Laboratorio PCR y diseno primers

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PCR
PCR
• Técnica inventada por Kary Mullis :1987
• Premio Nobel 1993
• Amplifica una ÚNICA secuencia a partir de una
mezcla compleja de ADN
Aprovecha los requerimientos de la
replicación
•
•
•
•
Templete ADN
Nucleótidos
Primers (Imprimadores)
Polimerasa
Primers
Se debe tener información de la secuencia
que rodea el fragmento de interés
Primers dan especificidad a la reacción,
delimitan región a amplificar
6-40 nucléotidos
Usualmente 18-22
A no más de 4 kb uno de otro
Primers
•2 primers: complementarios a bandas opuestas
•Deben estar en exceso
Para realizar la técnica se necesitan:
• dNTPs
• Dos cebadores (o primers)
• Iones divalentes. Se suele usar magnesio
(Mg2+), agregado comúnmente como cloruro de
magnesio (MgCl2), Actúan como cofactores de la
polimerasa.
• Una solución tampón o buffer que mantiene el
pH adecuado para el funcionamiento de la ADN
polimerasa.
• ADN polimerasa (la más común es la Taq
polimerasa).
• ADN molde
• Termociclador
Ciclos
20 a 35 ciclos de:
1. Desnaturalización: 94-96°
5‘
3‘
3‘
5‘
5‘
3‘
3‘
5‘
2. Annealing
50-65°
5‘
3‘
3‘
5‘
3. Elongación
72°C
5‘
3‘
3‘
5‘
Ciclo completo de PCR
Tamaño definido
Clave para facilidad proceso: polimerasa
• Debe ser termoestable
• Thermus aquaticus, una bacteria
Desventajas de la Taq
• No corrige errores
• 1 error en 2 x 104 bases
• Nuevas polimerasas cometen menos errores
Termociclador
Templete para PCR
•
•
•
•
•
Se pueden usar bajas cantidades
En teoría: una sola molécula
No se debe aislar la secuencia de interés
No debe ser muy puro
ADN es una molécula muy estable en ausencia
de nucleasas
A partir de:
•
•
•
•
•
•
Sangre
Semen
Pelo
Mucosa bucal
Uñas
Cepillo dientes
Cuidado con PCR
• Es tan sensible que se debe evitar la
contaminación
Resolución de problemas de PCR
http://bitesizebio.com/articles/the-essential-pcrtroubleshooting-checklist/
Primers
Características importantes de un primer
• Longitud
• Tm
Tm
Temperatura de “melting”, separación, fusión – la
temperatura a la que la mitad de las hebras de ADN son
simple banda y la mitad son doble banda. Entre más GC más alta Tm.
Cálculos:
Menos de 13: Tm= (wA+xT) * 2 + (yG+zC) * 4
Más largo de 13: Tm= 64.9 +41*(yG+zC-16.4)/(wA+xT+yG+zC)
Programas usan fórmulas modificadas más exactas. Consideran
concentración de sales, de iones, etc
Características de un buen primer
• Tm en el rango de 52°C a 65°C. Idealmente
ambos primers con Tm parecida.
• Que no sean capaces de dimerizar
• Ausencia de formación de horquillas
• Falta de sitios secundarios de unión
Unión única
Secuencia debe ser única en el ADN templete
No debe existir annealing en posibles fuentes
contaminantes (humano, rata, ratón). Se logra
haciendo BLAST o BLAT con el genoma
correspondiente
5’...TCAACTTAGCATGATCGGGTA...GTAGCAGTTGACTGTACAACTCAGCAA...3
’
CAGTCAACTGCTAC
TGCTAAGTT
G
Primer candidato 2 5’-CAGTCAACTGCTAC-3’
No único!
Único!
A
TGCT
AGTTG
Primer candidato 1 5’-TGCTAAGTTG-3’
Longitud del primer
• En términos generales:
▫
▫
▫
▫
Entre más largo más específico
Entre más largo más alta Tm y temp annealing
Por lo menos 15pb de longitud
Por lo general 17-28pb
▫ Caso especial: mutagénesis dirigida. Longitud: 2545pb
Temperatura de Annealing
Temperatura de Annealing, Tanneal – temperatura a
la que los primers se unen al molde de ADN. Se
puede calcular a partir de Tm .
Ta Opt = 0.3 x (Tm de primer) + 0.7 x (Tm del
producto) - 25
Tm del primer: es la Tm del primer que tenga la más baja
Estructura Interna
Unión de primer con él mismo, o con el otro primer
antes que con el molde: disminuye eficiencia
Podría no ser tan importante si la temperatura de annealing no los
deja formarse. Algunos dímeros y horquillas se forman a 30°C.
Pareja de primers debe “calzar”
• Primers funcionan en parejas
• Se usan en la misma reacción de PCR: las
condiciones deben ser adecuadas para ambos
• Máxima diferencia entre temperaturas de
annealing debería ser 3°C
Especificidad del producto
Tanneal es el factor principal en determinar especificidad
del annealing y que se obtenga el producto deseado
• Tanneal : muy baja  menos específico  unión de
primers en otro lado  bandas
inespecíficas
muy alta  primers pueden no unirse
Estabilidad 3’ y 5’
Elongación de primer empieza en extremo 3’.
Mientras el extremo 3’ se una al molde, la elongación
empieza. 5’ menos importante
Problema: Si 3’ tiene 3 o más C/G, se puede unir
establemente a casi cualquier secuencia con tres C/G
Situación Ideal:
Extremo 5’ estable + extremo 3’menos estable, elimina
unión incorrecta debida a unión de sólo extremo 3’.
Preferiblemente: extremo 5’ con 1 o 2 bases G/C.
Extremo 3’ no tiene más de una base G/C.
Resumen criterios para diseño
1. Unión única
2. Longitud: 17-28 bases. Podría variar
3. Composición: contenido promedio de (G+C) alrededor 5060%; evitar secuencia larga de (A+T) y región rica en (G+C)
4. Optimizar apareamiento: estabilidad en extremo 5’ debe ser
alta y relativamente baja en 3’, para evitar unión equivocada
de los primers
5. Tm preferiblemente entre 55-65 °C
6. Primers en un “juego” con diferencia de t. de annealing entre
2-3°C
7. Minimizar estructura secundaria interna: horquillas y dímeros
se deben evitar
Diseño de primers con computadora
Mucho mejores resultados que a mano
Algunos programas:
- Primer3: MIT
http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi
-Oligo
-GCG
-BioTools
- Otros: GeneFisher, Primer!, Web Primer
Software para calcular Tm:
- BioMath: http://www.promega.com/biomath/calc11.htm
PCR Multiplex
• Varias parejas de primers en mismo tubo al hacer PCR
• Bueno para amplificar sitios múltiples
• Ej: microsatélites
• Dificultad de diseño
▫ Tm deberían ser parecidas
▫ Evitar dímeros
Primers universales
Basados en alineamiento de secuencias
Ejemplo:
todos los genes de una familia
el mismo gen en diferentes organismos
Estrategia
1. Alinear secuencias a amplificar.
2. Buscar regiones más conservadas en extremos 5’ y 3’.
3. Diseño de primer F en la región conservada 5’.
4. Diseño de primer R en la región conservada 3’.
5. Buscar la mejor pareja en cuanto a Tm etc
6. Asegurarse de amplificación única en todas secuencias
7. Asegurar que no amplifique posibles contaminantes
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