares esenciales, procede de los aminoácidos y de los di- y tri-péptidos del mosto. Estos han sido originados proporcionalmente por la propia malta. Como en el caso de la utilización de carbohidratos por levaduras, los aminoácidos son captados y utilizados consecuentemente, de acuerdo con la presencia de enzimas adecuadas de transferencia en la membrana. Un mosto de malta total, contiene 19 aminoácidos (Hornsey, 2003). La propia célula produce aminoácidos por transaminación y/o 32 síntesis a partir de un conjunto de diferentes ácidos y cetácidos. En algunas cepas de levadura, determinados aminoácidos son siempre sintetizados dentro de la células, incluso aunque se encuentren presentes en cantidad abundante en el mosto, como en el caso de la arginina, histidina y lisina (Hornsey, 2003). 2.5.2.3.3 Macro y Micronutrientes El más importante de los macronutrientes es el fosforo el cual está involucrado en la síntesis de proteínas y en los fosfolípidos que permiten la resistencia a altas concentraciones de etanol; además las levaduras sintetizan polifosfatos como reservas de energía. El fósforo puede ser tomado en forma monobásica (H2PO4) y puede ser añadido al medio como ácido o como sal de amonio, sodio o potasio y se debe encontrar de un 1 a 2% en el medio (Kretzschmar, 1990). El sulfuro es requerido en la levadura para la síntesis de metionina y cisteína, dos aminoácidos que contienen azufre. Se necesita más o menos de 0.3 a 0.5% del medio. Los microelementos cobalto, boro, cadmio, yodo, molibdeno y níquel se requieren en concentraciones de 0.1 a 100µM (Kretzschmar, 1990). 2.5.2.3.4 Vitaminas El mosto proporciona una rica fuente de vitaminas y aunque las levaduras difieren mucho en sus necesidades de vitaminas para el crecimiento, normalmente existe un aporte adecuado en variedad como de cantidad en la cuba de maceración. El mosto debe contener biotina, tiamina (B1), ácido nicotínico, riboflavina, pantotenato cálcico, inositol, piridoxina, piridoxal y piridoxamina. Con la excepción del inositol, que interviene o participa en la síntesis de la membrana (fosfolípidos), es decir desempeña un papel estructural. Todas las vitaminas tienen función catalítica como parte de alguna coenzima en el metabolismo (no-funcional). Los factores de crecimiento que comúnmente requiere la levadura son: biotina, ácido pantoténico e inositol importantes para la resistencia del microorganismo a altas concentraciones de etanol (Jaccques et al., 1999). 33 2.5.2.4 Requerimientos ambientales 2.5.2.4.1 Temperatura Las temperaturas óptimas de la fermentación, respiración y crecimiento celular de las levaduras son claramente diferentes. La velocidad de fermentación aumenta generalmente con la temperatura entre los 15 y los 35°C, así como también los niveles de glicerol, acetona, bueteno-2-3-diol, acetaldehído, piruvato y 2cetoglutarato (Ward, 1991). 2.5.2.4.2 Oxigeno Los requerimientos de oxigeno para la reproducción y para la fermentación son diferentes, mientras para la reproducción se necesitan grandes cantidades de oxigeno para la producción de células hijas y para la síntesis de ácidos grasos que serán los responsables de la resistencia a grandes concentraciones de etanol; la fermentación se realiza en condiciones anaerobias pues la producción de etanol necesita de ausencia de oxigeno (Ward, 1991). 2.5.2.4.3 pH Los valores comprendidos entre 3 y 6 son la mayoría de las veces favorables al crecimiento y actividad fermentativa; esta última es mayor cuanto mayor sea el pH (Santander, 2006). 2.5.2.5 Metabolismo 2.5.2.5.1 Azúcares Las levaduras son consideradas microorganismos anaerobios facultativos, ellos son capaces de crecer en presencia o ausencia de oxigeno, cuando el oxigeno es suficiente y el sustrato está lo suficientemente diluido, ellas consumen los azúcares para el crecimiento de las células y para su reproducción; en cambio cuando el oxigeno es reducido y los niveles de glucosa exceden 0.1% p/v, ocurre el proceso de fermentación (Santander, 2006). S. cerevisie usa la vía glicolítica o EmbdenMeyerof-Parnas para metabolizar las moléculas de azúcar y obtener la energía necesaria para su supervivencia (Jaccques et al., 1999). Cuando la levadura 34 encuentra las condiciones necesarias para la producción de etanol, el piruvato es descarboxilado y convertido en Acetaldehído, el cual tras la adición de hidrógeno se transforma en etanol (Stryer, 1995). 2.5.2.5.2 Nitrógeno La levadura prefiere los compuestos nitrogenados fácilmente difusibles a través de la membrana celular, sobre todo los aminoácidos, sus amidas, la urea y las bases hexónicas (Santander, 2006). La degradación no transcurre de un modo regular, sino que guarda estrecha relación con la acidez de la fermentación. La curva de acidez empieza de manera alcalina ya que se hace necesario agregar un exceso de nitrógeno al medio en forma de sales amoniacales que reaccionan con las sales alcalinas y amoniacales orgánicas presentes en el medio. Las sales de amonio entran a la célula y allí se disocian, liberando ácido sulfúrico, el cual fatalmente lesiona la pared celular, aunque las otras sales ayudan a neutralizar la acción de éste ácido. De esta manera el medio pasa de ser alcalino a ser ácido, paso que se acelera cuando empieza la degradación de los aminoácidos orgánicos, ya durante la fermentación la levadura toma el nitrógeno de estos compuestos de manera que los aminoácidos van perdiendo su carácter anfótero y convirtiéndose en ácidos. Nuevamente la acidez disminuye cuando los ácidos orgánicos van siendo metabolizados y la levadura ha logrado asimilar la mayor parte del azúcar y del nitrógeno. No obstante queda un resto de nitrógeno amínico no disociado (Kretzchmar, 1990). 2.5.2.5.3 Fósforo La levadura introduce este elemento a la célula en su forma inorgánica y adentro obtiene ácido fosfórico, cuyo metabolismo varía a lo largo del proceso de fermentación. Poco después de iniciada la fermentación comienza la esterificación del azúcar con el ácido fosfórico, el cual sale del interior de la célula de la levadura para unirse con el azúcar y hacerlo asimilable. Durante todo el proceso el ácido fosfórico permanece entrando y saliendo, presentando un ritmo alternativo adaptado a la germinación de la levadura y al crecimiento de las células hijas (Kretzchmar, 1990). 35 2.5.3 FERMENTACIÓN Una fermentación es una reacción de oxidación-reducción interna equilibrada en la que algunos átomos se reducen mientras otros se oxidan, y la energía se produce por fosforilación a nivel de sustrato. Una ruta bioquímica muy usada para la fermentación de la glucosa es la glucólisis, también denominada vía de EmbdenMeyerhof (Madigan et al., 2003). La fermentación anaeróbica constituye el tipo más sencillo y primitivo de mecanismo biológico que permite la obtención de energía de las moléculas nutritivas, mediante reacciones de oxidación y reducción. En este proceso, el etanol es una molécula relativamente reducida que se produce junto con el CO2 que es una molécula relativamente oxidada (Reinier, 2005). La fermentación alcohólica es el proceso por el que los azúcares contenidos en el mosto se convierten en alcohol etílico. Para llevar a cabo este proceso es necesaria la presencia de levaduras, la cuales extraen energía química de las moléculas de glucosa y de otros combustibles en ausencia de oxigeno molecular para producir etanol. La fermentación alcohólica transcurre por la misma ruta enzimática de la glucólisis, pero necesita dos etapas adicionales. En la primera parte, el átomo de carbono del piruvato es atacado por el pirofosfato de tiamina y experimenta una descarboxilación; la coenzima queda en la forma de 2- hidroxietil, derivado que puede considerarse una forma del acetaldehído activado o ligado a la coenzima. En la etapa final al acetaldehído se reduce a etanol y el potencial de reducción es proporcionado por el NADH+, en una reacción catalizada por la alcoholdeshidrogenasa. Las reacciones de la fermentación alcohólica se consideran completas cuando hay formación de ATP a partir de fosfatos. En realidad, este proceso no puede ocurrir sin la simultánea fosforilación oxidativa del ADP (Reinier, 2005). Durante la etapa de crecimiento de los cultivos, los mismos son sometidos a una oxigenación fuerte, mediante la aireación del medio, lo que permite la utilización de la glucosa por oxidación completa. Este proceso genera una gran cantidad de energía que en parte es fijada mediante el sistema ADP-ATP y posibilita el desarrollo de reacciones de síntesis celular, que consumen gran cantidad de energía. Una vez que el cultivo en el fermentador ha alcanzado el número de células 36 necesario para la degradación óptima de la materia prima se elimina la aireación y las condiciones anaeróbicas se establecen en el medio por el consumo de oxígeno remanente y el desprendimiento de CO2. En las condiciones anaerobias, el aporte de energía a las células es muy pequeño comparado con el de la respiración y con las necesidades energéticas de la síntesis lo que implica que en estas condiciones no se produzca el crecimiento celular. La experiencia indica, no obstante, que aún en condiciones anaerobias existe una mínima reproducción celular a expensas y acorde con el pequeño aporte energético recibido por la célula. Este fenómeno es conocido como "Efecto Pasteur" (Reinier, 2005). 2.6 PRODUCCIÓN DE ALCOHOL EN DESTILERÍA PREMIER LTDA. La producción se inicia con la molienda donde se trituran los granos de cebada de tal forma que el contenido de almidones quede pulverizado, para el proceso de inversión y conversión a azúcar. En el reactor se carga e hidrata la cebada molida con agua potable, en este paso se utilizan mezclas de cebada nacional con cebada malteada o importada. El sistema de agitación y calentamiento con vapor del reactor permite llevar a cabo la hidrólisis de los almidones, y posterior transformación en azúcares. Cuándo todos los almidones han sido transformados en azúcares, se procede a separar el mosto de cebada del resto de los afrechos de la misma, de tal forma que el mosto a fermentar esté libre de cascarilla, obteniéndose así un mosto disponible para realizar el proceso de fermentación. El mosto proveniente de la hidrólisis de la cebada es pasado a un esterilizador con un volumen de 1.500 litros donde se mantiene por 40 minutos a temperatura de esterilización, seguido de un enfriamiento hasta 28 °C, garantizando de esta forma la inocuidad del mismo durante la siembra de la levadura. La cepa empleada es Saccharomyces cerevisiae, durante la pre-fermentación las levaduras se reproducen en el mosto, manteniéndose las condiciones óptimas para la propagación de la misma, para esto macro y micronutrientes, como el fosfato de amonio, vitamina B1 y tiamina, son adicionados paulatinamente. 37 Una vez se obtienen los grados Brix y la población de levadura requerida, se pasa alternadamente a la batería de cubas madres, dónde se realiza el pie de cuba y se controla temperatura, población y calidad de la fermentación. Una vez iniciada la fermentación en la cuba madre se procede al cargue de esta al tanque de fermentación, alimentándose con un mosto de 15 a 18º Brix hasta llenar el tanque para dar paso a la fermentación por espacio de 8 a 10 días. Se dice que la fermentación llega a su fin cuando los azúcares de la cebada son consumidos y convertidos a alcohol, la temperatura disminuye y cesa la producción de gas carbónico y de esta forma la biomasa se deposita en el fondo del recipiente. En esta etapa se realizan trasiegos para la separación de los sólidos en el líquido, realizándose de tanque a tanque con bombas y mallas. Finalizada la fermentación y trasiegos se determina la calidad producida del producto durante el proceso fermentativo realizando análisis para determinar los parámetros fisicoquímicos. Una vez el mosto ha fermentado se pasa al destilador de columna rellena, donde se realiza la extracción de cabezas y colas. La extracción de cuerpos que es la fracción deseada se pasa a un rectificador empacado y se efectúan nuevamente extracciones de cabezas y colas. El alcohol de cereales, son los cuerpos de la rectificación los cuales presentan un delicado aroma y excelente sabor. Este destilado es analizado para determinar sus características fisicoquímicas, el producto analizado se dispone para la preparación de lotes de producción normalmente de 10.000 litros donde se realizan mezclas de los diferentes lotes existentes para su caracterización para su trasladado a los procesos de añejamiento en barriles de roble. 38 3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION Actualmente se presenta un fuerte incremento en la demanda e implementación del proceso productivo de etanol a partir de diferentes materias primas y diversas tecnologías, desarrollándose estudios que mejoran el proceso de producción de etanol (Romero et al., 2005). Por tal motivo el presente estudio pretende encontrar una alternativa rentable para Destilería Premier LTDA en su producción de etanol a partir de almidón de cebada. Destilería Premier LTDA dentro de su proceso de producción de alcohol de cereales no realiza el malteo de la cebada, importa la materia prima para la elaboración de sus diferentes productos, por lo tanto, el presente trabajo pretende emplear cebada nacional no malteada como materia prima principal del proceso. Debido a que esta contiene cantidades inferiores de enzimas amilolíticas en relación a la cebada malteada, se busca establecer la concentración más eficiente de enzimas Multifect® AA 21L (α -amilasa) y Multifect® AA 23L (β -amilasa), para la degradación total o parcial del almidón contenido en los granos de la cebada, con el fin de reducir costos de producción sin alterar la calidad final de los productos. El empleo de enzimas tiene muchas ventajas: son de origen natural y por lo tanto no son tóxicas, son muy específicas en su manera de actuar, por lo que no propician reacciones secundarias indeseables, funcionan en condiciones moderadas de temperatura y de pH y no requieren de condiciones de procesamiento drásticas que puedan alterar la naturaleza del alimento, ni del equipo, actúan a bajas concentraciones y son fácilmente inactivadas una vez alcanzado el grado de transformación deseado (Hough, 1990). El obtener un producto estable sin alteraciones organolépticas utilizando una materia prima nacional representaría una disminución de costos para la empresa, así como también la eliminación del almacenamiento de grandes volúmenes de cebada importada, al poder realizar los pedidos de cebada nacional en función de la demanda de producción planificada y no por la oferta de cebada malteada en el exterior. 39 4. OBJETIVOS 4.1 OBJETIVO GENERAL Establecer la concentración de α y β amilasas comerciales en la obtención de etanol a partir de cebada sin maltear, como una alternativa de producción, empleando Saccharomyces cerevisiae. 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS • Establecer las concentraciones de las enzimas comerciales Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L, mediante la determinación de la concentración de azúcares fermentables y etanol producido utilizando como sustrato cebada sin maltear. • Medir parámetros físicoquímicos (pH, temperatura) durante el proceso degradativo y fermentativo del almidón de cebada que favorezcan la actividad de las enzimas y crecimiento de Saccharomyces cerevisiae. • Observar el comportamiento de Saccharomyces cerevisiae en las diferentes concentraciones de enzimas probadas, teniendo en cuenta la formación de biomasa, consumo de sustrato y producción de etanol en el medio de fermentación. • Comparar el desempeño durante el proceso hidrolítico y fermentativo entre los tratamientos con cebada sin maltear y las enzimas Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L; y el tratamiento con cebada malteada desarrollado tradicionalmente por la Destilería, con el fin de establecer la utilización de las enzimas comerciales como una alternativa para disminuir el volumen de importación de la cebada malteada. • Determinar la dosis óptima de las enzimas Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L para la etapa amilolítica del proceso de producción de alcohol cuando se emplea como sustrato cebada sin maltear, con el fin de establecer la rentabilidad del litro de etanol obtenido a partir de cebada sin maltear en relación al costo del litro de etanol que se obtiene normalmente con la cebada malteada usada en planta, sin arriesgar el aumento de costos. 40 5. MATERIALES Y MÉTODOS 5.1 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN En el presente trabajo se realizó un estudio experimental, con el fin de obtener la concentración óptima de alfa y beta amilasas comerciales en el proceso de hidrólisis del almidón de cebada sin maltear, que permitan obtener etanol por procesos fermentativos empleando Saccharomyces cerevisiae. 5.1.1 Población de estudio El presente trabajo se realizó en el laboratorio de control de calidad de la Destilería Premier LTDA., ubicado en el centro industrial Chapeton (Vía Nevado) de la ciudad de Ibagué, sobre muestras de cebada mateada y sin maltear para uso productivo en la industria del etanol, inoculadas con una concentración conocida de enzimas amilolíticas. Además se contó con el respaldo técnico del laboratorio de Bromatología de la Secretaría de Salud del Tolima de la ciudad de Ibagué. 5.1.2 Materiales Los ensayos se realizaron empleando cebada no malteada de la región cundiboyacense y cebada malteada importada de Malterías Unidas, Chile. 5.1.3 Enzimas y levadura Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L son enzimas comerciales de Genencor Internacional, Inc., las cuales son utilizadas en Destilería Premier LTDA. para el desarrollo de investigaciones de mejoramiento del proceso hidrolítico del almidón de cebada. Multifect® AA 21L es una α-amilasa estable a altas condiciones de calor y a un pH bajo, esta enzima no requiere calcio adicional para operar bajo condiciones de licuefacción industrial. Las condiciones recomendadas de licuefacción primaria son 105-110ºC por 5-7 minutos y secundaria 95ºC por 90-120 minutos (molido húmedo) ó 85-93ºC por 90-120 minutos (molido seco) a un pH entre 5.5-5.8. Multifect® AA 23L es una β-amilasa que exhibe excelente estabilidad a pH 5.5 o mayor y a una temperatura de 60º C. Estas enzimas cumplen con las actuales 41 condiciones de calidad de la FAO / OMS y el Codex para alimentos y productos Químicos y son GRAS (Generally Recognized As Safe) en los Estados Unidos (Ver Anexos 11 y 12). La levadura utilizada para la fermentación alcohólica fue Saccharomyces cerevisiae Safwhisky M-1 de la casa comercial Fermentis en una presentación de levadura seca instantánea (Ver Anexo 13). 5.2 MÉTODOS 5.2.1 Proceso hidrolítico del almidón Teniendo en cuenta la diferencia en cuanto a la concentración de enzimas entre la cebada mateada y la cebada no malteada para el proceso de hidrólisis, el trabajo experimental se desarrolló estableciendo la influencia de las concentraciones de enzimas en la liberación de azúcares reductores, formación de biomasa y alcohol. Durante esta etapa se realizó un control de comparación con las materias primas estandarizadas por la empresa para la producción de alcohol de cereales y un control negativo utilizando cebada sin maltear y sin presencia de enzimas amilolíticas (Ver Tabla 4). Tabla 4. Resumen del diseño experimental Concentración de Sustrato Ensayo 1 2 3 4 5 Control De Comparación Control Negativo Concentración de Enzimas Cebada Malteada Cebada Sin Maltear α-amilasa β-amilasa - 250g/L 250g/L 250g/L 250g/L 250g/L 5 mL/L 10 mL/L 15 mL/L 20 mL/L 25 mL/L 5 mL/L 10 mL/L 15 mL/L 20 mL/L 25 mL/L 250g/L - - - - 250g/L - - Fuente: Autor. 42 Todos los ensayos de hidrólisis se llevaron a cabo en un erlenmeyer de 2 litros en shaker termostatado, bajo las mismas condiciones de experimentación (Cáceres et al., 2008) (Ver Tabla 4). Para esto se tomaron 250 g, (25 % (p/p)) de cebada sin maltear y se mezclaron con 500 mL de agua destilada tibia durante 15 minutos, seguidamente se adicionó un volumen de 500 mL de buffer de acetato de sodio 0.05M (pH 5.5) (Frigard et al., 2002). La hidrólisis del almidón se realizó en dos etapas. En la primera o licuefacción, se añadió la α-amilasa termoestable durante 2 horas a 95ºC y pH 5.5. Para la sacarificación se adicionó la β- amilasa a 57ºC y pH 5.5 durante 6 horas (Linde et al., 2008). La hidrólisis de la mezcla se detuvo por adición de HCl 2M hasta pH 1.5-1.6. Finalmente se ajustó el pH a 5-6 (Shariffa et al., 2008) y las muestras se almacenaron a -20ºC para la determinación de azúcares reductores al final del proceso (Ebrahimi et al., 2007). Este procedimiento se realizó por duplicado. Las concentraciones de enzimas Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L evaluadas fueron 5, 10, 15, 20 y 25 mL/L, establecidas de acuerdo a ensayos previos realizados en la destilería bajo las mismas condiciones, en los cuales el manejo de una concentración inferior a 2 ml/L no representaría un mejoramiento en el proceso hidrolítico del almidón de cebada no malteada, Sin embargo, este rango de concentraciones también se establecieron por propuesta por parte del personal de calidad en base a la experiencia que estos poseen e interés de experimentar bajo este rango de concentraciones. A su vez se tuvieron en cuenta los resultados obtenidos por Chen et al. (2007) y Kolusheva y Marinova (2007), los cuales reportaron rendimientos de hidrólisis satisfactorios. 5.2.1.1 Control de comparación Se tomaron 250 g, 25 % (p/p) de cebada malteada mezclándolos en un 1 L de agua destilada a 45ºC durante 55 minutos, seguidamente se realizó la escala de temperatura establecida por la experiencia de la empresa de la siguiente forma: 52°C por 30 min, 62°C por 1 hora y 72°C por 30 min, con el fin de asegurar que los almidones de la cebada se transformen en azúcares, posteriormente se separó el mosto de cebada del resto de los afrechos de la misma, de tal forma que el mosto a fermentar esté libre de cascarilla, obteniéndose así un mosto o hidrolizado para 43 realizar el proceso de fermentación. Las muestras fueron almacenadas a -20ºC para la determinación de azúcares reductores (Ebrahimi et al., 2007). Finalmente el mosto obtenido se fermentó bajo las mismas condiciones de experimentación con las enzimas comerciales. 5.2.1.2 Control negativo Este control se desarrolló bajo las mismas condiciones amilolíticas y fermentativas del control de comparación utilizando cebada sin maltear y sin adición de enzimas durante el proceso hidrolítico. 5.2.2 Rendimiento del proceso de hidrólisis El rendimiento de la hidrólisis enzimática fue calculada de acuerdo a la formula reportada por Chen et al. (2007): Azúcares reductores x 0,9x 100 Rendimiento de Hidrólisis (%) = Polisacárido en el sustrato 5.2.3 Condiciones de fermentación 5.2.3.1 Pruebas preliminares Se realizó una fermentación previa bajo las mismas condiciones de experimentación de los tratamientos de hidrólisis con enzimas, empleando como sustrato mosto producto de la hidrólisis de cebada malteada, el cual se preparó bajo las mismas condiciones del control de comparación, con el fin de determinar el tiempo de duración de la fase aeróbica empleando tapón de algodón para los erlenmeyes; y durante la fase anaeróbica empleando tapón de caucho con filtro de salida de gases, para asegurar el crecimiento y fermentación de Saccharomyces cerevisiae Safwhisky M-1. La determinación de las fases se realizó cuantificando la concentración de biomasa en células/mL con cámara de Neubauer durante la fermentación, con el fin de establecer la duración de la fase exponencial o aeróbica y de esta forma observar el momento en el cual el crecimiento de la levadura se 44 vuelve estacionario dando lugar a la producción de alcohol en un ambiente anaerobio. 5.2.3.2 Preparación de inóculo Se sembró 1 g de Saccharomyces cerevisiae Safwhisky M-1 en 1 litro de mosto producto de la hidrólisis del almidón de la cebada malteada preparado bajo las mismas condiciones del control de comparación, no estéril, sin complementos nutricionales o ajuste de pH, en erlenmeyer, incubando con agitación a 30ºC, 100 rpm por 24 h (Siqueira et al, 2008). Figura 4. Reproducción del inóculo. Fuente: Autor. 5.2.3.3 Fermentación Las fermentaciones se llevaron a cabo en erlenmeyers de vidrio de 2L con un volumen de trabajo de 1L (incluido el inóculo). Se inoculó un 10 % de inóculo a una concentración de 1, 06 x106 UFC/mL de Saccharomyces cerevisiae Safwhisky M-1 en el producto de las hidrólisis con las diferentes concentraciones de enzimas y controles (Ebrahimi et al., 2007). Se adicionó sulfato de amonio como fuente de nitrógeno en una concentración de 1,5 g/L y se incubó en aerobiosis a 35 ± 2ºC con agitación de 100 rpm, durante el tiempo determinado en el ensayo previo de fermentación (numeral 5.2.3.1) (Cáceres et al., 2008). Pasado este tiempo se 45 cambió el tapón de algodón por un tapón de caucho con filtro de salida de CO2, para dar inicio a la fase de fermentación en condiciones anaeróbicas. Se tomaron muestras cada 12 horas para determinar biomasa (Cáceres et al., 2008). La concentración de azúcares reductores y etanol se determinaron al final del proceso de fermentación. Todos los ensayos se realizaron por duplicado. 5.3 DETERMINACIÓN DE BIOMASA La concentración de biomasa en células/mL se cuantificó con cámara de Neubauer (Alfenore et al., 2002) (Ver Anexo 3). 5.4 DETERMINACIÒN DE LA CONCENTRACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES Y ALMIDÓN. 5.4.1 Determinación del título de la solución de Fehling. Se valoró la solución de Fehling con la solución de glucosa al 0.5% (p/v) a partir de la cual se calculó el contenido de azúcares reductores (NTC 5146, 2008). Se vertieron 5 mL de solución de Fehling A y 5 mL de solución de Fehling B (Ver Anexo 1) en un erlenmeyer de 250 mL con 150 mL de agua destilada, agregando perlas de ebullición, para regular la ebullición, llevándose posteriormente a ebullición sobre la estufa con malla de asbesto durante 1.5-2 minutos. Mientras se va agitando el vaso se añade la disolución de glucosa al 0.5 % (p/v) desde una bureta hasta que solo quede una coloración azul suave, añadiendo 5 gotas de azul de metileno al 1 % y se continua la valoración (Ver Figura 5). El punto final corresponde al cambio de coloración de azul de metileno a rojo ladrillo. Entre el comienzo de la ebullición y la terminación de la valoración no deben transcurrir más de 3 minutos, además se debe mantener la ebullición durante la valoración (NTC 5146, 2008). La determinación se debe repetir hasta que los resultados no difieran en ± 0.2 mL. El título se calculó mediante la siguiente ecuación (NTC 5146, 2008): T = (Pg) x (Vg) 100 mL de la solución 46 T = Título: gramos de glucosa empleados para titular la solución de Fehling. Pg = Peso de glucosa empleado para preparar la solución patrón, en gramos. Vg = volumen del patrón para titular la solución de Fehling, en mL. Figura 5. Reacción de Fehling. Fuente: Autor. 5.4.2 Valoración de la muestra En un erlenmeyer limpio se agregó 5 mL de solución A, 5 mL de solución B de Fehling, 150 mL de agua destillada y unas perlas de vidrio. Procediéndose como se 47 indico el numeral 5.4.1, pero empleando como titulante el filtrado recogido de las muestras con las diferentes concentraciones de enzimas y controles (NTC 5146, 2008). 5.4.2.1 Cálculo de azúcares reductores El volumen de muestra y los gramos de solución de glucosa gastados para titular la solución de Fehling, son equivalentes (NTC 5146, 2008). Azúcares reductores expresados en gramos de glucosa/ L de producto (NTC 5146, 2008): Gramos glucosa/L = 1000 mL x Título V gastado x V alícuota 5.5 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ETANOL Para la determinación de la concentración de etanol se utilizó el método por destilación y estimación del contenido alcohólico por determinación de la gravedad específica. En este método el producto se sometió a destilación en condiciones especificadas, determinándose la densidad del destilado y con este valor y utilizando tablas correspondientes se calculó el grado alcoholimétrico (NTC 5113, 2008). 5.5.1 Destilación Utilizando un matraz aforado de 250 mL, se llenó casi hasta la marca con la muestra y colocándose en un baño a temperatura constante a 20ºC por una hora. Manteniéndolo en el baño, se completó el volumen con la cantidad necesaria de muestra, a 20ºC. Teniendo instalado el destilador, se vertió en el matraz con la ayuda de un embudo la muestra contenida en el balón aforado; lavándose el recipiente que contiene la muestra y el embudo, con tres porciones de 15 mL de agua destilada, las cuales se añaden al matraz de destilación, retirando el embudo y agregando una pequeña cantidad de regulador de ebullición, tapando y dando comienzo a la destilación, recogiendo el destilado en el mismo matraz en que se 48 midió la muestra. El matraz en el que se recoge la muestra debe tener previamente 10 mL a 20 mL de agua, en los que se sumerge la punta de un tubo que prolonga el refrigerante (NTC 5113, 2008). Figura 6. Destilación de las muestras. Fuente: Autor. El calentamiento se reguló de tal forma que la destilación ocurra sin sobresaltos de manera lenta pero continua. Se continúo la destilación hasta que el destilado llegue, aproximadamente, hasta los hombros del matraz. Se suspendió la destilación, se retiró el tubo colocando en la parte interior del refrigerante y lavando con agua, por dentro y por fuera, sobre el mismo matraz pero sin llegar al cuello de éste. Se colocó el matraz en el baño de temperatura contante a 20ºC por una hora y, sin retirarlo del baño, se completó a volumen con agua a 20ºC. Una vez terminada la destilación y completado a volumen el destilado, se procedió a determinar su gravedad específica por el método del picnómetro, para lo cual se pesó un picnómetro vacío, limpio y seco (NTC 5113, 2008). 49 Se llenó con agua a 20ºC y se pesó para obtener el peso del agua contenida. Se desocupó el picnómetro, se lavó varias veces con pequeñas cantidades del destilado, llenandolo con el destilado a 20ºC y volviéndolo a pesar para obtener el peso del destilado (NTC 5113, 2008). Figura 7. Determinación del peso del destilado. Fuente: Autor. 5.5.1.1 Cálculo de la gravedad específica La gravead específica se calculo por la siguiente fórmula (NTC 5113, 2008): Peso del destilado Gravedad específica = Peso del agua Con los resultados obtenidos se calcularon los grados alcoholimétricos, por medio de las tablas correspondientes (NTC 5113, 2008). 5.6 VARIABLES DE ESTUDIO • Las variables independientes de estudio son la concentración de α y β amilasas. 50 • Las variables dependientes son la concentración de azúcares reductores, formación de biomasa de Saccharomyces cerevisiae, y producción de etanol. 5.7 RECOLECCIÓN DE LA INFORMACIÓN Se realizó una revisión bibliográfica en el compendio de norma técnicas y guías de implementación de normas del sector bebidas alcohólicas del ICONTEC, libros, artículos científicos, revistas especializadas en el tema y normas relacionadas con la elaboración y calidad microbiológica de las bebidas alcohólicas, específicamente para aquellas producidas a partir de cebada. Así mismo, la preparación de reactivos, medios de cultivo y el desarrollo de los métodos se realizaran según Procedimientos Operativos Estándar. Todos los resultados obtenidos serán llevados en una bitácora, anotando la fecha de montaje experimental, evolución, observaciones, fecha de análisis y los resultados obtenidos. 5.8 ANÁLISIS DE INFORMACIÓN Para el análisis estadístico de los datos obtenidos, se realizó un análisis de varianza y se aplicó la prueba de Tukey para determinar si entre los niveles de cada factor hay diferencias significativas. Las variables de respuesta fueron biomasa, concentración de azúcares reductores y producción de etanol. La hipótesis nula será que hay igualdad de medias entre los niveles para cada factor, así: Para el factor α amilasa: Ho: 5 = 10 = 15 = 20 = 25 Ha: Al menos dos son diferentes Para el factor β amilasa: Ho: 5 = 10 = 15 = 20 = 25 Ha: Al menos dos son diferentes. 51 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 6.1 CARACTERIZACION DE LAS CEBADAS Para poder iniciar el estudio, fue necesario determinar la concentración de almidón presente en cada una de las cebadas empleadas, en donde se encontró que la cebada malteada posee un 80% de almidón y la cebada sin maltear un 60%, como se puede observar en la Tabla 5. Tabla 5. Resultados de la concentración de almidón realizados a la cebada mateada y sin matear. Tipo % Almidón Representación Cebada malteada 80 Cebada sin maltear 60 Estos valores concuerdan con los mencionados en el marco teórico (Ver Tabla 1). Descartándose que cualquier irregularidad en los ensayos sea ocasionada por limitación de la concentración de almidón. En el trabajo realizado por Chen et al. 52 (2007), se describe que la concentración de sustrato resulta ser un factor crítico en el momento de la liberación de azúcares reductores, sustentando de manera confirmativa lo descrito anteriormente, es decir, a mayor concentración de sustrato la cantidad de azúcares reductores disponibles para la levadura se incrementan. Considerando de esta forma a estas cebadas como sustratos manejables para la levadura, y su fermentación (Santander, 2006), debido a que la concentración de azúcares fermentables producidos en el proceso de hidrólisis de almidón de cebada determinarán más adelante las condiciones de fermentación para la producción de etanol. 6.2 PROCESO HIDROLÍTICO DEL ALMIDÓN DE CEBADA SIN MALTEAR Para establecer la concentración óptima de α y β amilasas comerciales en la obtención de etanol a partir de cebada sin maltear empleando Saccharomyces cerevisiae, se tuvieron en cuenta los siguientes factores: concentración de azúcares reductores, pH, temperatura, formación de biomasa y producción de etanol. En orden a lo citado anteriormente, se experimentó con una concentración de cebada de 250 g/L, estipulada como la dosis equivalente en una base de cálculo de un litro, a la concentración empleada a escala industrial determinada en base a la experiencia práctica y teórica de la destilería, asegurando de esta forma el consumo total de los azúcares por parte de la levadura. Esta concentración se confirma con lo reportado por Kolusheva y Marinova (2007), quienes obtuvieron la mejor condición de hidrólisis de almidón con una concentración de sustrato de 250 g/L, ya que evidenciaron una inhibición generada por los azúcares reductores obtenidos durante la hidrólisis del sustrato en concentraciones superiores al 250 g/L. Para probar esta hipótesis, investigaron la influencia de la concentración de la glucosa añadida al sustrato sobre el tipo de reacción enzimática, concluyendo que la adición de glucosa en el inicio del proceso de hidrólisis, reduce significativamente la velocidad de reacción del proceso, y el porcentaje de esta reducción es proporcional a la cantidad de glucosa añadida. Como es conocido, la tasa máxima de reacción enzimática es proporcional a la concentración de enzimas (Kolusheva y Marinova, 2007), por lo tanto, se determinó 53 la concentración de alfa y beta amilasas comerciales necesaria para degradar el almidón presente en la cebada no malteada, de tal forma que Saccharomyces cerevisiae utilice los productos de la hidrólisis como fuente de energía. Se examinó esta influencia en un rango de concentraciones entre 5-25 mL enzimas por litro de suspensión. En la Gráfica 1 se observa la relación obtenida entre la concentración de azúcares reductores y las dosis de enzimas adicionadas para el proceso hidrolítico, evidenciando cómo la concentración de azúcares reductores aumenta a medida que se incrementa la dosis de enzima, hasta la concentración de de 20 mL/L, como respuesta a la hidrólisis de almidón, demostrándose que el medio y las condiciones utilizadas para el proceso hidrolítico, llevado a cabo por la acción catalítica de las enzimas Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L fueron los adecuados. Sin embargo, Kolusheva y Marinova (2007) reportan, que la mayoría de las veces la hidrólisis enzimática se lleva a cabo con α-amilasas y con menos frecuencia son empleadas las β-amilasas, demostrándose con los resultados obtenidos que estas dos enzimas pueden llegar realizar una labor sinérgica para hidrolizar el almidón de la cebada sin maltear. Además, de acuerdo con lo reportado Eglinton (1998), las beta-amilasas son enzimas claves en la degradación del almidón de la cebada germinada (Hordeum vulgare L.), la cual es sintetizada durante el desarrollo de la cebada grano, en contraste con otras importantes enzimas hidrolíticas que son sintetizados durante la germinación. Gráfica 1. Concentración de azúcares reductores en función de la dosis de de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo después de la hidrólisis por 8h. 54 En la Gráfica 1 se observa, que el valor obtenido de azúcares reductores en el control negativo, fue inferior en relación a los valores obtenidos en todos los ensayos con enzimas, demostrando que efectivamente se logró hidrolizar el almidón de la cebada sin maltear reflejándose en el aumento de la concentración de azúcares reductores, desaparición del característico color azul con yodo (Ver Figura Anexo 5.2), y en la turbidez y color del medio (Ver Figura Anexo 5.1) (Norris y Richmond, 1981).Por lo que se podría considerar el uso estas como una ayuda para mejorar el rendimiento hidrolítico del almidón de la cebada sin maltear, utilizada en el proceso de producción de la destilería. Teniendo en cuenta, que generalmente la acción de α y β amilasas sobre el almidón natural de los granos no es muy efectiva por que estos presentan una resistencia a la digestión amilolítica (Sarikaya et al., 2000), los valores obtenidos de las concentraciones de azúcares reductores, demuestran lo reportado por Lauro (2001), donde la acción hidrolítica de las amilasas sobre el almidón de granos de cebada se lleva a cabo porque estas enzimas erosionan la superficie del grano o digieren canales en puntos seleccionados en la superficie hacia el centro del grano, permitiendo la difusión de la enzima hacia el sustrato, la adsorción de la enzima sobre el sustrato y el evento catalizador. En la Gráfica 1, se evidencia una caída en los valores de la concentración de azúcares reductores entre la concentración con 20 mL/L y 25 mL/L, la causa de este hecho según lo reportado por Kolusheva y Marinova (2007), se debe a que entre mayor sea la concentración de enzimas y menor sea el sustrato disponible, la tasa de reacción disminuye, porque hay menos lugares de reacción activos disponibles para hidrolizar el almidón, generando una limitante por exceso de enzimas. Comparando los resultados anteriores, se determinó que la concentración óptima de enzimas para producción del mosto ó hidrolizado de fermentación es 20 mL/L, ya que la utilización de concentraciones mayores no se traduce en un aumento de la tasa de reacción enzimática (Tabla Anexo 4.1). Kolusheva y Marinova (2007), reportan en su trabajo que los parámetros básicos que afectan al proceso de hidrólisis son la temperatura, el tiempo de hidrólisis, el pH 55 del medio, la concentración del sustrato y la concentración de la enzima, los cuales varían dependiendo de la enzima. Teniendo en cuenta lo anterior, todos los ensayos se desarrollaron bajo las mismas condiciones de pH (5.5), temperatura (95oC para α- amilasa y 57oC para β-amilasa), y tiempo de hidrólisis (8 horas). Los resultados obtenidos del proceso hidrolítico, concuerdan con los obtenidos en el estudio de la influencia de la temperatura sobre la tasa de hidrólisis por Kolusheva y Marinova (2007), quienes determinaron que la tasa de la reacción enzimática es casi idéntica a 90°C y 100°C, eligiendo 90°C como la temperatura óptima. De igual forma, Hill et al. (1997) reportaron que la mayor tasa de hidrólisis obtenida con una α-amilasa fue pH 5.5. En cuanto al tiempo de hidrólisis, Kolusheva y Marinova (2007) en sus resultados sobre la influencia del tiempo de hidrólisis en la concentración de azúcares reductores, obtuvieron la máxima concentración de azúcares reductores y, por ende, el nivel máximo de hidrólisis después de 4 horas y 15 minutos. Sin embargo, reportan que el comportamiento hidrolítico de otra amilasa termoestable, sintetizada por B. licheniformis MB-80 tuvo una duración superior a 7 horas, lo que concuerda con el tiempo empleado para la hidrólisis del almidón de cebada, y confirmándose con los valores de las concentraciones de azúcares reductores de la Grafica 1. Tabla 6. Datos del rendimiento de hidrolisis obtenidos en el proceso hidrolítico. Dosis de Enzimas Rendimiento de (mL/L) hidrólisis (%) 5 66.9964 10 67.3686 15 73.1762 20 89.4376 25 65.3359 Control de 41.8491 comparación Control Negativo 3.8570 56 Otro parámetro evaluado fue el rendimiento de hidrólisis, estos datos están presentados en la Tabla 6, exhibiendo que la prueba con el mejor rendimiento de hidrolisis fue con la dosis con 20 mL/L (89,44%), seguida de la dosis con 15 mL de enzimas (73.17%), demostrándose que la presencia de enzimas es fundamental para la obtención de un mejor rendimiento hidrolítico, ya que en todos los tratamientos con enzimas y en el control de comparación se obtuvo un rendimiento satisfactorio en relación al control negativo, en el cual la concentración de amilasas es insuficiente para la degradación completa del almidón presente en la cebada, razón por la cual el valor del rendimiento de hidrólisis es bajo. Al igual que en la liberación de azúcares reductores, la tendencia seguida por el rendimiento de la hidrólisis enzimática es similar, tal como se aprecia en la Gráfica 2, coincidiendo con lo reportado por Chen et al. (2007), quienes reportaron este parámetro para la determinación del efecto de la concentración de sustrato y de enzimas en el proceso de hidrólisis enzimática, donde la concentración de azúcares reductores tenía una tendencia de variación similar al rendimiento de hidrólisis, aumentando ambas a medida que la concentración de enzimas era mayor. Gráfica 2. Relación azúcares reductores producidos y rendimiento de hidrólisis en función de la concentración de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo. 57 Los análisis estadísticos fueron realizados por medio del programa computarizado SPSS vs 10, en donde se cumplió la hipótesis alterna (ver numeral 5.8), presentando diferencias significativas entre los tratamientos (Ver Tabla Anexo 9.1 y 9.2), confirmando que las dosis de enzimas influyen significativamente en la concentración de azúcares reductores (p<0,005) y del rendimiento de la hidrólisis enzimática (p<0,005), obteniendo la mayor concentración de estos en el tratamiento con 20 mL/L de enzimas. 6.3 ENSAYO PREVIO DE FERMENTACIÓN La conversión de glucosa a etanol es llevada a cabo por muchas levaduras, pero muy pocas bacterias. En los procesos industriales generalmente es utilizada levadura del género Saccharomyces, ya que posee un rendimiento teórico de 51.1% (p/p) (Glazer y Nikaido, 1998), además de ser un microorganismo no patógeno anaerobio facultativo (Navarro y Sossa, 2003). Por esta razón y por ser esta la levadura empleada en Destilería Premier LTDA. en su proceso productivo, se seleccionó Saccharomyces cerevisiae cepa Safwhisky M-1 para la fermentación de los mostos generados en el proceso de hidrólisis (Ver Anexo 12). Para predecir el desarrollo de la fermentación fue necesario conocer la curva de crecimiento de la levadura (UFC/mL), determinado los intervalos de tiempo para la fase aerobia y anaeróbica, debido a que las levaduras en aerobiosis oxidan los azúcares simples como la glucosa hasta gas carbónico y agua por la vía de Embden Meyerhoff Parnas y después el ciclo de Krebs, para producir ATP, NADH+H+ y formar radicales carbonados intermediarios en la biosíntesis celular. Mientras que en anaerobiosis se produce etanol y CO2 (Madigan et al., 2003). Razón por la cual,, se realizó una fermentación previa, empleando un hidrolizado de cebada obtenido bajo las mismas condiciones de experimentación del control comparación tal como se observa en la Gráfica 3, evidenciando que a partir de la hora 6 empieza una fase logarítmica hasta la hora 36 de fermentación. Navarro y Sossa (2003), reportan que la glucosa (azúcar reductor) que es la fuente principal de carbono en el medio disminuye con el paso del tiempo, reflejándose en el aumento de la biomasa. A la hora 48 de fermentación se presenta la mayor cantidad de UFC/mL con un recuento 58 de 2,88x 109 UFC/mL, como se aprecia en la Tabla Anexo 6.1. Sin embargo el recuento entre la hora 36 y 48 no presentó un aumento significativo, como se puede ver en la Gráfica 3, determinando que la fase aeróbica de fermentación de los tratamientos con enzimas y controles seria durante las primeras 36 horas de crecimiento de S. cerevisiae Safwhisky M-1, teniendo en cuenta que muchas fermentaciones anaeróbicas requieren una fase inicial de crecimiento aeróbico como es el caso de la producción de dextranos, alcoholes y 2,3 etilenglicol, y sólo después, en la fase de producción se generan condiciones reductoras (Rhodes y Fletcher 1969). Gráfica 3. Curva de Crecimiento de Saccharomyces cerevisiae durante el ensayo previo de experimentación. En la gráfica 3, se observa una fase estacionaria corta, con una duración de 24 horas, es decir entre la hora 36 y a la 60. A partir de la hora 60 empieza la fase de muerte de la levadura, donde disminuye la viabilidad celular hasta finalizar con un recuento de 8,0 x 108 UFC/mL, como se aprecia en la Tabla Anexo 6.1. Estudios han demostrado el papel que tienen los esteroles en la fermentación de cerveza y whisky, estando conectados con la necesidad de oxígeno en el proceso de fermentación. En el estudio realizado por Aries et al. (1977), observaron que el oxígeno durante la fermentación es necesario para la ciclización del escualeno a 59 lanosterol. En ausencia de oxígeno, el escualeno se acumula y el contenido de esteroles disminuye, reduciendo el crecimiento de la levadura, mientras que en presencia de oxígeno conduce a una mayor síntesis de ergosterol, concurrente con el aumento en el crecimiento de la levadura. En otro estudio, realizado por Hayashida y Ohta (1980), se demostró el papel del ergosterol sobre la tolerancia del etanol, complementando las células con ergosterol solo y ergosterol con ácido oleico durante 48 h, evaluándose la indurabilidad de las células y la acción fermentativa en presencia de alcohol (20%). Se observó que el oleato de ergosterol ligeramente promueve el crecimiento, mientras que en alcohol la indurabilidad de las células fue notablemente mayor. Aunque el ácido oleico y el ergosterol en combinación mejoran el crecimiento y el alcohol indurabiliza, ninguno de estos puede aumentar la actividad fermentativa de las células. Por lo tanto, se sugirió que los esteroles son cruciales para la promoción de la indurabilidad de células en presencia de alcohol mediante el suministro de rigidez a la membrana. Una disminución en el contenido de ergosterol de la membrana de la célula también ha sido directamente relacionada con disminución de la viabilidad celular en presencia de etanol (Larue et al. 1980; Lees et al., 1980). Por último, de acuerdo con los resultados obtenidos en el ensayo previo de fermentación, se determinó que para los tratamientos con enzimas y controles, se suspendería la entrada de aire a partir de las 36 horas, empleando un tapón de caucho y filtro de salida de gases hasta terminar la fermentación, considerando que partir de este punto inicia la fase estacionaria en donde la ausencia de oxigeno favorece la fermentación de azúcares hasta etanol, terminado la fermentación a las 84 horas. A pesar que esta fermentación se dé durante un tiempo prologado, el objetivo de dejar hasta la hora 84 fue recuperar el mayor volumen de etanol que las levaduras pudieran producir, además de poder observa el comportamiento de las levaduras durante este tiempo, a su vez se estableció este periodo de fermentación en base a la experiencia de experimentación obtenida por parte del personal en la destilería. 60 6.4 FERMENTACIÓN DE Saccharomyces cerevisiae EN HIDROLIZADO DE CEBADA SIN MALTEAR Las levaduras son comúnmente los microorganismos más utilizados para la fermentación alcohólica. El cultivo anaeróbico de Saccharomyces cerevisiae, genera además de etanol, dióxido de carbono, glicerol y biomasa como los más importantes subproductos (Brandberg et al., 2007). Siqueira et al. (2008), reportan en su trabajo que para la producción de biomasa de Saccharomyces cerevisiae, realizaron la propagación del inóculo bajo condiciones de agitación de 100 rpm y 30°C durante 24 horas. Condiciones que se adoptaron para la producción del inóculo de Saccharomyces cerevisiae cepa Safwhisky M-1, con el fin de asegurar una gran producción de biomasa, obteniendo un recuento de 1,06 x 106 UFC/mL. Para evaluar el comportamiento de la levadura se evaluaron durante la fermentación diferentes parámetros tales como la producción de biomasa (UFC/mL), y la concentración de azúcares reductores y etanol al final de la fermentación. En orden a lo mencionado anteriormente, de cada repetición de un tratamiento, se sacó una curva de crecimiento promedio que permitió observar el comportamiento de S. cerevisiae Safwhisky M-1 a lo largo de la fermentación en el hidrolizado de cebada, producto de las diferentes concentraciones de amilasas comerciales estudiadas. En la Gráfica 4, se observan las curvas de crecimiento obtenidas, evidenciando que las células no necesitaron de una fase de adaptación, desde la hora cero empezaron un crecimiento exponencial que terminó en la hora 48, a partir de la cual la población empezó a disminuir, en este caso no se evidenció la fase de muerte. Reducir la fase de adaptación a cero horas, implica alcanzar en menos tiempo la concentración de células necesaria para iniciar el proceso de fermentación, lo cual es muy bueno para optimizar la reproducción llevada a cabo en planta (Santander, 2006). Además, la razón por la cual, a partir de la hora 48 la formación de biomasa muestra un comportamiento estacionario, donde los valores de los recuento tienden a disminuir, como se aprecia en las Tablas Anexo 6, es debido a que la glucosa presente en el medio entra a un proceso glicolítico, seguido por uno fermentativo, 61 Gráfica 4. Población de Saccharomyces cerevisiae presente en el medio de fermentación con las diferentes concentraciones de enzimas. donde solo se genera un ATP en la primera etapa (glicolisis), lo que representa un rendimiento más bajo que el obtenido por vía aerobia (Glazer & Nikaido 1998), además del agotamiento de este azúcar en el medio. La Gráfica 4, muestra el comportamiento obtenido de la población durante el proceso de fermentación de 84 horas en los mostos resultantes de la hidrólisis con las amilasas. Al comparar los datos obtenidos, no se observa que una diferencia significativa entre los recuentos de los diferentes ensayos, sin embargo las curvas con mejor desempeño fueron aquellas donde el medio fue tratado con las concentraciones más altas de enzimas (Ver Tablas Anexo 6 y Gráficas Anexo 7). La población de todos los ensayos tienden a aumentar con el transcurso del tiempo durante las primeras horas de fermentación aproximadamente hasta la hora 48, con excepción del ensayo con 5mL/L (Hora 54); momento en el cual se obtiene la biomasa máxima para todos los tratamientos, a partir de este punto se evidencia un descenso de la población, debido al agotamiento del sustrato, en este caso glucosa, ya que los valores obtenidos de la concentración de azúcares reductores al final de la fermentación son inferiores a los obtenidos al inicio de la fermentación (Ver Tabla Anexo 6.9). Además, S. cerevisiae tiene la capacidad de alcanzar tasas de glicolisis 62 y de producción de etanol en condiciones óptimas en poco tiempo, pero esta tasa se mantiene sólo por un breve período durante la fermentación y disminuye progresivamente a medida que el etanol se acumula en el medio (Casey y Ingledew, 1977; Ingram y Buttke, 1984; Moulin et al., 1984). Estudios anteriores han identificado una necesidad esencial de lípidos (Beavan et al., 1982; Casey et al., 1984; Thomas et al., 1978) u oxígeno molecular para la biosíntesis de los lípidos (Andreason y Stier, 1954; Buttke et al., 1980; Buttke y Pyle, 1982) en muchos medios de fermentación para el mantenimiento de una actividad fermentativa alta. El suministro de estas necesidades nutricionales reduce, pero no elimina la disminución de la actividad fermentativa durante la fermentación. Se conoce que el etanol altera la permeabilidad de membrana y la función de la membrana en una variedad de sistemas biológicos (Casey y Ingledew, 1986; Ingram y Buttke, 1984). En levaduras, el etanol provoca un aumento en el flujo de iones de hidrógeno a través de la membrana plasmática de las células suspendidas en agua (Cartwright, et al., 1986). Este aumento de flujo de iones de hidrógeno se ha propuesto como el responsable de la inducción del etanol, disminuyendo las tasas de transporte observadas en condiciones similares (Beavan, 1982; Leao y Van Uden, 1982; Leao y Van Uden,1984; Leao y Van Uden,1984). Demostrándose que la acumulación de etanol no puede ser el único factor responsable para la disminución de la actividad fermentativa, ya que la sustitución del medio de fermentación que contiene etanol por uno nuevo que carece de este, no restablece inmediatamente la actividad fermentativa (Dombek y Ingram, 1986.). Millar et al. (1982) demostró que las concentraciones de etanol por debajo del 12% (v/v) no desnaturaliza las enzimas o causa una inhibición de la actividad apreciable in vitro. Dado a que el etanol no se acumula dentro de levadura, pero si se difunde rápido en toda la membrana celular (Dombek y Ingram, 1985; Guijarro y Lagunas, 1984), inhibiendo directamente las enzimas glicolíticas intracelulares, sin embargo, reportan que es poco probable que durante la fermentación se produzca una concentración del 12% (v/v) de etanol o menos. En la gráfica 4 también se observa, que las curvas de crecimiento de todos ensayos con enzimas están muy cercanas a la curva de control de comparación, en especial los tratamientos con concentraciones de enzimas mayores, lo que demuestra que 63 los hidrolizados de cebada fueron medios con concentraciones de azúcares adecuadas para el desarrollo de Saccharomyces, logrando tener un comportamiento muy cercano al establecido tradicionalmente por la destilería (control de comparación). Sin embargo, teniendo en cuenta el valor obtenido de azúcares reductores en el control de comparación (Ver Gráfica 1), se puede decir que en este medio los azúcares liberados al medio son fácilmente asimilados por las levaduras, favoreciendo una mayor formación de biomasa en relación a las curvas de crecimiento obtenidas en los tratamientos con enzimas en los cuales todos presentaron valores de azúcares reductores superiores a este control, no obstante, este valor no indica que toda esta concentración sea aprovechable para las levaduras, ya que de acuerdo con lo reportado por Hornesey (2003), estas enzimas pueden producir altos niveles de monosacáridos pero relativamente poco azúcar fermentecible. En la Gráfica 5 se evidencia, que las barras que representan el valor de la biomasa máxima alcanzada en los diferentes ensayos, tienden a alcanzar la misma altura, lo anterior no expresa que todos los ensayos tengan el mismo valor de biomasa máxima, por ejemplo el tratamiento con una concentración de enzimas de 25 mL/L presento la población máximas más alta a la hora 48 (2,35 x 109 UFC/mL), seguido por el control positivo (2,33x 109 UFC/mL), y las concentraciones de 20 mL/L,10 mL/L y 15 mL/L(2,15x109 UFC/mL, 1,98x109 UFC/mL, 1,83x109 UFC/mL, respectivamente), mientras que los valores más bajos fueron obtenidos en la concentración de 5 mL/L (8,0x108 UFC/mL) a la hora 54 y en el control negativo (7,75x108 UFC/mL). Aunque el ensayo llevado a cabo con 25 mL/L de α y βamilasas alcanzó el valor de biomasa máxima mayor y sabiendo que este es un factor importante, no se escogió a esta dosis por la baja concentración de azúcares reductores liberados en la hidrólisis del almidón de cebada, al descartarla le sigue la concentración con 20 mL/L, en la cual se obtuvo la mayor concentración de azúcares reductores, y el valor de biomasa máxima para esta no está tan alejado al de la concentración con 25 mL/L, alcanzando la biomasa máxima, también a las 48 horas de fermentación. 64 Gráfica 5. Relación entre concentración de células/mL máxima y el tiempo de obtención de la biomasa máxima de S. cerevisiae en función de la concentración de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo. En la Gráfica 5 se observa, que al incrementar la dosis de enzimas se favorece la producción de biomasa a pesar que la diferencia entre ensayos no es representativa. También se evidencia que el tiempo en el que alcanza S. cerevisiae su biomasa máxima, se ve influenciado por la concentración de enzimas, como por ejemplo, en el medio con 5 mL/L de enzimas S. cerevisiae alcanzó su biomasa máxima a la hora 54 de fermentación, en comparación al tiempo en el cual S. cerevisiae alcanzó su biomasa máxima en todos los demás tratamientos, el cual fue a las horas 48 horas de fermentación. Al analizar estadísticamente los resultados obtenidos de biomasa, se comprueba que existe diferencias significativas entre los tratamientos (Ver Tabla Anexo 9.3 y 9.4), confirmando que las dosis de enzimas influyen significativamente en la formación de biomasa (p<0,005). Además se demostró, que la concentración de enzimas no influye en el tiempo en el cual la levadura alcanza su biomasa máxima , ya que no se presentaron diferencias significativas, razón por la cual, S. cerevisiae 65 presentó una tasa de crecimiento diferente en cada tratamiento con una determinada concentración de enzimas, debido a que en cada ensayo se obtuvo una concentración diferente de azúcares disponibles para la levadura, consumiéndolos como fuente de carbono y energía, independiente del tiempo de fermentación. 6.4.1 Consumo de sustrato La glucosa (azúcar reductor) es la fuente principal de carbono en los hidrolizados de cebada, disminuyendo con el tiempo de fermentación, como se observa en la Gráfica 6, evidenciando que las concentraciones de azúcares reductores obtenidas en el proceso de hidrólisis caen drásticamente hasta una concentración determinada para cada ensayo, especialmente en los tratamientos con las concentraciones de enzimas más altas. Este descenso o consumo de sustrato, es causado por que los azúcares disponibles en el medio son utilizados por la levadura como fuente de carbono. Se observa también, que el consumo de sustrato es proporcional a la concentración de azúcares reductores iníciales de la fermentación, entre mayor sea la fuente de carbono disponible, mayor será el consumo de sustrato por parte de la levadura. Demostrando que la variación observada a nivel de población de S. cerevisiae en los diferentes tratamientos con enzimas, se debe a la concentración de azúcares disponibles, valor que está directamente determinado por la concentración de enzimas presente en el medio. El consumo de sustrato observado, demuestra que los azúcares reductores presentes en el hidrolizado son fácilmente metabolizados por la levadura, ya que, Saccharomyces cerevisiae posee una baja batería enzimática, donde solo puede fermentar hexosas como: D-glucosa, D-fructosa y D-manosa, aunque no todas las utiliza a la misma velocidad (Tuite y Oliver, 1991), indicando también que el azúcar que posiblemente pueden estar presente en el hidrolizado es principalmente la glucosa, a demás de ser el monómero constituyente del almidón. 66 Gráfica 6. Relación entre la concentración de azúcares reductores inicial y final de la fermentación con S. cerevisiae en función de la concentración de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo. En la Tabla 7, se observa que la variación entre los valores de la biomasa máxima obtenidos, no es tan grande como la del consumo de sustrato, en relación a la concentración de enzimas, por lo que se puede decir que la presencia de las enzimas influye en el aprovechamiento del sustrato para producir biomasa (Santander, 2006). Sin embargo, al comparar el tratamiento con 15 mL/L de enzimas, y el de 25 mL/L, el consumo de sustrato obtenido para estos es muy parecido (42,312 g/L, 41,084 g/L, respectivamente), pero la biomasa producida con ese mismo consumo es más alta cuando la concentración de enzimas es mayor. Según estos resultados, adicionar una dosis de enzimas mayor al medio, hace más eficiente el consumo de sustrato, la célula aprovecha los azúcares para producir más biomasa que para otras funciones fisiológicas (Santander, 2006), demostrándose con los resultados obtenidos de formación de biomasa (Ver Gráfica 4), donde Saccharomyces cerevisiae incrementa su tasa de crecimiento a medida que aumenta la concentración de enzimas, ya que en los tratamientos con dosis de enzimas mayores, se obtuvieron las concentraciones de azúcares reductores y consumos de sustrato más altos, confirmando que la levadura toma los azúcares 67 reductores presentes en el medio como fuente de carbono y energía (Navarro y Sossa, 2003). Tabla 7. Datos de la biomasa máxima alcanzada y el consumo de sustrato bajos las diferentes concentración de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo. Concentración de enzimas mL/L Log Biomasa máx (UFC/mL) Sustrato Consumido (g/L) 5 8,902 36,159 10 9,295 38,274 15 9,261 42,312 20 9,332 53,400 25 9,371 41,084 C+ 9,366 34,208 C- 8,889 0,159 Por otro lado, en el control negativo, se evidencia que Saccharomyces cerevisiae alcanza un valor de biomasa máxima de 8,889 Log UFC/mL, mostrando una mínima diferencia de 0,013 Log UFC/mL con el tratamiento de 5 mL/L de enzimas, teniendo en cuenta que en este control no hay un elemento enzimático que realizara la hidrólisis del almidón, se considera que este comportamiento se da, por la presencia de fuentes de carbono diferentes a los azúcares liberados del almidón y de fácil asimilación para la levadura, porque los valores obtenidos de azúcares reductores y del consumo de estos para este control fueron muy bajos, razón por la cual, la concentración de azúcares obtenida no tiene una correlación con el valor de biomasa obtenido . Como se observa en la Gráfica 7, el aumento de la dosis de enzimas influye en el consumo de sustrato, mostrando un comportamiento de variación similar. Se evidencia que la concentración de enzimas con mayor consumo de sustrato es la recomendada en este estudio, 20 mL/L (53,4 g/L), sin embargo, en los tratamientos 68 70 Sustrato Consumido (g/L) 60 50 40 30 20 10 0 5 10 15 20 25 C+ C- Dosis de Enzimas (ml/L) Gráfica 7. Consumo total de sustrato bajo las diferentes concentraciones de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo. con las diferentes concentraciones de enzimas se observan consumos no tan lejanos a los obtenidos en esta concentración, pero si superiores al control de comparación (Ver tabla ANEXO 6.9), demostrándose, que el empleo de este tipo enzimas favorece a la liberación de azúcares reductores en la hidrólisis del almidón de la cebada sin maltear, los cuales serán asimilados por la levadura para su mantenimiento celular. Al analizar estadísticamente los resultados obtenidos de consumo de sustrato, se comprueba que existe diferencias significativas entre los tratamientos (Ver Tabla Anexo 9.5), confirmando que las dosis de enzimas influyen significativamente en la formación de biomasa, obteniendo el mayor consumo en el tratamiento con 20 mL/L de enzimas (p<0,005). 6.4.2 Producción de etanol En la Gráfica 8 se observa, la concentración de etanol obtenido en la fermentación con S. cerevisiae Safwhisky M-1 en función de la concentración de enzimas utilizadas en el proceso hidrolítico. Se evidencia, que la tendencia que tiene la concentración etanol es aumentar, a medida que se incrementa la dosis de enzima 69 (Ver tabla Anexo 6.11). El tratamiento con mayor producción de etanol fue con 20 mL/L de enzimas, comprobando que el aumento de la dosis de enzimas, favorece la obtención de etanol. Sin embargo, los valores de etanol obtenidos en la concentración de 15 mL/L, en relación a los de la concentración de 20 mL/l presentan una variación de solo 0,58% de etanol, por lo que el rendimiento de esta concentración es muy cercano al mejor (20mL/L). Gráfica 8. Producción total de etanol bajos las diferentes concentración de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo. En la gráfica 9, se observa que la producción de etanol en la concentración de 25/mL fue la menor en relación a los demás ensayos y al control de comparación, indicando que en este caso, la levadura utilizó gran parte del sustrato para formar biomasa y el remanente lo utiliza para la formación de producto, porque la biomasa producida en este ensayo no tuvo mayor diferencia a la de los demás resultados obtenidos, pero la influencia de esta concentración si se refleja en el sustrato consumido y porcentaje de alcohol producido. De la misma forma, se observa que para los demás tratamientos y control de comparación, la producción de etanol requiere un consumo mayor de sustrato, observando una proporción directa entre estos dos parámetros. 70 Gráfica 9. Consumo total de sustrato y producción total de etanol bajos las diferentes concentración de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo. Por otro lado, en el control negativo, se evidencia que Saccharomyces cerevisiae alcanza un valor de etanol de 0,46 %, considerando que este valor, a pesar de ser muy bajo, es obtenido posiblemente por la fermentación de azúcares liberados por hidrólisis enzimática por acción de alfa y beta amilasas de la cebada, las cuales se encuentran en concentraciones tan bajas que para un proceso productivo no son representativas en relación a la concentración presente en la cebada malteada, sin embargo, como se observa en la grafica 8, la concentración de enzimas presentes en esta cebada tuvo la capacidad de liberar azúcares del almidón para producir este valor de etanol, pero la naturaleza de estos azúcares son diferentes a la glucosa, ya que el valor de azúcares reductores obtenido y el consumo de sustrato, reflejan un comportamiento muy bajo, por lo que la levadura pudo realizar la fermentación a partir de una fuente de carbono diferente a los azúcares cuantificados por el método de Fehling. Con el análisis estadístico se comprobó que existe diferencias significativas entre los cinco tratamientos (p<0,005), (Ver Tabla Anexo 9.6), demostrando que los tratamientos con una concentración de enzimas entre 15 y 20 mL/L, producen 71 mayor concentración de etanol, que en los tratamientos donde se utilizan dosis menores o mayores a estas. 5 3 Etanol (%) 4 3 2 2 1 1 0 5 10 15 20 25 C+ C- Y p/s (g de etanol/g azúcares reductores) 4 0 Dosis de enzima (ml/litro) Gráfica 10. Relación entre la concentración de etanol producido y productividad producto-sustrato en función en función de la concentración de enzimas, (C+) control de comparación y (C-) control negativo. En la Gráfica 10 (Ver Tabla Anexo 9.7) se observa la productividad del proceso, en la cual, la relación de gramo de etanol producido por gramo de azúcar consumido no presenta una diferencia considerable entre ensayos, sin embargo la influencia de las dosis de enzimas si afecta este valor, ya que la producción de etanol depende de la cantidad de azúcar consumido y por ende la concentración de azúcares producidos en la hidrólisis por acción de una determinada concentración de enzimas. Estos resultados concuerdan con lo referenciado por Siqueira et al. (2008) obteniendo resultados donde el porcentaje de etanol generado, por gramo de sustrato consumido en cada ensayo no presenta diferencias considerables. Por lo tanto se concluye que la productividad con mejor comportamiento es para las dosis con 15 y 20 mL/L de enzimas, confirmando los demás resultados presentados donde el desempeño de estas enzimas fue el óptimo para este estudio. Por otro lado, al observar la Gráfica 9 y 10, se evidencia que la mayor concentración de etanol obtenida fue con una concentración de enzimas de 20 mL/L, confirmando a esta 72 como la mejor concentración de alfa y beta amilasas, para la obtención de una alta concentración de azúcares reductores fácilmente asimilables por Saccharomyces cerevisiae. Finalmente, se sometieron a una prueba sensorial los diferentes destilados obtenidos en los diferentes tratamientos con las concentraciones de enzimas, con el fin de determinar una posible alteración en la calidad organoléptica del alcohol obtenido en estos ensayos, determinado que en ninguno de los ensayos se presentó una alteración de sabor y olor, resultado que favorece y respalda la propuesta de este ensayo, como lo es la utilización de enzimas comerciales como alternativa en el proceso de producción en Destilería Premier, teniendo en cuenta también experiencias similares en la destilería que presentaron un producto picante y con deficiente aceptación por el panel de evaluación sensorial. 6.5 COSTOS DE PRODUCCIÓN Chen et al. (2007), reportaron como el costo de las enzimas contribuye significativamente al costo total del proceso de conversión de biomasa, donde la dosis de enzimas debe ser minimizado tanto como sea posible. Teniendo en cuenta esto, las concentraciones empleadas en este estudio se establecieron basándose en las recomendaciones del proveedor, y en un ensayo previo con una dosis de 1 mL/L, dando este último un resultado desfavorable a nivel de hidrólisis y generando un medio muy viscoso para la fermentación. La reducción de los costos de producción son la esencia de la adopción de medidas contundentes en la mejora del proceso manufacturero de la industria de destilería (Kłosowski, 2006), por lo tanto, se calculó el costo de un litro de etanol producido en la destilería para un lote de 10.000 litros, el cual es de 4.428 pesos/litro como resultado de la destilación de un volumen de 1.000 litros de etanol (Ver Anexo 10). Además, se determinó el costo del mismo litro de alcohol, pero empleando una contracción de 20 mL/L de enzimas para un lote de producción de 10.000 litros, dando como resultado que el litro de alcohol tendría una equivalencia de 15.936 pesos/litro de etanol, en base a los resultados obtenidos del presente estudio. Además, la propuesta de este estudio de emplear únicamente cebada nacional como materia prima para el proceso hidrolítico 73 y fermentativo, presenta ventajas como ser 2.500 pesos/kilo más económica que la cebada malteada, asimismo su disposición no requiere un proceso de importación. Teniendo en cuenta lo mencionado anteriormente, se considera que el empleo de las enzimas en una concentración de 20 mL/L como única herramienta hidrolítica sustituyente de la cebada importada, no se favorece a nivel de rentabilidad en el proceso productivo de las destilería. Sin embargo, la utilización de estas enzimas como ayudante en el proceso de hidrólisis, especialmente para la degradación del almidón de cebada sin maltear, favorecería el rendimiento de este proceso y tiempo de producción, además de ser una posible solución a los problemas que en ocasiones se presenta en el proceso productivo en la destilería, a nivel de tiempos muy largos en la hidrólisis del almidón, incremento de la viscosidad, generando apelmazamiento del medio y retraso en la producción, teniendo en cuenta que estas enzimas contribuyeron en la disminución de la viscosidad del medio, de acuerdo con los resultados obtenidos en el proceso hidrolítico (Ver Anexo 5) Por otro lado, en este estudio se demostró que las enzimas empleadas para el proceso amilolítico, realmente degradaron el almidón de la cebada sin maltear, por lo que se podría considerar para futuros estudios el empleo de concentraciones de sustrato mayores, empleando las mismas concentraciones de enzimas de este estudio durante periodos de tiempo más largos y a su vez, concentraciones de enzimas menores tales como las reportadas por Kolusheva y Marinova (2007), las cuales fueron 6, 8, 10, 12 y 14 unidades de enzimas por mL, obteniendo un 30,2 % de rendimiento de hidrólisis, teniendo en cuenta que entre mayor sea el uso de la cebada nacional o sin maltear en el proceso productivo, mayor será el ahorro para la destilería. 74 7. CONCLUSIONES Con la concentración de enzimas propuesta (20 mL de enzimas/L suspensión) se logró mejorar el rendimiento de hidrólisis en un 89,44 % en relación al que se obtiene normalmente en la planta 41.85 %, considerando a esta como la dosis óptima para la etapa hidrolítica del proceso de producción de alcohol cuando se emplea como sustrato cebada sin maltear. Las condiciones de experimentación en el proceso hidrolítico favorecieron la degradación del almidón de cebada, logrando un medio con una temperatura y pH favorable para la actividad de las enzimas, reflejándose en los valores de azúcares reductores obtenidos en todos los tratamientos. Todos los resultados obtenidos en el estudio, muestran que se puede producir etanol a partir de almidón de cebada sin maltear empleando las enzimas Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L, considerando el uso de α y β-amilasas comerciales como una alternativa viable para la degradación del almidón de cebada sin maltear, especialmente cuando se presentan problemas de hidrolisis del almidón de cebada (apelmazamiento) en el proceso de producción, pero la producción del hidrolizado requiriere más estudios de optimización para la obtención de una mayor gran cantidad de azúcares reductores que sean asimilados rápidamente por la levadura y así obtener mayores niveles de producción de etanol. En etapa fermentativa, aumentar la concentración de enzimas de 15 a 20 mL/L ayuda a incrementar la obtención de producto, sin embargo con la dosis de 25 mL/L se presenta el hecho de tener más concentración de células en el medio, generándose más necesidades nutricionales para el mantenimiento de la levadura y menos disponibilidad de sustrato para la producción de alcohol. El empleo concentraciones de enzimas comerciales en el medio de cultivo de reproducción mejora la eficiencia de consumo de sustrato, elimina la fase de adaptación del microorganismo y asegura la rápida obtención 75 de la biomasa máxima a las 48 horas de fermentación dependiendo de la cantidad de enzimas presentes en el medio. El porcentaje de etanol obtenido al final de la fermentación fue de 4,98 % v/v por destilación utilizando a Saccharomyces cerevisiae en hidrolizado de cebada sin maltear con una concentración de enzimas de 20 mL/L, mostrando una productividad de producto en sustrato de 0,0951 g de etanol/ g de azúcares reductores. Las pruebas realizadas mostraron que la ausencia de enzimas en la cebada no malteada, puede ser reemplazada por amilasas comerciales donde el aumento en la concentración de estas se ve reflejado en la obtención de concentraciones mayores de producto, siempre y cuando esta concentración libere los azúcares reductores necesarios para que la levadura pueda generar un buen nivel de etanol La realización de este tipo de trabajos permite entender el proceso de producción de alcohol y por lo tanto saber cómo influyen factores tales como la temperatura y el tiempo de hidrólisis, concentración de azúcares reductores, tiempo de fermentación, concentración de inóculo y por su puesto la concentración de enzimas, obteniéndose así herramientas para solucionar los problemas que se puedan presentar y bases para la optimización del proceso. 76 8. RECOMENDACIONES Es necesario realizar al menos un ensayo de la concentración de enzimas propuestas a nivel piloto en la planta, con el fin de confirmar la correspondencia de los resultados obtenidos en el laboratorio, debido a que los resultados que se obtienen en el proceso industrial son el punto definitivo para considerar a estas enzimas como una alternativa rentable para la empresa, ya que en el laboratorio se trato de simular al máximo el proceso de la destilería, las condiciones ambientales, separación de afrecho, control de temperatura no se llevaron a cabo de forma igual, por lo que los resultados pueden generar variaciones. Realizar el proceso de hidrolítico bajo tiempos de hidrólisis más prolongados, con el fin de poder obtener rendimientos interesantes empleando concentraciones de enzimas inferiores a la sugerida en este estudio. Debido a que en este estudio no se determinó la concentración de azúcares reductores al durante el proceso de hidrólisis, al iniciar la fermentación y en la fermentación, así como también la realización de un seguimiento de la producción de etanol durante toda la fermentación, sería muy valioso continuar con la investigación teniendo en cuenta estos aspectos, puesto que estos factores en la industria de producción de alcohol son puntos de suma importancia que podrían reportar resultados más significativos. Es necesario realizar una cromatografía para conocer el tipo y cantidad de componentes del hidrolizado, para identificar la naturaleza de las fuente nutricionales que puede utilizar Saccharomyces cerevisiae en la fermentación del hidrolizados de cebada. Establecer un procedimiento para la determinación de la actividad enzimática de las enzimas, con el fin de determinar la tasa de reacción de estas a diferentes concentraciones y en presencia del almidón de cebada no malteada. 77 9. 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SOLUCIONES DE TRABAJO (NTC 5146, 2008) 1.1 Solución de glucosa al 0.5% (p/v) • Pesar 0.5 g de glucosa anhidra r.a. • Disolver en agua destilada hasta completar un volumen de 100 mL. 1.2 Solución A de Fehling • Disolver 34.639 g de sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4 .5H2O) en 500 mL de agua destilada. • Dejar en reposo hasta que clarifique. • Filtrar empleando vacio, a través de asbesto o de un filtro Gooch. 1.3 Solución B de Fehling • Disolver 173 g de la sal de Rochelle (tartrato de sodio y potasio) y 50 g de hidróxido de sodio (NaOH) en 500 mL de agua destilada. • Dejar en reposo hasta que clarifique (alrededor de 48 horas). • Filtrar empleando vacio, a través de asbesto o de un filtro. 1.4 Solución indicadora de azul de metileno al 1% • Pesar 1g de azul de metileno. • Disolver en agua destilada hasta completar un volumen de 100 mL. 88 ANEXO 2. DETERMINACIÓN DEL PORCENTAJE DE ALMIDÓN (NTC 5146, 2008) • Pesar 10g de la muestra. • Disolver en agua destilada hasta completar un volumen de 750 mL. • Adicionar 50 mL de HCl. • Poner en reflujo durante 5 horas. • Enfriar y neutralizar a pH 7 con NaOH 40%. • Pasar a balón aforado de 500 mL y completar volumen con agua destilada. • Filtrar si es necesario. • Titular la solución de almidón con Fehling de acuerdo al numeral 5.4.1. • Cálculo: 500 x T % Almidón = V x M T: título de Fehling. V: volumen gastado. M: peso muestra. 89 ANEXO 3. METODO PARA RECUENTO CELULAR EN CÁMARA DE NEWBAUER (Santander, 2006). • Tomar 1mL de la muestra a evaluar y depositarla en un balón aforado de 100 mL. • Agregar agua destilada al balón hasta el enrase, agitar y transferir el contenido a un erlenmeyer de 125 mL. • Alegra al erlenmeyer 2 gotas de azul de metileno al 1% y homogenizar. • Limpiar cuidadosamente la cámara de newbauer y el cubreobjetos. • Colocar el cubreobjetos sobre la cámara de recuento. • Agitar el erlenmeyer con la muestrea. • Con un capilar se toma la muestra del erlenmeyer. • Llevar cuidadosamente la punta del capilar, junto a la unión del cubreobjetos y la cámara de contaje. • Dejar fluir el líquido por capilaridad hasta llenar de muestra el área de conteo. • Evitar la formación de burbujas entre el cubre objetos y la cámara, o derramar muestra fuera de la cámara y que esto es causa de errores del conteo real de células de la muestra. • Si esto ocurre se debe lavar la cámara y reiniciar de nuevo el montaje. • Una vez montada la muestra en la cámara, llevar la cámara al microscopio y enfocar en el área de recuento con el objetivo de 10X. • Una vez enfocada el área de recuento (Cuadro del centro), centrarla y pasarla al objetivo de 40x. • El área utilizada para el recuento corresponde a 1mm2, el recuento se puede hacer de 2 formas: Contando el número de células presentes en los 25 cuadros= 1/9 de la cámara 1 mm2. Contando 1/5 del área de 1 mm2 o sea los cuatro cuadros de los extremos y el cuadro del centro y el número obtenido se multiplica por 5. • Contar el número de células de la forma ya mencionada con ayuda de un contador manual. 90 • En número obtenido corresponde al número de células que hay en un área de 1 mm2. Cálculos: Concentración celular (# de Células x 106/mL)= X * EC*D*F X: # de células en 1 mm3 C: Espesor de la cámara = 10 D: Dilución de la muestra = 100 F: Factor de conversión de mm3 a cm3 = 1000 91 ANEXO 4. TABLAS COMPLEMENTARIAS DEL PROCESO HIDROLÍTICO Tabla4.1 Concentración de azúcares reductores del proceso de hidrólisis. Concentración de enzimas (mL/L) AR (g glucosa/L) Rendimiento de hidrólisis (%) 5 42,6528 63,9792 10 44,8590 67,2884 15 48,1819 72,2728 20 59,1323 88,6984 25 43,3637 65,0455 Control de comparación 37,1689 41,8150 Control Negativo 2,5710 3,8565 92 ANEXO 5. FIGURAS COMPLEMENTARIAS DEL PROCESO HIDROLÍTICO Figura 5.1. (a) Aspecto físico de los ensayos antes de la hidrólisis; (b) después de la hidrólisis. a b 93 Figura 5.2. Reacción de hidrólisis de almidón con yodo. 94 ANEXO 6. TABLAS COMPLEMENTARIAS DE FERMENTACIÓN Tabla 6.1 Datos Curva de crecimiento S. cerevisiae durante el ensayo preliminar. Tiempo (horas) Recuento celular promedio (UFC/mL) Log Recuento celular promedio (UFC/mL) 0 1,08E+06 6,033 6 1,18E+07 7,072 12 1,22E+08 8,086 24 1,30E+09 9,114 36 2,83E+09 9,451 48 2,88E+09 9,458 60 2,28E+09 9,357 72 1,73E+09 9,237 84 8,00E+08 8,902 Tabla 6.2 Datos Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato con 5 mL/L de Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L. Tiempo (Horas) Recuento celular promedio (UFC/mL) Log Recuento celular promedio (UFC/mL) 0 1,08E+07 7,033 12 3,45E+07 7,536 24 6,25E+07 7,796 36 5,75E+08 8,756 48 7,50E+08 8,871 60 7,10E+08 8,851 72 5,50E+08 8,739 84 4,15E+08 8,480 95 Tabla 6.3 Datos Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato con 10 mL/L de Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L. Tiempo (Horas) Recuento celular promedio (UFC/mL) Log Recuento celular promedio (UFC/mL) 0 1,08E+07 7,033 12 4,28E+07 7,630 24 6,05E+07 7,782 36 9,00E+08 8,954 48 1,98E+09 9,295 60 7,25E+08 8,860 72 5,50E+08 8,739 84 8,25E+08 8,916 Tabla 6.4 Datos Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato con 15 mL/L de Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L. Tiempo (Horas) Recuento celular promedio (UFC/mL) Log Recuento celular promedio (UFC/mL) 0 1,08E+07 7,033 12 3,45E+07 7,536 24 6,25E+07 7,796 36 5,75E+08 8,756 48 7,50E+08 8,871 60 7,10E+08 8,851 72 5,50E+08 8,739 84 4,15E+08 8,480 96 Tabla 6.5 Datos Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato con 20 mL/L de Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L. Tiempo (Horas) Recuento celular promedio (UFC/mL) Log Recuento celular promedio (UFC/mL) 0 1,08E+07 7,033 12 6,25E+07 7,536 24 7,63E+07 7,796 36 1,33E+09 8,756 48 2,15E+09 8,871 60 9,00E+08 8,851 72 9,50E+08 8,739 84 1,05E+09 8,480 Tabla 6.6 Datos Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato con 25 mL/L de Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L. Tiempo (Horas) Recuento celular promedio (UFC/mL) Log Recuento celular promedio (UFC/mL) 0 1,08E+07 7,033 12 8,40E+07 7,924 24 9,30E+07 7,968 36 1,68E+09 9,224 48 2,35E+09 9,371 60 9,00E+08 8,954 72 1,03E+09 9,007 84 9,25E+08 8,962 97 Tabla 6.7 Datos Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato de cebada malteada (control de comparación). Tiempo (Horas) Recuento celular promedio (células/mL) Log Recuento celular promedio (células/mL) 0 1,08E+07 7,033 12 1,19E+08 8,074 24 1,29E+08 8,109 36 2,28E+09 9,357 48 2,33E+09 9,366 60 1,98E+09 9,296 72 1,43E+09 9,154 84 1,63E+09 9,211 Tabla 6.8 Datos Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato de cebada no malteada (control negativo). Tiempo (Horas) Recuento celular promedio (UFC/mL) Log Recuento celular promedio (UFC/mL) 0 1,08E+07 7,033 12 2,55E+07 7,405 24 2,88E+07 7,455 36 5,00E+08 8,699 48 7,75E+08 8,889 60 1,50E+08 8,151 72 1,50E+08 8,151 84 1,00E+08 8,000 98 Tabla 6.9 Datos concentración de azúcares reductores y consumo de sustrato Concentración de enzimas (mL/L) Azúcares Reductores Iniciales (g/L) Azúcares Reductores Finales (g/L) Consumo de Sustrato (g/L) 5 42,664 6,5052 36,159 10 44,912 6,6380 38,274 15 48,784 6,4723 42,312 20 59,625 6,2246 53,400 25 43,557 2,4734 41,084 Control de comparación 37,199 2,9914 34,208 Control Negativo 2,571 2,4124 0,159 Tabla 6.10 Datos biomasa máxima y tiempo de biomasa máxima Concentración de enzimas (mL/L) Biomasa máx promedio (UFC/mL) Log Biomasa máx promedio (UFC/mL) Tiempo Biomasa Max promedio 5 7,30E+08 8,9020 54 10 1,98E+09 9,2953 48 15 1,83E+09 9,2609 48 20 2,15E+09 9,3320 48 25 2,35E+09 9,3707 48 Control de comparación 2,33E+09 9,3664 48 Control Negativo 7,75E+08 8,8891 48 99 Tabla 6.11 Datos concentración de etanol y productividad producto/sustrato Concentración de enzimas (mL/L) % OH Yp/s 5 3,015 0,083 10 3,435 0,090 15 4,44 0,107 20 5,02 0,095 25 2,98 0,073 Control de comparación 3,76 0,110 Control Negativo 0,43 3,217 100 ANEXO 7. GRÁFICAS COMPLEMENTARIAS DE FERMENTACIÓN Gráfica 7.1 Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato con 5 mL/L de Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L. 10 Log UFC/ml 8 6 4 2 0 0 12 24 36 48 60 72 84 Tiempo (horas) Gráfica 7.2 Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato con 10 mL/L de Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L. 10 Log UFC/ml 8 6 4 2 0 0 12 24 36 48 Tiempo (horas) 101 60 72 84 Gráfica 7.3 Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato con 15 mL/L de Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L. 9,5 9,0 Log UFC/ml 8,5 8,0 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 0 12 24 36 48 60 72 84 Tiempo (horas) Gráfica 7.4 Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato con 20 mL/L de Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L. 10 Log UFC/ml 8 6 4 2 0 0 12 24 36 48 Tiempo (horas) 102 60 72 84 Gráfica 7.5 Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato con 25 mL/L de Multifect® AA 21L y Multifect® AA 23L. 10 Log UFC/ml 8 6 4 2 0 0 12 24 36 48 60 72 84 Tiempo (horas) Gráfica 7.6 Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato de cebada malteada (control de comparación). 10 Log UFC/ml 9 8 7 6 5 0 12 24 36 48 Tiempo (horas) 103 60 72 84 Gráfica 7.7 Curva de crecimiento S. cerevisiae en sustrato de cebada no malteada (control negativo). 10 Log UFC/ml 8 6 4 2 0 0 12 24 36 48 Tiempo (horas) 104 60 72 84 ANEXO 8. FIGURAS COMPLEMENTARIAS DEL PROCESO FERMENTATIVO Figura 8.1. Sistema de incubación del crecimiento y fermentación de Saccharomyces cerevisiae. 105 ANEXO 9. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Tabla 9.1. Resultados del análisis de varianza (ANOVA) Tabla 9.2 Resultados del analisis estadistico para la concentración de azúcares reductores. 106 Tabla 9.3 Resultados del analisis estadistico para Biomasa Tabla 9.4 Resultados del analisis estadistico para el tiempo de biomasa máxima Tabla 9.5 esultados del analisis estadistico del Consumo de sustrato 107 Tabla 9.6 Resultados del analisis estadistico para la concentración de etanol Tabla 9.7 Resultados del analisis estadistico de la productividad YP/S 108 ANEXO 10. COSTOS DE PRODUCCIÓN Tabla 10.1. Cálculos de los costos de etanol sin enzimas comerciales. Materia Prima Carge Valor para Presentación Total 10.000L (Kilo) (Pesos) (Kilos) Costo Costo Etanol Litro lote para Producido OH 10.000L (Litros) (Pesos) (Pesos) Cebada Nacional 1 1.000 600 600.000 Cabada Importada 1 3.500 600 2.100.000 Azúcar 50 72.000 1.200 1.728.000 1.000 4.428 Tabla 10.2. Cálculos de los costos de etanol con enzimas comerciales. Valor 20 Valor mL de Presentación Total Enzima enzimas (Litros) (Pesos) (Pesos) Costo de OH Costo enzimas OH producido litro de para un producido para alcohol lote de (%) 10.000L (Pesos) 10.000 (litros) Multifect AA 21L 1 8.000.000 Multifect AA 23L 1 40.000 800 5,02 40.000 800 8.000.000 109 502 15.936 ANEXO 11. FICHA TÉCNICA Multifect® AA 21L 110 111 ANEXO 12. FICHA TÉCNICA Multifect® AA 23L 112 113 ANEXO 13. FICHA TÉCNICA Saccharomyces cerevisiae 114