investigación - Universidad de Antioquia

FICHA TÉCNICA
TITULO DEL PROYECTO
Prevalencia de infección por el Virus del Papiloma
Humano y sus genotipos, usando técnicas
moleculares, en estudiantes de ambos sexos de la
Universidad de Antioquia, Medellín, 2001.
NOMBRE DEL INVESTIGADOR PRINCIPAL
Oscar Bernal Acevedo M.D. MSP Profesor Escuela
de Bacteriología
TELEFONO Y DIRECCION ELECTRONICA
Teléfono Escuela de Bacteriología: 2105495,
Dirección
Electrónica:
oscarbe@guajiros.udea.edu.co
NOMBRE DEL GRUPO DE INVESTIGACION:
Grupo de Citología Ginecológica
NOMBRE DE QUIENES DESARROLLAN EL PROYECTO
Marleny Valencia Arredondo Bacterióloga
Gloria Sánchez V. M.Sc., Ph. D.
Martha luz Uribe López de Mesa Bacterióloga
Lucía E. Tamayo A Enfermera. . MSP
Gildardo Gallego N. MD Ginecólogo
ESTUDIANTE DE PREGRADO:
DURACION DEL PROYECTO:
VALOR TOTAL: $ 99.476.400
Mary Luz López Pérez. Carnet 43167428 (Auxiliar de Inv)
12 meses
1. Planteamiento del problema
En España la incidencia de la infección oscila entre 1% al 2.5%1 y el estudio realizado por Burk Robert y
asociados2 en la Facultad de Medicina Albert Einstein, Bronx New York en 604 estudiantes voluntarias,
mostró una presencia del virus del 27.8%, encontrando riesgo atribuible significativos con edad (2.6 para 21
a 23 años), numero de compañeros sexuales (4.5 para 2, 5.8 para 3, 10.3 para 5 o más). La duración de la
actual relación afectiva mayor de 12 meses y que su compañero fuera también estudiante de la misma
Universidad demostraron un bajo riesgo atribuible de 0.6. Este estudio llama la atención sobre la importancia
de tener en cuenta no sólo a la mujer, sino a los hombres en la búsqueda del PVH.
En México se estima una prevalencia de PVH detectado por pruebas moleculares del 14% en mujeres blancas
no hispánicas, 10% en Hispánicas y el 7% en americanas nativas3. En Venezuela, en 1979 se estimó una
frecuencia 3.3% en pacientes de ginecología4. Un estudio de casos y controles realizados en Cali, Colombia,
y en España, determinó que alrededor del 13% de las mujeres del grupo control de la ciudad de Cali estaban
infectadas con el PVH en contraste con solo el 5% de las mujeres de este mismo grupo en España 5. Estos
mismos estudios mostraron el 25% de los esposos de las mujeres del grupo control estaba infectado con el
virus, lo que contrasta altamente con el hecho de que esta cifra es 5 veces más alta que la encontrada en los
esposos del grupo control de un estudio paralelo que se realizo en la población de una localidad de España 6.
Se han realizado diversos estudios para investigar la asociación de la infección por PVH con la etiología del
Cáncer de cuello uterino (CaCu). Estos se han basado en hallazgos de anatomía patológica, microscopía
electrónica, marcadores tumorales y anticuerpos homólogos contra el PVH. Los resultados han implicado a
ciertos tipos de PVH como factores necesarios para la génesis de un gran número de casos de neoplasia
cervical, debido a la detección del virus aproximadamente en el 90% de las lesiones premalignas y malignas
del cuello uterino7 8.
1
El trabajo presentado por Nubia Muñoz y Xavier Bosh sobre la relación causal entre Papiloma Virus y Cáncer
cervical concluye que el 90% de los Cánceres Cervicales pueden ser atribuibles a cierto tipo de Papiloma
virus9
Estos hallazgos son importantes puesto que el CaCu es el segundo cáncer más frecuente en el mundo, el 80 %
de los casos ocurren en los países en desarrollo10. En América Latina se han reportado las mayores tasas de
incidencia, siendo el riesgo 6 veces mayor que el de las mujeres blancas de Estados Unidos11. En Colombia,
es la segunda causa de mortalidad por todas las neoplasias malignas; y después del cáncer de estómago es la
neoplasia que más afecta a las mujeres. Las tasas estandarizadas de mortalidad por CaCu varían entre 1.0 y
17.1 defunciones por cada 100.000 mujeres, en las diferentes regiones del país, con una tasa global de 6.4 por
100.000 mujeres12 13.. En Antioquia en 1996 de todas las neoplasias malignas, el CaCu fue la cuarta causa de
muerte, con tasas de 7.9 por 100.000 mujeres, afectando especialmente a las mujeres de los municipios de
Sabanalarga, San Andrés de Cuerquia, Puerto Berrío, Chigorodó, Anzá y Buriticá 14.
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo General
Determinar la prevalencia relativa y los genotipos de PVH en los estudiantes de la Universidad de Antioquia,
Medellín, mediante técnicas moleculares, 2001.
2.2
Objetivos específicos:
2.2.1 Determinar la prevalencia relativa de la infección por PVH y la distribución de los diversos tipos de
PVH, según sexo y edad de la población en estudio,
2.2.2 Determinar la razón de prevalencia de los factores de riesgo: nivel socioeconómico, nivel educativo,
hábito de fumar, edad de inicio de relaciones sexuales, utilización de condón, número de compañeros/as
sexuales, antecedentes de enfermedades de transmisión sexual y el diagnóstico de PVH.
2.2.3 Determinar la razón de prevalencia de los factores de riesgo: Edad del primer embarazo, paridad, uso de
anovulatorios y el diagnóstico de PVH.
2.2.4 Determinar la razón de prevalencia de la exposición a los diferentes tipos de PVH clasificados en alto y
bajo riesgo con las lesiones intraepiteliales (LIE).
3.
METODOLOGÍA
3.1 Tipo de Estudio
Estudio descriptivo con análisis de un estudio de corte, en estudiantes de la Universidad de Antioquia,
Medellín.
3.2 Población de referencia
Estudiantes inscritos en la Universidad de Antioquia. Como población de referencia se tomarán los
estudiantes registrados en todos los grados en el año 2000. Total : 23498 según la oficina de
admisiones y registros de la Universidad de Antioquia.
3.3 Diseño Muestral
3.3.1 Tipo de muestreo
Muestreo representativo de los estudiantes de la Universidad de Antioquia, Medellín, probabilístico, aleatorio
simple.
3.3.2 Tamaño de la muestra
El tamaño de muestra se calculó con el programa Epidat de la OPS y con los siguientes parámetros: nivel de
confianza del 95%, precisión absoluta del 5%, como se desconoce la proporción se calculará con un 50% de
encontrarlo, para un total de 379 estudiantes. Debido a los posibles problemas en la participación tanto en la
encuesta como en el examen, se decide aumentar en un 30% el número de estudiantes convocados, para un
total de 493. El número de muestras que no puedan ser leídas debido a problemas técnicos no debe ser > 1%.
3.3.3 Selección de la muestra
Se tomará una muestra aleatoria con base en el listado de estudiantes con el que cuenta la oficina de
Admisiones y registros de la Universidad de Antioquia y utilizando el generador de números aleatorios del
2
programa Epidat de la OPS. Estos estudiantes serán invitados por escrito a participar de una reunión donde se
les explicará el estudio y las condiciones de participación. Posteriormente se pedirá que llenen un formulario
totalmente anónimo a todos los seleccionados, para así comparar entre quienes participen y no en el estudio.
Cada encuesta será identificada con un número.
Los estudiantes los estudiantes seleccionados y que deseen participar de manera voluntaria en el estudio se les
invitará a presentarse en el laboratorio de la Universidad de Antioquia cualquier día durante las siguientes 2
semanas. En el laboratorio el estudiante será reportado por su número de encuesta.
Si con la primera invitación no se logra cubrir las necesidades del muestreo, se realizará una segunda
convocatoria hasta tener el número de estudiantes. La citología y las técnicas moleculares de detección se
realizarán a todos los estudiantes que participen del estudio. El informe se dará de manera individual y con la
información necesaria sobre el resultado y los centros de referencia.
3.4 Diseño del plan de recolección de información
Por intermedio del Centro de Investigaciones de la Escuela de Bacteriología y Laboratorio Clínico y del
Grupo de Investigación en Citología Ginecológica, se establecerá una comunicación formal con la oficina de
Admisiones y registros para obtener los datos necesarios.
3.4.1 Encuesta para detectar factores de riesgo
La encuesta se le aplicará a cada uno de las personas seleccionadas en la muestra y la realizarán los
investigadores con el fin de controlar sesgos de información.
La encuesta comprende preguntas relacionadas con la identificación de la participante, edad, sexo,
procedencia, estrato socio económico, habito de fumar, estado civil, número de compañeros/as sexuales, edad
de la primera relación sexual, número de hijos, antecedentes de enfermedades de transmisión sexual, uso del
condón. Las mujeres tendrán preguntas específicas como paridad, edad del primer parto, citologías previas,
resultados de las citologías anteriores.
3.4.2. Recolección de los especímenes
Inspección de la vulva, vagina y cervix para la visualización de alguna anormalidad. Mujeres que presenten
anormalidades serán referidas a sus respectivos proveedores de los servicios de salud para estudios
colposcopicos para definir si necesitan algún tratamiento. Dos muestras se tomarán de cada mujer, una para el
estudio citológico (Papanicolaou) empleando la técnica estandarizada en el Laboratorio de citología de la
Universidad de Antioquia. Después de la colección de la anterior muestra, una espátula nueva será utilizada
para colectar células del cervix. Las dos espátulas y el cepillo citológico serán inmediatamente transferidos a
un tubo que contiene 1 ml de medio de transporte STM (Digene, Silver Spring, MD). Espátulas y cepillo
citológico serán agitados vigorosamente para asegurar una resuspensión de las células en este medio.
Procesamiento de las células obtenidas del exudado cervical: Las células serán inmediatamente refrigeradas
a - en el medio de transporte (STM; Digene, Silver Spring, MD) y transportadas al laboratorio de Virología,
Universidad de Antioquia de la ciudad de Medellín en donde serán procesadas para PCR. Para obtener el
DNA, una alícuota de 500 ul serán tratados con una solución de digestión de manera que se obtenga una
contracción final de 200 ug/ml de proteinaza K y 0.1 % de Laureth-12. Muestras son incubadas por 2 horas a
55 o C y adicional 10 min a 95 o C. 10 ul de este material serán utilizados para ser amplificados en la técnica
de PCR.
Examen clínico y recolección de muestras en los hombres: A los hombres se les aconsejara no lavar sus
genitales 20 horas antes del examen y la recolección de las muestras. En el área genital se tratara de
determinar la presencia de masas testiculares o nódulos inguinales. Células de exudado del pene serán
obtenidas con dos escobillones; el primer escobillón de algodón previamente humedecido en PBS se utilizara
para raspar suavemente la superficie entera del glande y la zona alrededor de el orificio uretral. Las células
colectadas de estos sitios se utilizaran para un extendido en la parte externa de la lamina y el escobillón será
inmediatamente transferido a un tubo de 50 ml que contiene 20 ml de PBS. El segundo será un escobillón
delgado, de los que se usan para colectar muestras de la uretra para cultivo de Chlamydia. Este escobillón será
suavemente introducido 3 a 4 cm en la uretra, girándolo dentro de la misma. Células recobradas de la uretra
3
serán extendidas en la parte interior de la misma lamina e inmediatamente transferido al tubo que contiene los
20 ml de PBS como se observa en la figura.
Nombre
Células de la uretra
Células del glande
Código
Después de la colección de la muestra, 5% ácido acético será aplicado en toda la superficie del pene con un
escobillón grande de algodón y se observara la presencia de lesiones blancas y la presencia o no de las
mismas serán registradas en la historia clínica del individuo. En caso de observar lesiones anormales, el
individuo será referido al respectivo servicio de salud.
Las células colectadas del exudado del pene en los hombres serán procesadas de igual manera como se
describió en la toma de muestra de los participantes del sexo femenino.
3.4.3 Detección de PVH por PCR
Para este estudio utilizaremos el kit RMS (Roche Molecular System) HPV PCR Genotyping test (Roche
Molecular Systems, Alameda, CA, USA). El ensayo es de fácil uso, simple y sistematizado y se encuentra
estandarizado. El ensayo se basa en la técnica inicialmente descrita por Manos en 1989 y la cual utiliza la
técnica de Reacción en cadena de la Polimerasa y cebadores que amplifican un segmento del gene L1 que
codifica para luna de las proteínas de la capside del virus del Papiloma Humano (VPH). El kit incluye el par
de cebadores marcados con biotina (PGMYB09* / PGMYB11) que amplifican una porción del gene L1 de un
numero amplio numero de los diferentes genotipos del VPH e incluye además los cebadores (BGH20/BPC04)
que amplifican un fragmento del gene de la -globina humana. Una vez amplificados estos segmentos de
ADN de las muestras del cervix, estos productos son hibridizados a las sondas especificas para diferentes 27
genotipos, las cuales se encuentran inmovilizadas en tiras de nitrocelulosa. Los híbridos, sonda especificaDNA amplificado son detectados mediante la unión de la estreptavidina a la biotina. La unión de la biotina a
la estreptavidina, la cual esta marcada con la enzima de la peroxidasa de rábano, es detectada por la formación
de color en presencia del correspondiente substrato de la peroxidasa.
3.5 Procesamiento y reporte del estudio citológico.
Las muestras citológicas serán procesada e interpretadas por dos de las investigadoras, bacteriólogas
citólogas, en el laboratorio de Citología de la Universidad de Antioquia. Esto se hará según los protocolos
establecidos por esta área. El Reporte se realizará según el informe Bethesda.
3.6. Control de Sesgos
Se controlaran los sesgos de información mediante la estandarización de las personas que van a recolectar la
información, tanto para la aplicación de las encuestas, como para la toma y proceso de las pruebas de
laboratorio. Los sesgos de confusión, se controlaran en el análisis de la información, mediante la
estratificación por posibles variables que confunden, la relación entre los factores de riesgo y la infección por
PVH y los NIC.
Se incluirá a todo estudiante que halla sido seleccionada aleatoriamente y que de manera voluntaria desee
realizarse una citología para estudio de PVH. Se debe informar a cada persona que el examen se realizará
solamente a personas que hallan tenido relaciones sexuales con anterioridad en su vida.
3.7
Plan de análisis
Los datos serán sistematizados en una base de datos del programa Epi-info 2000
Se determinará la frecuencia y porcentaje del PVH y su genotipo. En mujeres se reportarán la frecuencia de
LIE por medio de estudio citológico, según la clasificación de Bethesda.
Se determinará la frecuencia y porcentaje de edad, sexo, procedencia, estrato socio económico, habito de
fumar, estado civil, número de compañeros/as sexuales, edad de la primera relación sexual, número de hijos,
antecedentes de enfermedades de transmisión sexual, uso del condón. En las mujeres se determinará la
frecuencia y porcentaje de edad del primer parto, citologías previas, resultados de las citologías anteriores.
Luego, se calculará la razón de prevalencia de cada uno de los factores de riesgo y la infección por PVH.
Riesgo atribuible de la infección por PVH y LIE detectadas en mujeres. Se utilizarán el Intervalo de
confianza y el chi cuadrado como prueba de significancia estadística.
4
3.8 Consideraciones éticas
A todos los estudiantes participantes en el estudio se les explicará de forma clara y concisa los objetivos del
estudio y las implicaciones de los resultados que se obtendrán. Firmarán el consentimiento informado, el cual
se rige por la resolución 008430 de 1993 del Ministerio de Salud, que clasifica está investigación como de
riesgo mínimo. Las mujeres y hombres positivos para infección por PVH detectadas por citología o PCR, las
mujeres con NIC o cáncer invasor serán remitidas/os a la institución de salud a la cual pertenecen para el
tratamiento y control. En caso de no contar con ningún tipo de EPS o ARS, se les recomendará una
institución que pueda atender su problema.
4. RESULTADOS ESPERADOS
4.1 Resultados directos
Establecer la prevalencia de 27 genotipos de PVH en la población estudiantil de la U. De Antioquia.
Estandarización de metodologías moleculares en el laboratorio de Virología de la Facultad de Medicina, con
el fin de realizar estudios epidemiológicos. Consolidación de la línea de investigación de PVH y cáncer en el
laboratorio de Virología de la Facultad de Medicina. Aporte a la consolidación de las líneas de investigación
sobre infecciones de transmisión sexual y la relación con las lesiones intraepiteliales, en particular fortalecer
la investigación del área, sobre infección por PVH y el cáncer cervical. Fortalecimiento del grupo de
investigación Citología Ginecológica, actualmente en formación. Apoyo a la actividad investigativa en la
especialización de Citología Ginecológica en la Escuela de bacteriología y Laboratorio Clínico.
4.2 Resultados indirectos
Entrenamiento a un bacteriólogo citólogo, en los principios, aplicación e interpretación de metodologías
moleculares. Entrenamiento de un estudiante de biología en el manejo y aplicación de la técnica molecular
para la detección de PVH.
5. ESTRATEGIAS DE COMUNICACIÓN Y COMPROMISOS
 Presentación de acta de iniciación y final
 Publicación en revista Nacional y Certificado de presentación a revista Internacional
 Presentación en evento nacional de Bacteriología y/o Salud pública.
Una vez concluida la investigación, los resultados se darán a conocer en la Universidad de Antioquia,
instituciones de salud y Servicio Seccional de Salud, comprometidas con el control de esta infección; a los
estudiantes y profesores del área de citología y áreas afines.
6. FUNCIONES DEL ESTUDIANTE
Como auxiliar de investigación el estudiante participará en la recolección de la información, análisis de datos
y presentación de informe final.
7. CRONOGRAMA
SEMESTRE/AÑO
MES
Revisión Bibliográfica
Toma de las citologías
Lectura de las citologías
Estandarización técnicas PCR
Identificación de genotipos
Elaboración Base de Datos
Análisis estadístico
Elaboración del informe Final
Divulgación
PRIMER SEMESTRE 2001
1
2
3
4
5
6
SEGUNDO SEMESTRE 2001
7
8
9
10
11
12
8. BIBLIOGRAFÍA
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