Pruebas de laboratorio recomendadas para detectar el virus de la

Pruebas de laboratorio recomendadas para detectar el virus de la
gripe aviar A en muestras obtenidas de seres humanos
Información general
La gripe aviar hiperpatógena provocada por ciertos subtipos del virus de la gripe A en
poblaciones animales, en particular los pollos, plantea un riesgo sostenido para la salud pública
humana a escala mundial. La infección humana directa por un virus de la gripe aviar A (H5N1)
fue reconocida por primera vez durante el brote ocurrido en 1997 en Hong Kong (Región
Administrativa Especial de China). Después de ese brote, se han documentado otras infecciones
humanas con cepas aviares de los subtipos H9 y H7. El actual brote de gripe aviar A (H5N1)
entre seres humanos y la evidente endemicidad de este subtipo en las aves de corral de Asia
sudoriental ponen de relieve la necesidad de disponer de una capacidad de diagnóstico rápido
para las infecciones gripales atípicas. La identificación de las infecciones humanas por el virus
de la gripe A en el laboratorio suele realizarse mediante detección directa de antígenos,
aislamiento en cultivos celulares o detección de ARN específico de la gripe mediante la
reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa inversa.
Las presentes recomendaciones van destinadas a los laboratorios que deben analizar muestras
de pacientes aquejados de una enfermedad de tipo gripal, en aquellos casos en los que existen
datos clínicos o epidemiológicos que demuestran una infección por la gripe A. Los
procedimientos de laboratorio que se exponen más adelante no contienen toda la información
necesaria para llevar a cabo las pruebas; si se desean más detalles, hay que consultar la
bibliografía citada o dirigirse al grupo de trabajo técnico i o a uno de los Laboratorios de
Referencia de la OMS para el virus H5.ii
La muestra idónea para la detección del virus de la gripe A es un aspirado nasofaríngeo
obtenido en los tres días que siguen a la aparición de los síntomas, si bien también pueden
utilizarse
hisopados
nasofaríngeos
y
otro
tipo
de
muestras
(http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/humanspecimens/en/index.html (en
inglés)). En toda manipulación de las muestras y durante la realización de las pruebas de
diagnóstico se procederá con arreglo a las directrices uniformes en materia de bioseguridad
(http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/handlingspecimens/en/index.html;
http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/WHO_CDS_CSR_LYO_2004_11/en/)
(en inglés).
La estrategia en relación con las pruebas de laboratorio iniciales de cada muestra tendrá por
objeto diagnosticar rápidamente la infección por el virus de la gripe A y descartar otras virosis
respiratorias comunes. En condiciones ideales, los resultados deberían estar disponibles en 24
horas.
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Procedimientos para el diagnóstico de la gripe
Entre los análisis disponibles para el diagnóstico de infecciones por el virus de la gripe A
figuran los siguientes:
1.
Detección rápida de antígenos. Los resultados pueden obtenerse en 15 a 30 minutos.
•
•
•
Pruebas de gripe cercanas al paciente. Estas pruebas están disponibles en el comercio
(Nicholson, Wood y Zambon, 2003)
Análisis de inmunofluorescencia. Un método muy extendido y sensible para el
diagnóstico de las infecciones por los virus de la gripe A y B y otros cinco virus
respiratorios de importancia clínica (Lennette y Schmidt, 1979).
Inmunoanálisis enzimático. Para detectar la nucleoproteína de la gripe A.
2.
Cultivo de virus. Los resultados se obtienen en 2 a10 días. Tanto el cultivo celular con
inmunofluorescencia (en "shell vial") como el cultivo celular convencional pueden utilizarse
para detectar virus respiratorios de importancia clínica. Los cultivos gripales positivos pueden
exhibir o no efectos citopáticos, pero es preciso identificar el virus por inmunofluorescencia en
los cultivos celulares o por la prueba de inhibición de la hemaglutinación (IHA) en el medio de
cultivo celular (sobrenadante).
3.
Reacción en cadena de la polimerasa (RCP) y prueba de RCP en tiempo real
(RCP-TR). Cada vez se extiende más el uso de juegos de cebadores específicos del gen de la
hemaglutinina (gen HA) de los virus de la gripe A/H1, A/H3 y B circulantes. Los resultados
pueden estar disponibles en pocas horas a partir de hisopados clínicos o de cultivos de células
infectadas. Además, varios Centros Colaboradores de la OMS están elaborando reactivos para
las pruebas de RCP y RCP-TR en cepas atípicas de gripe aviar/humana (Fouchier et al., 2000;
Lee y Suárez, 2004).
Toda muestra que dé resultados positivos con los métodos anteriores respecto del virus de la
gripe A y que esté presuntamente infectada con el virus de la gripe aviar será sometida a nuevas
pruebas y verificada por un Centro de Referencia de la OMS para el virus H5 especialmente
designado.2 Los laboratorios que carezcan de la capacidad necesaria para realizar pruebas
específicas de identificación del subtipo A del virus de la gripe deberán hacer lo siguiente:
1.
Remitir las muestras o los aislados virales a un Centro Nacional de la Gripe
(http://www.who.int/csr/disease/influenza/centres/en/index.html (en inglés)) o a un Laboratorio
de Referencia de la OMS para el virus H52 a fin de que procedan a su identificación o
caracterización.
2.
Informar a la Oficina de la OMS en el país, a la Oficina Regional de la OMS o al
Programa Mundial de la Gripe en la sede de la OMS (whoinfluenza@who.int) de que las
muestras o los aislados de virus van a ser enviados a otros laboratorios para que los identifiquen
o caractericen.
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Identificación de subtipos de gripe aviar A
Análisis de inmunofluorescencia
El análisis de inmunofluorescencia puede utilizarse para la detección de virus en muestras
clínicas o en cultivos celulares. Son preferibles las muestras clínicas, obtenidas lo antes posible
tras la aparición de los síntomas, ya que el número de células infectadas presentes disminuye
durante el curso de la infección. Es mejor realizar este análisis en cultivos celulares inoculados,
pues permite la amplificación de los virus que puedan estar presentes.
Material necesario:
•
•
•
•
•
•
•
Juego de reactivos de la OMS para la identificación del virus de la gripe A/H5
(versiones 1997-98, 2003 ó 2004). Los reactivos de este juego para el análisis de
inmunofluorescencia comprenden los siguientes:
- mezcla de anticuerpos monoclonales específicos de la gripe A/H5
- mezclas de anticuerpos monoclonales específicos de la gripe A y específicos de la
gripe B
- anticuerpos monoclonales específicos de la gripe A/H1 y de un subtipo A/H3.
conjugado de isotiocianato de fluoresceína (FITC) y anti-IgG de ratón
portaobjetos para microscopio
cubreobjetos, 24 x 60 mm
líquido de montaje
acetona
microscopio de inmunofluorescencia.
Procedimiento
Esta prueba se realizará siguiendo las instrucciones incluidas en el Juego de reactivos de la
OMS para la gripe. Las células epiteliales se lavan por centrifugación para eliminar toda la
mucosidad contaminante; a continuación se fijan y se tiñen con anticuerpos monoclonales
específicos. Las células del epitelio respiratorio contenidas en una muestra clínica son
sumamente lábiles y se deterioran con facilidad, por lo que habrán de mantenerse refrigeradas
con hielo durante la manipulación y no centrifugarse a más de 500 g. Habrá que incluir
portaobjetos de control con células infectadas por la gripe A/H3 y H1 (y, si se dispone de ellas,
células infectadas por el H5) y células no infectadas para controlar debidamente los anticuerpos
monoclonales y el conjugado y para facilitar la interpretación de la tinción específica.
Interpretación de resultados
La tinción específica debe dar una intensa fluorescencia intracelular de color verde manzana.
Puede observarse fluorescencia nuclear o citoplásmica. Es importante velar por que la densidad
celular sea suficiente. Puede aceptarse como resultado positivo la presencia de una o más
células intactas que muestren fluorescencia intracelular específica.
Como se ha demostrado que los anticuerpos monoclonales disponibles en el comercio para la
caracterización de subtipos de gripe A/H1 reaccionan de forma cruzada con los subtipos de
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gripe A/H5, incluidas las cepas actualmente circulantes (2004), deben realizarse pruebas
confirmatorias utilizando el anticuerpo monoclonal incluido en el juego de reactivos de la OMS.
Cultivo de virus
El aislamiento de virus es una técnica sensible que presenta la ventaja de que el virus está
disponible tanto para la identificación como para la ulterior caracterización antigénica y
genética, las pruebas de susceptibilidad a fármacos y la preparación de vacunas. La línea celular
preferida para el cultivo de virus de la gripe es la MDCK. La identificación de un virus de la
gripe desconocido puede llevarse a cabo mediante un análisis de inmunofluorescencia
utilizando anticuerpos monoclonales específicos (véase más arriba) o bien por hemaglutinación
(HA) y análisis antigénico (determinación del subtipo) por inhibición de la hemaglutinación
(IHA) utilizando antisueros de referencia seleccionados.
A diferencia de otras cepas de la gripe A, el virus de la gripe A/H5 también crece en otras
líneas celulares comunes como Hep-2 y RD. Se adoptarán las precauciones convencionales en
materia de bioseguridad cuando se manipulen muestras y cultivos celulares que presuntamente
contienen gripe aviar A hiperpatógena.
REGLA DE ORO: Las muestras clínicas procedentes de seres humanos y las procedentes de
cerdos o aves nunca se manipularán en el mismo laboratorio.
Material necesario
•
•
•
•
•
Células renales de perro Madin-Darby (MDCK), ATCC CCL34
Juego de reactivos de la OMS para la identificación del virus de la gripe A/H5. Los
reactivos para la identificación del A/H5 en cultivos celulares incluyen los siguientes:
- antígeno de control de la gripe A/H5: virus inactivado
- suero de cabra para A/Tern/South Africa/61/H5
- mezcla de sueros de pollo para A/Goose/Hong Kong/437-4/99
Juego de reactivos de la OMS para la gripe (distribución anual)
- antígenos de referencia y antisueros de referencia para A(H1N1) y A (H3N2)
Enzima destructora de receptores
Hematíes (de pollo, de pavo, humanos de tipo O, o de cobayo) en solución de Alsever.
Procedimiento
1.
Se seguirán los procedimientos uniformes para el cultivo de células en el laboratorio
destinado a la propagación de cultivos celulares, la inoculación de muestras y la cosecha de
células infectadas para el análisis de inmunofluorescencia o la recogida del sobrenadante del
cultivo para las pruebas de HA y de IHA (Lennette y Schmidt, 1979; OMS, 2002). Cuando se
manipulen virus amplificados, se observarán las directrices uniformes en materia de
bioseguridad en el laboratorio
(http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/handlingspecimens/en/index.html
(en inglés)).
2.
Se seguirán los procedimientos uniformes en la HA y la IHA, incorporando todos los
controles recomendados. En el manual de la OMS sobre diagnóstico y vigilancia de la gripe
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animal (WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance (OMS, 2002)) se ofrecen
pormenores específicos sobre los sueros y los antígenos de referencia.
Interpretación de resultados
La mayor dilución de virus que provoca hemaglutinación completa se toma como titulación
final de la HA. El punto final de la IHA es la última dilución de antisuero que inhibe por
completo la hemaglutinación. El título se expresa como el recíproco de la última dilución.
La identificación del aislado sobre el terreno se lleva a cabo comparando los resultados del
aislado desconocido con los obtenidos con el antígeno de control. Se determina que un asilado
es un subtipo específico de la gripe A cuando el título de la IHA es al menos cuatro veces
mayor que el título obtenido con el otro antisuero.
En los sueros pueden aparecer aglutininas inespecíficas que pueden provocar falsas reacciones
negativas; también puede suceder que algunos aislados sean hipersensibles a inhibidores
inespecíficos presentes en los sueros, que den lugar a falsas reacciones positivas.
Reacción en cadena de la polimerasa
La reacción en cadena de la polimerasa (RCP) es una potente técnica para la identificación de
genomas del virus de la gripe. El genoma del virus de la gripe es un ARN de hebra única; en
primer lugar hay que sintetizar una copia de ADN (ADNc) utilizando una polimerasa de
transcripción inversa (transcriptasa inversa, TI). El procedimiento de amplificación del genoma
de ARN (RCP -TI) requiere un par de oligonucleótidos cebadores. Los pares de cebadores se
diseñan en función de la secuencia conocida del gen HA de los subtipos de gripe A y del N1, y
amplifica específicamente el ARN de un solo subtipo. Los ADN generados mediante cebadores
específicos de cada subtipo pueden después analizarse utilizando técnicas de genética molecular
como la secuenciación. Los cebadores que se enumeran a continuación son los recomendados
por la Red de Laboratorios de Referencia de la OMS para el H52. Se está creando un grupo
técnico de trabajo de la OMS encargado de la actualización y la obtención puntuales de
cebadores.1
Material necesario
• Mini juego QIAamp de ARN viral o juego de extracción equivalente
• Juego QIAGEN OneStep para RCP-TI en un solo paso
• Inhibidor de la ARNasa (ABI) 20U/μl
• Tubos de microcentrifugadora estériles, 0,2, 0,5 y 1,5 ml
• Pares de cebadores:
Cebadores del gen HA para la amplificación del H5 (modificado de Yuen et al., 1998):
H5-1: GCC ATT CCA CAA CAT ACA CCC
H5-3: CTC CCC TGC TCA TTG CTA TG
Tamaño previsto del producto: 219 pares de bases
Cebadores del gen HA para la amplificación del H9:
H9-426: GAA TCC AGA TCT TTC CAG AC
H9-808R: CCA TAC CAT GGG GCA ATT AG
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Tamaño previsto del producto: 383 pares de bases
Cebadores del gen NA para la amplificación del N1 (Wright et al., 1995):
N1-1: TTG CTT GGT CGG CAA GTG C
N1-2: CCA GTC CAC CCA TTT GGA TCC
Tamaño previsto del producto: 616 pares de bases
• control positivo (se obtiene solicitándolo a un Laboratorio de Referencia de la OMS para el
H52)
• Pipetas ajustables, 10, 20 y 100 μl
• Puntas desechables con filtro
• Microcentrifugadora, ajustable a 13 000 rpm
• Mezcladora vorticial
• Termociclador
• Bandeja para gel de agarosa, cámara de electroforesis y suministro eléctrico
• Caja de luz UV o lámpara manual de UV (302 nm)
Procedimiento
1.
Se extraerá el ARN viral de la muestra clínica mediante el minijuego QIAamp u otro
juego de extracción equivalente, siguiendo las instrucciones del fabricante.
2.
RCP-TI en un solo paso
H5 ó N1
Se preparará la mezcla maestra para la RCP-TI como sigue:
5x QIAGEN solución amortiguadora para RCP-TI, 10µl
Mezcla de dNTP, 2 µl
5x solución Q, 10µl
Cebador directo (5 µM), 6 µl
Cebador inverso (5 µM), 6 µl
Mezcla enzimática, 2 µl
Inhibidor de la ARNasa (20U/ µl), 0,5µl
Agua (calidad molecular), 9 µl
Total, 45 µl
Se añadirán 5μl de ARN viral.
H9
Se preparará la mezcla maestra para la RCP-TI como sigue:
5x QIAGEN solución amortiguadora para RCP-IT, 10µl
Mezcla de dNTP, 2 µl
Cebador directo (5 µM), 6 µl
Cebador inverso (5 µM), 6 µl
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Mezcla enzimática, 2 µl
Inhibidor de la ARNasa (20U/ µl), 0,5µl
Agua (calidad molecular), 19 µl
Total, 45 µl
Se añadirán 5μl de ARN viral.
3. RCP-TI para H5, N1, H9
Se fijarán las siguientes condiciones para la RCP:
Transcripción inversa, 30 min a 50 ºC
Activación inicial de la RCP, 15 min a 95 ºC
Ciclo en tres pasos
Desnaturalización, 30 segundos a 94 ºC
Anillamiento de los cebadores, 30 segundos a 55 ºC
Extensión, 30 segundos a 72 ºC
Número de ciclos: 40
Extensión final: 2 min a 72 ºC
4. Electroforesis en gel de agarosa de los productos de la RCP
Se preparará el gel de agarosa, se incorporarán los productos de la RCP y el marcador de pesos
moleculares y se iniciará el proceso de acuerdo con los protocolos convencionales. Se
visualizará la presencia de las bandas correspondientes al marcador y al producto de la RCP con
luz UV.
Interpretación de resultados
El tamaño previsto de los productos de la RCP para la gripe A/H5 es de 219 pares de bases,
para la A/H9 de 383 pares de bases y para la N1 de 616 pares de bases. Si la prueba se efectúa
sin control positivo, habrá que confirmar los productos por secuenciación y comparación con
las secuencias depositadas en las bases de datos. La ausencia de los productos de la RCP
correctos (es decir, un resultado negativo) no permite descartar la presencia del virus de la gripe.
Los resultados habrán de interpretarse junto con la información clínica y epidemiológica
disponible. Las muestras obtenidas de pacientes que tengan una elevada probabilidad de
infección por la gripe A/H5 ó H9 se analizarán por otros métodos (inmunofluorescencia, cultivo
de virus o serología) con el fin de descartar la infección por la gripe A (A/H5 ó H9).
Confirmación en el laboratorio
Todos los resultados de laboratorio correspondientes a la gripe A/H5, H7 ó H9 durante los
períodos interpandémico y de alerta pandémica del Plan Mundial de la OMS de preparación
ante
una
pandemia
de
gripe
(http://www.who.int/csr/resources/publications/influenza/WHO_CDS_CSR_GIP_2005_5/en/in
dex.html (en inglés)) deberán ser confirmados por un Laboratorio de Referencia de la OMS
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para el virus H52 o por un laboratorio recomendado por la OMS. Todo el material que haya
dado resultado positivo respecto de la gripe A/H5, H7 ó H9, inclusive muestras humanas,
extractos de ARN de muestras humanas y virus de la gripe A/H5, H7 ó H9 en medio de cultivo
celular o líquido alantoico de huevo, deberá enviarse a un Laboratorio de Referencia de la OMS
para el virus H52 o un laboratorio recomendado por la OMS. La comunicación y publicación de
resultados de los análisis se hará siguiendo las directrices de la OMS para el intercambio
puntual de virus o muestras de gripe que puedan causar pandemias de gripe humana
(http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/Guidance_sharing_viruses_specim
ens/en/index.html (en inglés)).
Identificación serológica de la infección por la gripe A/H5
Las pruebas serológicas disponibles para medir los anticuerpos específicos de la gripe A
incluyen la prueba de inhibición de la hemaglutinación (IHA), el inmunoanálisis enzimático y
las pruebas de neutralización de virus. El análisis de microneutralización es la prueba
recomendada para la medición del anticuerpo específico de la gripe aviar A hiperpatógena.
Dado que esta prueba exige utilizar virus vivos, su uso para la detección del anticuerpo
específico de la gripe aviar A hiperpatógena se limita a aquellos laboratorios que dispongan de
instalaciones de contención del Nivel de Bioseguridad 3.
Bibliografía
− Fouchier RA et al. (2000). Detection of influenza A viruses from different species by PCR
amplification of conserved sequences in the matrix gene. Journal of Clinical Microbiology,
38:4096–4101.
− Lee CW, Suarez DL (2004). Application of real-time RT-PCR for the quantitation and
competitive replication study of H5 and H7 subtype avian influenza virus. Journal of
Virological Methods, 119: 151–158.
− Lennette EH, Schmidt NJ, eds (1979). Diagnostic procedures for viral, rickettsial and
chlamydial infections, 5th ed. Washington, DC, American Public Health Association.
− Nicholson KG, Wood JM, Zambon M (2003). Influenza. Lancet, 362:1733–1745.
− Spackman et al. (2002). Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type
A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. Journal of Clinical
Microbiology, 40: 3256–3260.
− WHO (2002). WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance. Ginebra,
Organización Mundial de la Salud (documento WHO/CDS/CSR/NCS/2002.5, disponible en:
http://www.who.int/csr/resources/publications/influenza/en/whocdscsrncs20025rev.pdf
(en inglés))
− Wright KE et al. (1995). Typing and subtyping of influenza viruses in clinical samples by
PCR. Journal of Clinical Microbiology, 33:1180–1184.
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− Yuen KY et al. (1998). Clinical features and rapid viral diagnosis of human disease
associated with avian influenza A H5N1 virus. Lancet, 351:467–471.
i
Se está estableciendo un grupo de trabajo técnico de la OMS, que se reunirá por primera vez en septiembre de
2005.
ii
Puede encontrarse una lista de los Laboratorios de Referencia de la OMS para el virus H5 en la dirección
http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/referencelabs/en/index.html (en inglés).
Pruebas de laboratorio recomendadas para detectar el virus de la gripe aviar A en muestras obtenidas de seres humanos - junio de 2005
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