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Estación de Viticultura e Enoloxía de Galicia • Microorganismos en la industria enológica y su relación con la calidad del vino Pilar Blanco Camba Las levaduras y el vino CARACTERÍSTICAS GENERALES •Hongos microscópicos unicelulares •Células eucariotas •Morfología variada: esféricas, elípticas , ovaladas, alargadas, apiculadas •Reproducción vegetativa o asexual por gemación (algunas por bipartición) •Reproducción sexual. Formación de esporas •Responsables de la fermentación alcohólica (transformación de azúcar en alcohol +CO2) •Alteraciones (flor, refermentaciones) Organización de una célula procariota (A) y eucariota (B) A B Principales levaduras vínicas Nombre: Saccharomyces cerevisiae Características: •Morfología elípticas u ovoides •Alta capacidad fermentativa •Formadora de esporas (ascosporas con 4 esporas) •No asimila nitratos ni escinde arbutina •Crecimiento en presencia de etanol •Fermenta y asimila glucosa, galactosa, maltosa, sacarosa y rafinosa. •No fermenta ni asimila lactosa Principales levaduras vínicas Nombre: Kloeckera apiculata Hanseniaspora guillermondii •Morfología: apiculadas (forma de limón) •Aparece al inicio de la fermentación •Fermenta la glucosa •Bajo poder fermentativo (4%) •Fuerte producción de ácidos volátiles •No esporula (Hanseniaspora si esporula) •No asimila nitratos •No escinde la arbutina Principales levaduras vínicas Nombre: Metschnikowia pulcherrima •Morfología: células ovoides aisladas o en parejas. A veces células grandes con un grueso gránulo central de grasa. •Fermenta la glucosa •Bajo poder fermentativo (1%) •No asimila nitratos •Escinde la arbutina •Crece bien en presencia de alcohol •No esporula •En placa colonias blancas, brillantes con ligera coloración rojiza Principales levaduras vínicas Nombre: Schizosaccharomyces pombe •Morfología : Células alargada o cilíndricas aisladas o en parejas (3-5 X 6-16) µm •División por fisión •Esporulada •No asimila nitratos ni escinde la arbutina •Buena capacidad fermentativa •Capacidad para degradar ácido málico a etanol y CO2 (fermentación maloalcohólica) Otras levaduras vínicas Brettanomyces Torulaspora Cryptococcus Debaryomyces hansenii Rhodotorula Levaduras formadoras de velo •Saccharomyces (flor) •Candida •Pichia •Hansénula •Zygosaccharomyces Debaryomyces hansenii Requerimientos nutricionales de las levaduras •Fuente de carbono: azúcares •Fuente de nitrógeno •Sustancias minerales •Factores de crecimiento (vitaminas) El mosto reúne los requisitos adecuados para el desarrollo de las levaduras (Excepciones: maduración inadecuada, el ataque por botritisfalta de nitrógeno, etc). pH ácido-impide el desarrollo de muchas bacterias Origen de las levaduras de vinificación Uva (flora epifítica) Material de bodega Inóculo (LSA) Sucesión de la población de levaduras a lo largo de la fermentación Fase inicial Fase tumultuosa Saccharomyces invade el medio, acaba dominando la fermentación y desaparecen las levaduras de la fase inicial Fase final Predominio de especies del género Saccharomyces. Produce más alcohol y menos productos secundarios Albariño 1150 1100 Densidad Predominio de levaduras apiculadas y de otras morfologías con baja producción de alcohol y elevada producción de ácidos volátiles (acético) Ex: Kloeckera apiculata, Metschnikowia pulcherrima, Candida sp,etc. 1050 1000 950 900 1 3 5 7 9 11 13 15 Tiempo (días) Evolución de la población de levaduras viables durante la fermentación 10,00 9,00 Fase tumultuosa: 107-108 Fase final: 105 8,00 Log NLV Fase inicial : 104-105 7,00 6,00 5,00 4,00 0 5 10 Tiempo (días) 15 La fermentación alcohólica Glucosa Glucolisis Acido pirúvico Piruvato descarboxilasa CO2 Acetaldehido NADH2 Alcohol deshidrogenasa NAD+ Etanol Fermentación alcohólica: Influencia del temperatura y O2 Rango de Temperatura para fermentación en blancos: 14-20ºC Rango para fermentación en tintos: 25-30ºC Temperatura crítica >35ºC TREIXADURA Densidad 1120 1100 1080 nTT16 1060 nTT22 nTT19 1040 1020 1000 980 0 10 20 Tiempo (Días) O2: Las levaduras requieren O2 para su multiplicación ya que interviene en la síntesis de AG y esteroles, constituyentes de la membrana celular y responsables de su permeabilidad (práctica de remontado) Productos secundarios originados durante la fermentación alcohólica •Glicerina – suavidad y aterciopelado Fermentación gliceropirúvica glucosa Glicerina + pirúvico •Succínico- es el ácido que más impresiona el gusto (sabor a bebida fermentada, entre salado y amargo) •Ácidos orgánicos (málico, cítrico, láctico, ácidos volátiles • Acético y su éster, acetato de etilo- producido por las levaduras de la 1ª fase y levaduras oxidativas. Efecto negativo sobre el vino •Metabolitos del ciclo diacetilo-acetoínico (a concentraciones elevadas son negativos) BACTERIAS LÁCTICAS •Gram +, catalasa -, no esporuladas, no móviles •División por bipartición •Microaerófilas o anaerobias facultativas y fermentadoras de azúcares •Morfología: cocos y bacilos •Según el metabolismo de la glucosa pueden ser: -Homofermentativas- ác. láctico -Heterofermentativas-ác. láctico, acético, CO2 , etanol, acetaldehido, acetoína, diacetilo,etc •Responsables de la fermentación maloláctica •Bajo ciertas condiciones pueden causar alteraciones •Metabolismo de aminoacidos-origina sustancias peligrosas para la salud Oenococcus oeni BACTERIAS LÁCTICAS aldolasa Metabolismo homofermentativo de la glucosa (vía glucolítica de Embden-Meyerhof) BACTERIAS LÁCTICAS Metabolismo heterofermentativo de la glucosa (ruta de Warburg-Dickens) Clasificación de las bacterias lácticas Forma Género Metabolismo de la glucosa Especies Cocos Pediococcus Homofermentativos P. damnosus P. pentosaceous Leuconostoc Heterofermentativos L. oeni (O.oeni) L. mesenteroides (ssp. mesenteroides) Bacilos Lactobacillus I. Homofermentativos estrictos No descritas en vino (No fermentan pentosas Glucosa- 2 ác. Láctico) II. Heterofermentativ. facultativos (Fermenta las pentosas y la glucosa) L. casei L. plantarum II. Heterofermentativ. obligatorios (No poseen el enzima aldolasa, fermentan la glucosa mediante la vía de las pentosa fosfato) L. brevis L. hilgardii Características de los principales géneros de bacterias lácticas Característica Leuconostoc Pediococcus Lactobacillus Morfología de las células Esféricas o un poco alargadas En pares o en cadenas Esféricas División en dos planos-tétradas Alargadas en pares e en cadenas Tamaño 0,5-0,7 µm ø 1-2 µm ø 0,5-1,2 X 1,0-10 µm Metabolismo de CO2, láctico, la glucosa etanol DL ó L láctico No carbónico láctico, etanol, acético, CO2 Hidrólisis de la arginina Algunas cepas No No (G+C)% 38-44% 34-42% 36-47% Pared celular Sin ácido teicoico Sin ácido teicoico Algunas sp contienen ácidos teicoicos BACTERIAS LÁCTICAS: ecología Origen •Uva •Material de bodega •Inóculo (Cultivos iniciadores de Oenococcus oeni. Se trata de cultivos puros o mezclas de 2-3 cepas) Evolución durante la fermentación •En uva- población muy baja •Mosto- 102-104 UCF/ml. Disminuyen por proliferación de las levaduras durante la fermentación alcohólica •Fase final – Empieza a aumentar la población de bacterias lácticas (lisis de las levaduras), desaparecen los bacilos homofermentativos, luego los heterofermentativos y acaba predominando O. oeni, mejor adaptado a las condiciones de bajo pH y elevada concentración de etanol •La fermentación maloláctica se inicia cuando las UFC/ml= 106 FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA Málico Láctico + CO2 Enzima maloláctica (Bacterias lácticas) Repercusiones en el vino •Desadificación biológica del vino •Disminuye la acidez total y el málico (sabor astringente) •Aumenta el ácido láctico (suavidad) •Protege al vino de las enfermedades por bacterias lácticas •Otras: Producción de diacetilo (aroma a “mantequilla”) •A bajas concentraciones –bouquet •A elevadas concentraciones - rancio Posibles rutas del ácido málico BACTERIAS LÁCTICAS: fermentaciçón maloláctica Factores que influyen en la fermentación maloláctica •Características de la variedad (relación tartárico/málico), residuos fitosanitarios •pH del medio (Actúan mejor a pH> 3.5; Tª óptima 4.2-4.5). El pH condiciona el crecimiento bacteriano y los sustratos que van a metabolizar (*enfermedades del vino). A mayor pH mayor facilidad para que se desarrolle la FML pero también mayor peligro de que aparezcan enfermedades. •temperatura (19-25º) •Aireación (la presencia de una pequeña proporción de O2 es favorable) •Etanol (< 13%) •SO2 (no superior a 50 mg/L) •Prácticas de vinificación (El tiempo de contacto del vino con los hollejos, contacto con las lías, trasiegos, etc. determinan la población de bacterias lácticas al final de la fermentación alcohólica) •Interacción de las bacterias con otros microorganismos BACTERIAS LÁCTICAS: fermentaciçón maloláctica Aplicación de la fermentación maloláctica •En tintos Mejora gustativa Color menos rojo vivo Aroma evolucionado (menos a uva y más a vinosidad) •En blancos Puede ser deseable: •Repercute en el equilibrio grado/acidez •Disminuye la sensación de dureza y verdor •Peligroso en vino dulce BACTERIAS LÁCTICAS: fermentaciçón maloláctica Ventajas e inconvenientes de la fermentación maloláctica Ventajas Inconvenientes Reducción de la acidez y suavización organoléptica Reducción del color Garantía de estabilidad Reducción de aromas varietales Incremento aromático Incremento de acidez volátil Reducción de amargor y astringencia Aparición de olores y sabores anómalos Mayor complejidad y atributos de envejecimiento Formación de aminas biógenas y carbamato de etilo Metabolismo del cítrico Bacterias acéticas •Gram negativas, Catalasa positivas, no esporuladas . •Morfología variable (células elípticas o con forma de bastón corto agrupadas en pares o en cadenas) •Tamaño: 0.6-0.8 x 1-4 µm •Inmóviles o móviles por flagelos: ¾ polares (G. Gluconobacter) ¾ peritricos (G. Acetobacter) •Aerobias estrictas*(sobrevive en barrica) •Oxidan el alcohol a ácido acético e incluso a CO2 y H2O •Producción de polisacáridos extracelulares filtrabilidad del vino) y pigmentos (celulosa-afecta la •Tolerancia a la acidez, al etanol y moderada al SO2 • Formación de velo •En el vino pueden dar lugar al picado acético y su desarrollo es indeseable en todas las etapas de vinificación Bacterias acéticas ECOLOGÍA DE LAS BACTERIAS ACÉTICAS •Muy extendidas en la naturaleza, especialmente en bebidas fermentadas alcohólicas como el vino, la cerveza o la sidra •En uva la población de bacterias acéticas depende del estado sanitario de la vendimia. ¾En uva sana: 102-103 UFC/mL (G. oxydans) ¾En uva atacada por Botrytis: 105-106 (mezcla de Guconobacter y Acetobacter) •Durante la fermentación alcohólica la adición de sulfuroso y el desarrollo de las levaduras no afecta la población de bacterias acéticas. Existe una sucesión de bacterias acéticas: G. oxydans predomina al inicio y va siendo reemplazado por A. pasteurianus y A. aceti. •Durante la fermentación maloláctica se mantiene la población •Durante la conservación la población de bacterias acéticas puede aumentar y causar enfermedades. Clasificación de las bacterias acéticas Característica Gluconobacter Acetobacter polar peritrica Crecimiento a pH 4.5 + + Oxidación de etanol a acético + + Oxidación de acético hasta CO2 - + (G+C)% 56-64 53-65 Especies G. oxydans A. aceti A. pasteurianus A. liquefaciens A. hansenii Flagelación Metabolismo de las bacterias acéticas •Oxidación del etanol a ácido acético (Gluconobacter y Acetobacter) etanol acetaldehido Ácido acético Aldehido deshidrogenasa Alcohol deshidrogenasa •Oxidación del ácido acético a CO2 (Acetobacter) Ácido acético CO2+H2O TCA *Gluconobacter carece de algunos enzimas del TCA, la α-cetoglutarato deshidrogenasa y la succinato deshidrogenasa Metabolismo de las bacterias acéticas •Metabolismo de los azúcares ¾Oxidación de los azúcares vía hexosas monofosfato ¾Oxidación de azúcares a cetonas Glucosa – ácido 2-5 dicetoglucónico Fructosa-cetofructosa Xylosa-cetoxylosa •Metabolismo del ácido láctico ¾Oxidación a pirúvico, acetaldehido y acético •Metabolismo del glicerol ¾Oxidación a dihidroxiacetona ALTERACIONES DEL VINO DE ORIGEN MICROBIANO •Introducción •Alteraciones microbianas ¾Bacterias lácticas Picado láctico Amargor Vuelta Grasa o ahilado ¾Bacterias del ácido acético: Picado acético ¾Levaduras Flor Refermentaciones Brettanomyces •Sustancias tóxicas de origen microbiano INTRODUCCIÓN •Las alteraciones microbianas del vino pueden aparecer durante la elaboración y/o durante la conservación del vino • Se producen por el ataque de componentes del vino y/o formación de sustancias indeseables •Evidencias: Turbidez, Gas, Transformación del color •Factores a favor: Composición del vino (ácidos orgánicos, azúcares, factores de crecimiento y sales minerales) •Factores en contra: Grado alcohólico elevado pH bajo Baja temperatura Las bacterias lácticas Producen alteraciones graves porque atacan la totalidad de la masa del vino aunque haya sido bien elaborado Microaerófilos o anaerobios facultativos Importancia de la higiene en la bodega Alteraciones producidas Picado láctico- fermentación de azúcares residuales Amargor- fermentación del glicerol Vuelta – fermentación del tartárico Grasa o ahilado –formación de polisacáridos en el vino Bacterias lácticas: PICADO LÁCTICO PICADO LÁCTICO •Fermentación de azúcares residuales con formación de acético y láctico •Puede aparecer en vinos con azúcares residuales por cese de la fermentación alcohólica (Ex. Por altas temperaturas) •Efecto en el vino: sabor agridulce (por el acético y el azúcar) y aumento de la acidez volátil •También tiene lugar la fermentación manítica – formación de manitol a partir de fructosa (Vuelta manítica) • Prevenir las paradas fermentativas y envasado apropiado, sulfitado racional control de la temperatura Bacterias lácticas: AMARGOR AMARGOR •Fermentación del glicerol formando lactico, acético, ácidos grasos y acroleína (reacciona con compuestos fenólicos como los taninos dando sabores amargos) •Efecto en el vino: sabor amargo •Muy rara, aparece e casos de mala cosecha •Afecta a vinos con poco grado y pH bajo (3.2-3.3); La fermentación de tartárico (vuelta) afecta a vinos de pH alto (3.5-3.3) Bacterias lácticas: VUELTA VUELTA • Origen: Fermentación del ácido tartárico para dar láctico, acético y CO2 •Efecto en el vino: No apto para el consumo Disminuye la acidez fija y aumenta la acidez volátil y el pH Pierde sabor (insípido, flojo) Color apagado Turbidez Formación de gas, vino con “aguja” “olor a ratón” (vuelta + otras causas-formación de 2acetiltetrahidroxipìridina ) •Ataca a vinos poco ácidos, los mejores vinos son los más propensos •No suele darse. Bacterias lácticas: GRASA GRASA O AHILADO •Causa: formación de polisacáridos en el vino que le dan aspecto oleoso. •Efectos en el vino: aspecto de aceite, vino pesado que se desliza sin ruido. La acidez volátil no siempre es elevada. •Peligro: puede ir seguido de otras alteraciones •Prevención: empleo racional de sulfuroso que no impida la Fermentación Maloláctica pero sí la formación de grasa •Corrección: con sulfuroso y agitado Bacterias lácticas: Otras alteraciones Alteración Causa Olor a mantequilla Producción de diacetilo a partir del cítrico o del piruvato Olor a ratón Formación de 2-acetil-tetrahidropiridina Olor a geranio Formación de 2-etoxi-3,5-hexadieno a partir del ácido sórbico Formación de aminas biógenas Metabolismo de los aminoácidos del mosto Formación de carbamato de etilo Metabolismo de la arginina Bacterias acéticas: PICADO ACÉTICO PICADO ACÉTICO O AVINAGRAMIENTO •Oxidación del alcohol a ácido acético- Necesitan O2 •Causado por las bacterias acéticas o del vinagre que constituyen parte de la microflora de la uva y pernanecen durante todo el procesado. Desaparecen tras el embotellado por las condiciones de anaerobiosis •Picado- inicio del proceso , solo afecta a las capas superficiales •Avinagramiento- afecta a más volumen •Efecto en el vino: En cata- olor a acetaldehido Enturbiamento y formación de velo Aumento de la acidez volátil (Máxima permitida 0,65 g/L) Producen acético (retrogusto, final de boca áspero y agrio) y acetato de etilo (indicativo de mala calidad) Bacterias acéticas: PICADO ACÉTICO •Enfermedad muy corriente, perjudicial y difícil de corregir •Prevención: Relleno de los depósitos y cierre hermético Evitar trasiegos en períodos cálidos (la elevada temperatura aumenta la probabilidad de picado acético) Sulfitado a dosis adecuadas (25-30 mg/l) Higiene de la bodega y los depósitos •Aparece con mayor frecuencia en uvas atacadas con Botritis LEVADURAS: Flor FLOR •Enmohecimiento de la superficie del vino, velo •Causado por levaduras que requieren O2 ¾Candida mycoderma ¾Pichia membranifaciens ¾Hansenula anómala ¾Zygosaccharomyces •Crecen en vino con alcohol < 13º y no tienen capacidad fermentativa •Saccharomyces-”flor” útil para crianza biológica de los vinos •Diferenciación: morfología al microscopio, aspecto del velo, capacidad fermentativa LEVADURAS: Flor Característica Levaduras de velo Saccharomyces “Flor” Observación a microscopio (forma y agrupación) Células cilíndricas, alargadas. A veces forman cadenas ramificadas Células elípticas-ovoides En parejas o flóculos Aspecto del velo Velo delgado, blanco o grisaceo, liso o poco plegado Velo grueso, color crema y rugoso Capacidad fermentativa Nula o muy baja. En mosto Buena. En mosto dan forman velo turbidez y carbónico LEVADURAS: Flor •Efectos en el vino: 9 Disminuye la acidez fija y volátil 9 Disminuye el alcohol 9en caso exagerado da lugar a un sabor soso u acuoso del vino y origina turbidez • La aparición de “flor” no es grave •Recomendaciones para su prevención: ¾Filtración amicróbica ¾Cerrar bien los depósitos ¾Sulfitado adecuado LEVADURAS: Refermentaciones Refermentaciones • Provocan enturbiamiento y formación de gas •No se forma velo •Causadas por Saccharomyces, vía anaerobia •Ocurren cuando hay azúcares residuales (<2 g/L) •Control microbiológico: observación directa a microscopio •En vinos con pocos azúcares residuales puede aparecer sedimentos en el fondo de la botella. Metabolismo de otros componentes del vino. LEVADURAS: Brettanomyces Brettanomyces (forma asexual)/Dekkera (esporógena) •Frecuente en barrica y vinos de crianza (rara en uva y fermentación) •Se desarrolla en vinos de elevado grado alcohólico con o sin azúcares •Especie más frecuente: Brettanomyces bruxellensis •Origina fenoles volátiles p-cumárico 4-vinil-fenol descarboxilasa p-ferúlico *VRP-vinil fenol reductasa 4-etil-fenol VPR 4-vinil-guayacol 4-etil-guayacol LEVADURAS: Brettanomyces •Afecta las características organoléptica del vino •Defectos causados por Brettanomyces: ¾Olores fenólicos (cuero, sudor de caballo) *Debido al metabolismo de bacterias y levaduras 4-etil-fenol: bajo contenido- complejidad Alto contenido-defecto ¾Gusto a ratón (más raro)- derivados de la tetrahidropirina. *También originados por bacterias lácticas Lactobacillus y Pediococcus ¾Producción de aminas biógenas •Puede causar acidez volátil elevada •Prevención: limpieza y desinfección de las barricas Sustancias tóxicas de origen microbiano Origen de sustancias tóxicas en el vino •Contaminantes (fungicidas, pesticidas, etc) •Aditivos (SO2) •Metabolismo microbiano ¾Etanol ¾Metanol ¾Aminas biógenas (descarboxilación de aminoácidos) ¾Carbamato de etilo (Metabolismo de la arginina) ¾Ocratoxina A •Peligrosas para la salud humana Aminas biógenas •Se originan por descarboxilación de los aminoácidos •Principales aminas biógenas en el vino: ¾Histidina-Histamina ¾Ornitina-Putrescina (diaminobutano) ¾Tirosina-Tiramina ¾Etilamina ¾Feniletilamina ¾Cadaverina •Origen de las aminas biógenas: 9Bacterias lácticas 9Levaduras Aminas biógenas Efectos sobre la salud: •Dolor de cabeza •Problemas respiratorios •Problemas de corazón (Palpitaciones) •Hipertensión, hipotensión •Cuadros de alergia La sensibilidad a estos compuestos depende de cada individuo y puede alterarse con el consumo de alcohol y/o drogas. La histamina es la más tóxica. Aminas biógenas: papel de las bacterias lácticas •Histamina, tiramina y putrescina son las principales aminas biógenas presentes en el vino. •Baja concentración después de la F. Alcohólica •El contenido aumenta durante la FML •El contenido de aminas en vino varía de unas zonas a otras •Depende de la microflora (varía con la cepa bacteriana) y de la presencia de aminoácidos en el vino (composición del mosto, metabolismo levaduras, prácticas enológicas-contacto con las lías) •La microflora es más compleja cuanto más alto es el pH •Pedioccocus, Oenoccocus, Lactobacillus , •La descarboxilación de aminoácidos tiene lugar en condiciones de estrés, como vía alternativa para obtención de energía Carbamato de etilo • Se forma en el vino por reacción entre: Etanol+compuesto carbamílico • El precursor en el vino es la urea que procede del metabolismo de la arginina, relacionado con la actividad arginasa de las cepas de levaduras que conducen la fermentación. Las bacterias lácticas también degradan la arginina • También se forma urea a partir de la degradación de ácidos nucleicos o de componentes de la uva Prevención ¾ Limitar el contenido de nitrógeno en los mostos (evitar abonos nitrogenados y terrenos muy fértiles) ¾ Limitar activadores de fermentación y controlar las levaduras utilizadas ¾ Control de la temperatura durante las fermentaciones ¾ Eliminación de la urea con ureasa ácida ¾ Baja acidez y alta temperatura inducen aumento de carbamato de etilo Alteraciones causadas por mohos •Los mohos atacan el grano de uva, especialmente durante la maduración •Botrytis cinerea, Penicillium, Aspergillus, Mucor, Cladosporium, otros •Efectos causados en el mosto y/o vino: 9Reducción de la cosecha 9Afecta el contenido de nitrógeno Aspergillus niger 9Presencia de enzimas como la lacasa (oxidasas)-quiebra oxidásica 9Alteraciones organolépticas 9Afecta la estabilidad fisico-química del vino 9Olor y sabor a moho Penicillium citroviride Ocratoxina A •Micotoxina producida por sp de Aspergillus y Penicillium (A. ochraceous, P. verrucosum, A. carbonarum) •Efectos sobre la salud: Persistencia en sangre- 35 días 9Nefrotóxico 9Cancerígeno (Grupo 2B-IARC “International Agency for Research on Cancer” •Nivel tolerado establecido OMS: 100 ng/Kg peso y semana (1995); 5 ng/Kg dia (1998). •Contenido máximo en vinos para el 2005 (2µg/L). (Propuesto en la 82 asamblea de la OIV) •Detección : ELISA ó HPLC •Incidencia: ¾ Mayor en los países calidos, mediterráneos que en zonas frías ¾Mayor en vinos tintos que blancos Ocratoxina A Presencia de Ocratoxina A en mostos y vino AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS EN ENOLOGÍA •Toma de muestras •Tratamiento de las muestras •Siembra en medios de cultivo adecuados •Recuento de células viables •Aislamiento de microorganismos en cultivo puro •Identificación de los microorganismos aislados Controles microbiológicos: Toma de muestras •Viña (de uva, suelo, madera...) •Bodega (suelo, paredes, material de bodega, agua...) •Mosto (antes y después de sulfitar) •Fermentación (diariamente o en las distintas fases) •Vino (después de la estabilización, clarificación, filtrado, embotellado...) NOTA: Utilizar un recipiente estéril y manipular todo lo más asépticamente posible Tratamiento de las muestras •Uva-Incubación en medio líquido apropiado durante 1h y siembra en placa para el recuento de células •Mosto- Recuento al microscopio y cálculo de la dilución adecuada para siembra en placa y recuento de células •Muestras de fermentación-Recuento, dilución apropiada y siembra •Vino-filtración Recuento del nº de células viables por mL Medios de cultivo •Generales (YEPD, Agar mosto, WL) •Selectivos- suplementados con compuestos que inhiben el crecimiento de los distintos grupos microbiano ¾Bacterias-antibióticos como el cloranfenicol ¾Bacterias lácticas- estreptomicina, penicilina, nisina ¾Levaduras-cicloheximida, pimaricina ¾ Hongos- propionato sódico •Microorganismos viables, no cultivables (Seguimiento mediante microscopía con epifluorescencia) •Conservación de las cepas (a -80ºC) ¾Bacterias: (medio de cultivo+ 40% glicerol) ¾Levaduras: YEPD+15% glicerol Aislamiento de levaduras Toma de muestras • Uva • Mosto (sulfitado y sin sulfitar) • Fermentación – Fase inicial – Fase tumultuosa – Fase lenta o final Recuento y dilución adecuada de la muestra Siembra en un medio de cultivo (suplementado con un inhibidor de crecimiento bacteriano y de hongos) – – – – YEPD Agar malta Agar Mosto WL nutrient agar Aislamiento en cultivo puro y conservación – Aislamiento: YEPD // Conservación: YEPD+15% glicerol Identificación de levaduras •Pruebas de identificación: •Morfológicas (en placa, medio líquido y al microscopio) •Esporulación •Fisiológicas y Bioquímicas (dependen del estado fisiológico y del medio de cultivo) 9Asimilación y fermentación de azúcares 9Asimilación de compuestos nitrogenados 9Producción de enzimas 9Requerimiento de factores de crecimiento 9Resistencia a cicloheximida,etc Identificación de levaduras Pruebas de biología molecular: •Análisis del cariotipo •Análisis de DNA mitocondrial •Secuenciación y análisis de restricción del rDNA •PCR Métodos rápidos de detección y cuantificación: (Especialmente útiles para microorganismos de crecimiento lento o para células viables pero no cultivables) •Bioluminiscencia: (actividad metabólica; Ex. luciferasa) •Epifluorescencia: (tinción con un colorante fluorescente, Ex. Naranja de acridina) •PCR a tiempo real: seguimiento de mRNA mediante RTPCR •Hibridación in situ con sondas específicas marcadas con un fluorocromo Análisis del cariotipo •Mediante electroforesis de campo pulsante •Detecta polimorfismo del DNA genómico •Diferenciación entre especies y cepas, mediante diferencias de número y tamaño de los cromosomas (S. cerevisiae- 16 cromosomas de tamaño entre 250 y 2500 Kpb) •Equipamiento específico, costoso y largo •Requiere personal especializado y cepas aisladas •Más discriminante que la técnica de PCR y DNA mitocondrial Schuller et al. 2003 Análisis del DNA mitocondrial •Análisis del polimorfismo del DNA mitocondrial (muy polimorfo y estable) •Requiere poca infraestructura de laboratorio •Relativamente rápida y económica •Diferenciación entre especies •Diferenciación entre cepas de S. cerevisiae •Requiere cepas aisladas y personal especializado EVEGA 2004 Análisis de restricción del rDNA •Implica la comparación de secuencias de genes que codifican el rRNA y de los espaciadores entre ellos (ITS ¾Comparación de secuencias ¾Comparación de fragmentos de restricción (PCR-RFLP) •Requiere previa amplificación mediante PCR PCR •Amplificación de secuencias específicas utilizando un termociclador •Equipamiento costoso, personal especializado •Técnica rápida que permite actuar en caso de necesidad •Seguimiento de implantación de levaduras inoculadas en fermentación (Permite diferenciar LSA) Schuller etal. 2003 •RAPDs- amplificación de regiones genomicas al azar utilizando primers cortos e inespecíficos (poco reproducible) •ITS •Amplificación de secuencias delta- flanquean el retrotransposón Ty Aislamiento e identificación de Brettanomyces •Filtración de la muestra •Siembra en un medio específico (crecimiento lento, en medios convencionales las otras levaduras crecen más rápido) ¾Medio DBDM ¾Crecimiento 25º C, 2 semanas •Identificación : métodos convencionales •Métodos moleculares: PCR, hibridación in situ con fluorescencia, PCR a tiempo real Aislamiento e identificación de bacterias acéticas •Medios de cultivo •Suplementados con inhibidor del crecimiento de levaduras y de bacterias lácticas ¾ WL+ 2% etanol (ó 10% de vino estéril). Colonias color verde ¾GYC (Glucosa 5%, extracto de levadura 1%, , CaCO3 3%, agar %) ¾Mannitol medium (manitol 2,5%, extracto de levadura 1%, agar 1,5%) ¾MRS + 2% etanol •Temperatura de incubación: 25-28º C (5-7 días) •Condiciones aeróbicas Aislamiento e identificación de bacterias acéticas •Pruebas de identificación ¾Gram +, Catalasa – ¾Oxidación del etanol, glicerol y lactato ¾Formación de compuestos cetónicos ¾Crecimiento en acetato sódico o etanol como única fuente de carbono ¾Crecimiento en dulcitol ¾Producción de pigmentos marrones en GYC ¾Producción de celulosa (filtrabilidad del vino) •Métodos moleculares (PCR y secuenciación de rRNA 16S) Aislamiento e identificación de bacterias lácticas AISLAMIENTO • Medios de Cultivo 9 AGB (acidic grape broth, pH4,8) (O. oeni) 9 MRS • • • • Incubación en estufa de anerobiosis Temperatura y tiempo de incubación. 30º durante 48 h Pruebas de Identificación – Gram + – Morfología (coco o bacilo) – Homofermentativa o heterofermentativa – Fermentación de azúcares – Crecimiento en determinadas condiciones de pH, Tª Técnicas moleculares –PCR específica (primers del gen-enzima maloláctica) (O. oeni) Aislamiento e identificación de bacterias lácticas Características identificativas de Oenoccocus oeni Control microbiológico de vinos embotellados Filtración de una cantidad de vino conocida utilizando un sistema adecuado Colocación de la membrana en un medio de cultivo adecuado Crecimiento a temperatura adecuada Recuento de microorganismos viables presentes en la muestras Identificación de los microorganismos encontrados Evaluación del riesgo Como prevenir las enfermedades microbianas de los vinos •Mantener unas condiciones higiénicas adecuadas en la bodega •Procurar que la uva entre en buenas condiciones •Evitar paradas fermentativas procurando obtener vinos con una concentración de azúcar < 2g/l •Sulfitado adecuado (25-30 mg/L) •Conservación adecuada: Mantener los depósitos llenos y cerrados y a baja temperatura •Filtración amicróbica de los vinos antes del embotellado Selección de levaduras y bacterias en enología • Papel en la calidad del vino • Bacterias ¾ Criterios de selección ¾ Uso de bacterias seleccionadas • Levaduras ¾ Criterios de selección ¾ Levaduras seleccionadas ¾ Levaduras autóctonas: ventajas e inconvenientes Selección de bacterias Características deseables para cultivos iniciadores de bacterias lácticas •Elevada degradación de ácido L-málico •Resistencia a grado alcohólico elevado (en torno al 15%) •Resistencia a SO2 (a concentración 50 mg/L) •Capacidad de crecimiento a bajo pH (Resistencia a la acidez) •Capacidad de crecimiento a bajas temperaturas •Baja producción de acidez volátil •Buenas propiedades organolépticas (ausencia de caracteres sensoriales -) •Metabolismo limitado de azúcares •Resistencia al ataque de bacteriofagos •No producción de polisacáridos extracelulares •No producción de compuestos tóxicos (Ej: aminas biógenas) •Fácil obtención de biomasa y resistencia a los procesos de congelación y liofilización Selección de bacterias Obtención de cultivos iniciadores de bacterias Obtención de biomasa, centrifugado y liofilización Utilización de bacterias comerciales Siembra directa o con rehidratación y/o reactivación previa Control de calidad de las cepas comerciales •Caracterización de la especie •Viabilidad (UFC/g) •Determinación de la actividad maloláctica •Verificación de la ausencia de contaminantes (coliformes, estreptococos, sulfitoreductores, leavduras y mohos) •Verificación de caracteres fisiológicos sobre medios sintéticos y vinos •Verificación de la ausencia de fagos Selección de levaduras autóctonas Criterios generales: •Ser autóctona •Buena capacidad fermentativa (rápido arranque y acabado) •Alta producción de etanol y regularidad fermentativa • Alta tolerancia al etanol •Producción baja de acidez volátil •No formación de espuma •Resistencia a sulfuroso •Baja producción de sulfhídrico •Otras: fenotipo killer Selección de levaduras autóctonas Levaduras seleccionadas para elaboración de blancos •Tolerancia a bajas temperaturas •Potenciación de aromas varietales y expresión de aromas secundarios •Capacidad de acidificación y desacidificación biológica •Crecimiento disperso en medio líquido Levaduras seleccionadas para tintos •Alta producción de acetaldehido y pirúvico-estabilización del color •Baja capacidad de adsorción de antocianos a la PC •Producción de glicerol- suavidad •Degradación del ácido málico Selección de levaduras autóctonas Uso de levaduras comerciales (LSA) Ventajas •Calidad más uniforme, garantiza repetitividad •Ayuda a resolver problemas de posible arranque, ralentización o paradas de fermentación •Homogeneidad en los vinos Inconvenientes •Pérdida de complejidad en el vino final •No son propias de la región •Pueden no implantarse por competencia entre las levaduras presentes en el mosto Selección de levaduras autóctonas Ventajas de las levaduras autóctonas •Específicas del área •Totalmente adaptadas a las condiciones climáticas de la zona •Totalmente adaptada al tipo de mosto •Responsables de características únicas de los vinos (tipicidad) BIBLIOGRAFÍA: Libros Barnett, J.A., Payne, R. 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